Name: Un ensayo biológico Volumen pequeños para evaluar bacteriana / fitoplancton Co-cultura Usando AGUA-Pulse-Amplitud Modulada (AGUA-PAM) Fluorometría (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprende a evaluar co-culturas de microalgas y bacterias mediante fluorometría WATER-PAM en placas de 48 pocillos. Este bioensayo miniaturizado permite detectar rápidamente efectos patogénicos, simbióticos o neutrales en la salud fotosintética.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (subvención 402105), la Fundación Canadiense para la Innovación (subvención 129087) y Alberta Education and Training (subvención AAETRCP-12-026-SEG) a RJC.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Crecimiento de las algas en un formato miniaturizado. La miniaturización de los cultivos de algas a un volumen de cultivo 1 ml en una placa de microtitulación permite la replicación dentro de un experimento para ser aumentado. Es importante asegurar la alga es saludable durante un experimento; realizar una curva de crecimiento (Figura 2), utilizando el formato de placa de microtitulación para evaluar diversos medios de algas, para asegurar que se cumplan los requerimientos nutr...

Fisiología fitoplancton tradicionalmente se ha estudiado en experimentos meso-escala que van desde 20 ml en matraces cónicos de 5 L en bombonas 1-7. Esta escala experimental requiere submuestreo para el seguimiento experimental, como sacrificar muestras repetidas para cada momento crea un montaje experimental inmanejable. La capacidad de aumentar el número de experimentos independientes, mientras que utilizando el mismo espacio de la incubadora diurna por miniaturizar el volumen experimental para experimentos de fisiología de algas ayuden a reducir o eliminar las limitaciones de submuestreo y pseudo-replicación de grandes volúmenes. Un formato de placa de microtitulación se ha desarrollado para bioensayos de algas utilizando un volumen de cultivo 1 ml para manipular experimentalmente algas en condiciones variables. Este pequeño volumen experimental permite el número de repeticiones que se incremente, aumenta la reproducibilidad experimental debido a una variabilidad disminuido entre muestras replicadas yexperimentos, y permite cierto replicación manteniendo controles experimentales (es decir, cultivos de algas axénicos) de 140 días (Figura 2) 12. Este formato de placa de microtitulación se adapta fácilmente para una variedad de preguntas experimentales, tales como: una bacteria no tiene una interacción simbiótica, neutral o patógena con su anfitrión de algas? Es la adición de un compuesto estimulante o tóxicas para un alga? Estas y otras cuestiones se pueden abordar en una rápida forma de alto rendimiento utilizando este nuevo formato 9-11. Una placa de cultivo de microtitulación de 48 pocillos permite que cada 1 ml bien para ser un montaje experimental independiente que se muestrea en un único punto de tiempo. Varios parámetros se pueden tomar de este volumen 1 ml incluyendo, pero no limitado a: fluorescencia de la clorofila y los parámetros fotoquímicos usando-Amplitud Modulada AGUA-Pulse (AGUA-PAM) fluorometría (ver Materiales y mesa Equipo) 13. Fluorometría AGUA-PAM es una técnica rápida y no invasiva que se puede utilizar para monitorear experimentos realizados con algas 13. Permite la medición de la eficiencia fotosintética y la salud PSII de un volumen de cultivo pequeño (150 a 300 l de cultivo diluido en medio a un 2 - volumen 4 ml de AGUA-PAM) 14,15. Además de fluorometría AGUA-PAM, esta configuración se puede utilizar para medir una variedad de otros parámetros incluyendo, pero no limitado a: la microscopía para visualizar las bacterias adheridas a las células de algas y los cambios en la morfología de células de algas; colonia de bacterias que forman el recuento (ufc) de la unidad; y citometría de flujo para el recuento de células de algas y subpoblaciones de identificación.

