Investigando individual molécula de adhesión por espectroscopia de fuerza atómica

El objetivo general de este procedimiento es acoplar un solo polímero a una punta en voladizo A FM para realizar cuatro experimentos espectroscópicos de desorción de superficie con una molécula en la misma molécula varias veces. Esto se logra activando primero el plasma la superficie de la punta para formar grupos hidroxilo como segundo paso. La punta en voladizo está amino aislada por una solución de prueba ascendente, que forma grupos amino en la superficie de la punta.

El tercer paso es acoplar las moléculas de polietilenglicol a los grupos amino. Evitan interacciones inespecíficas entre la punta y el sustrato y sirven como moléculas enlazadoras para los polímeros. Finalmente, los polímeros se conjugan con las moléculas de polietilenglicol para formar una sonda.

Las mediciones sugieren que este procedimiento permite utilizar una misma sonda de fuerza de polímero para un conjunto experimental completo, o del mismo modo, muchos cientos de curvas de fuerza-distancia. Las principales ventajas de los experimentos de una sola molécula sobre los métodos de conjunto es que se pueden estudiar confirmaciones raras y estados poco frecuentes, que de otro modo estarían ocultos en el promedio de conjuntos. Debido a su pequeño tamaño, estos experimentos pueden compararse directamente con las simulaciones dinámicas moleculares.

El primer paso es unir covalentemente las moléculas de la sonda a la punta del voladizo. Comience con nitruro de silicio fresco. Las virutas en voladizo, emplean virutas con una constante de resorte de 10 a 100 picos newtons por nanómetro.

Use pinzas para colocarlos en un portaobjetos de vidrio limpio o en una placa de Petri. A continuación, coloque el portaobjetos con los chips en una cámara de plasma de 100 vatios después de evacuar la cámara y lavarla con oxígeno operado a 0,25 milibares y 20 vatios durante 15 minutos. En los siguientes pasos, use una capucha para evitar la inhalación de vapores orgánicos durante el procesamiento del plasma.

Prepare la sila amino de los voladizos en una placa de Petri de vidrio, colocando 2,5 mililitros de solución de prueba ascendente. Además, repare un recipiente que contenga acetona. Recupere los voladizos inmediatamente después de que se complete el procesamiento del plasma.

Proceda a sumergir cada voladizo en acetona durante un segundo y luego colóquelo en la solución Optus. Incube los voladizos durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de continuar. A medida que los voladizos incuban, comience la preparación para la pegilación a fin de minimizar los efectos del agua y el aire en los componentes.

Comience con tubos de eph previamente preparados, uno que contiene m peg, NHS y el otro tinte. Clavija del NHS. Determine el peso del contenido de cada tubo.

A continuación, trabaje con el tubo que contiene EG NHS y prepárese para agregar cloroformo. Vierta el cloroformo para lograr una concentración final de 25 milimolares y una solución suficiente para cubrir los voladizos en los pasos siguientes. Coloque el tubo en un mezclador de vórtice para asegurarse de que el polvo se disuelva.

Coloque el tubo con el EG NHS a un lado para que funcione con la dieta. Paridad del NHS. Añade un cloroformo para que alcance una concentración final de 0,25 milimolares.

Use un mezclador de vórtice para asegurarse de que el polvo se disuelva. A continuación, mezcle las soluciones para ajustar la proporción entre las moléculas de la dieta NHS y las moléculas de metilo del NHS. Esta proporción suele ser de uno a 500.

Obtenga una pequeña placa de Petri de vidrio con tapa para limitar la evaporación y llénela con la mezcla como los voladizos. Terminar la incubación. En la solución de prueba APT, tenga dos recipientes con aproximadamente 10 mililitros de acetona y uno con cloroformo listos para enjuagarlos.

Sumerja cada uno de ellos en la acetona dos veces y una vez en cloroformo y colóquelos en la solución de polietilenglicol. Cubra el plato y mantenga los voladizos en la solución. Durante una hora, prepárese para el acoplamiento covalente de una molécula de sonda, en este caso poli aminoácido poli de tirosina.

Comience con el volumen de un molar de hidróxido de sodio que se disuelva en esta molécula de sonda a una concentración de un miligramo por mililitro. Para la tirosina poli D, intercambie hidróxido de sodio por un diámetro de sodio de ocho a 8.5 pH. Ocho búferes inmediatamente antes de la funcionalización.

A medida que los voladizos completan su incubación en una solución de polietilenglicol, prepare tres recipientes para enjuagarlos y un recipiente con el orificio de politirosina. La solución tampón de ocho para enjuague es cinco mililitros de cloroformo, cinco mililitros de etanol, cinco mililitros de tampón de perforación. Utilice unos 300 microlitros de la solución tampón de politirosina perforada.

Recupere los voladizos y sumerja cada uno primero en cloroformo, luego el etanol y luego el tampón de ocho perforaciones. Antes de colocarlos en la politirosina se llevaron ocho soluciones tampón. Deje que las virutas en voladizo se incuben durante una hora después de una hora de listas, unos cinco mililitros de tampón bate en