<table><tbody><tr><td>Incubadora diurna de 10 pies cúbicos (6012-1)</td><td>Caron Corporate</td><td>112310-6012-1-11</td><td><a href="http://www.caronproducts.com">www.caronproducts.com</a></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 25 cm2, Tapón de ventilación/cierre, 7 ml de volumen de trabajo, 200/cs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N156340</td><td><a href="http://www.fishersci.ca">www.fishersci.ca</a></td></tr><tr><td>Placas TC multipozo &ndash; 48 pocillos</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>353078</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/">www.bdbiosciences.com</a></td></tr><tr><td>P1000 Gilson The Pipetting Standard&mdash; Pipetman de Gilson</td><td>Mandel Scientific Company Inc.</td><td>GF-F123602</td><td><a href="http://www.mandel.ca">www.mandel.ca</a></td></tr><tr><td>P10mL Gilson El estándar de pipeteo&mdash; Pipetman de Gilson</td><td>Mandel Scientific Company Inc.</td><td>GF-F161201</td><td><a href="http://www.mandel.ca">www.mandel.ca</a></td></tr><tr><td>Puntas de orificio anchas no estériles [100&ndash; 1.250 y micro; l]</td><td>VWR International</td><td>89079-468</td><td><a href="http://www.ca.vwr.com">www.ca.vwr.com</a></td></tr><tr><td>Puntas ultrafinas no estériles [100&ndash; 1.250 y micro; l]</td><td>VWR International</td><td>89079-470</td><td><a href="http://www.ca.vwr.com">www.ca.vwr.com</a></td></tr><tr><td>Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml]</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9402151</td><td><a href="http://www.fishersci.ca">www.fishersci.ca</a></td></tr><tr><td>WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED)</td><td>Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Alemania</td><td>EDEE0232</td><td><a href="http://www.walz.com">www.walz.com</a></td></tr><tr><td>Cubeta de vidrio de cuarzo de 15 mm de diámetro (WATER-K)</td><td>Caron Corporate</td><td></td><td><a href="http://www.caronproducts.com">www.caronproducts.com</a></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (cristalino/certificado ACS), Fisher Chemical</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td><a href="http://www.fishersci.ca"> www.fishersci.ca</a></td></tr><tr><td>BD Difco Marine Broth 2216</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com</a></td></tr><tr><td>BD Bacto Agar</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com</a></td></tr><tr><td>Kit mediano L1, 50 L</td><td>NCMA [Centro Nacional de Algas Marinas y Microbiota</td><td>NCMA [Centro Nacional de Algas Marinas y Microbiota</td><td><a href="http://www.ncma.bigelow.org">www.ncma.bigelow.org</a></td></tr></tbody></table>

un ensayo biológico volumen pequeños para evaluar bacteriana / fitoplancton co-cultura usando agua-pulse-amplitud modulada (agua-pam) fluorometría

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

Los métodos convencionales para la manipulación experimental de microalgas han empleado grandes volúmenes de cultivo (20 ml a 5 L), de manera que el cultivo puede dividirse en submuestras durante todo el experimento 1-7. El submuestreo de grandes volúmenes puede ser problemático por varias razones: 1) que causa la variación en el volumen total y el área superficial: relación de volumen de la cultura durante el experimento; 2) pseudo-replicación (es decir, muestras repetidas de un mismo frasco de tratamiento 8) a menudo se emplea en lugar de repeticiones verdaderas (es decir, el muestreo de los tratamientos replicados); 3) la duración del experimento es limitada por el volumen total; y 4) los cultivos axénicos o la microbiota bacteriana habitual son difíciles de mantener durante los experimentos a largo plazo ya que la contaminación ocurre comúnmente durante el submuestreo. El uso de placas de microtitulación permite volúmenes de cultivo 1 ml de ser utilizados para cada replicar, con hasta 48 tratamientos separados dentro deuna placa de 12,65 cm x 8,5 x 2,2, disminuyendo de ese modo el volumen experimental y permitiendo la replicación extensa sin submuestreo cualquier tratamiento. Además, esta técnica puede ser modificada para adaptarse a una variedad de formatos experimentales, incluyendo: bacteriana-co-cultivos de algas, pruebas de fisiología de algas, y la toxina de detección 9-11. Pozos individuales con un alga, bacteria y / o co-cultivos pueden ser degustados por numerosos procedimientos de laboratorio, incluyendo, pero no limitado a: AGUA-Pulse-Amplitud Modulada (AGUA-PAM) fluorometría, microscopía, unidad de colonia de bacterias (UFC) condes y citometría de flujo. La combinación del formato de placa de microtitulación y agua-PAM fluorometría permite múltiples mediciones rápidas de rendimiento fotoquímico y otros parámetros fotoquímicos con baja variabilidad entre las muestras, alta reproducibilidad y evita las muchas trampas de submuestreo una bombona o matraz cónico en el transcurso de un experimento .

Lecturas de fluorometría AGUA-PAM. AGUA-Pulse-Amplitud Modulada (PAM) fluorometrıa es un método rápido y eficiente para determinar la fluorescencia (un proxy para el contenido de clorofila) y el rendimiento fotosintético (salud PSII) de cultivos de algas. El software PAM WinControl genera una hoja de cálculo de valores de datos en bruto para (los siguientes son los parámetros básicos para la adaptación a la oscuridad muestras de algas): F = 0 fluorescenci...

El objetivo de este procedimiento es demostrar la reproducibilidad y adaptabilidad del uso de un formato de placa de microtitulación para el cribado de microalgas. Este cribado rápido combina la fluorometría WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) para medir el rendimiento fotosintético como indicador de la salud del Fotosistema II (PSII) con cocultivos de bacterias y algas de pequeño volumen.

Un ensayo biológico Volumen pequeños para evaluar bacteriana / fitoplancton Co-cultura Usando AGUA-Pulse-Amplitud Modulada (AGUA-PAM) Fluorometría

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en presentar un bioensayo algal miniaturizado destinado a analizar rápidamente cultivos algales para identificar simbiontes microbianos o patógenos que puedan influir en la salud o fisiología del cultivo algal. Esto se logra primero mediante la preparación de mezclas control de algas y bacterias con medio, y luego la elaboración de cultivos mixtos experimentales de algas y bacterias en diversas concentraciones. El siguiente paso es preparar placas de 48 pocillos con alícuotas de las mezclas para realizar un análisis rápido, robusto y reproducible.A continuación, las placas se incuban y se monitorean mediante fluorometría de amplitud modulada en pulso, que toma mediciones que permiten inferir el estado fotosintético del sistema. Los resultados de este experimento de curso temporal revelan un efecto patógeno, simbiótico o neutro de las bacterias sobre las algas. También se pueden aplicar cribados adicionales de pequeño volumen durante el experimento de curso temporal.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos convencionales que utilizan grandes volúmenes para bioensayos con algas es que el bioensayo miniaturizado p

a-small-volume-bioassay-to-assess-bacterialphytoplankton-co-culture

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Este documento describe los diferentes métodos de...

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

El ensayo describe un método rápido para medir la formación de biopelículas a principios de bacterias y hongos. Este método utiliza una placa de microtitulación como sustrato para la formación de biopelículas microbianas, y el biofilm se visualiza utilizando la cepa de cristal violeta. El ensayo ofrece ya sea un ensayo cualitativo o cuantitativo de la formación de biofilm temprano.

Plato de microtitulación de formación de biopelículas de ensayo

Fuente: Weber, N. et. al., Transformación natural, expresión de proteínas y crioconservación de la cianobacteria filamentosa Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra un ensayo basado en LED enfocado para estudiar la fototaxis en cianobacterias filamentosas. Las bacterias migran hacia la fuente de luz, formando una densa acumulación en el centro iluminado, que se visualiza y cuantifica mediante el análisis de intensidad de píxeles de la imagen capturada.

Ensayo de fototaxis de cianobacterias filamentosas utilizando iluminación de luz focalizada

Este video muestra un ensayo para el cribado de compuestos antimicrobianos que eliminan eficientemente las biopelículas utilizando una placa de clavija. La metodología monitoriza el estado metabólico del biofilm tras el tratamiento con compuestos antimicrobianos, facilitando la determinación de la concentración mínima de erradicación del biofilm.

Un ensayo de biopelícula de placa de clavija para el cribado de agentes antibacterianos

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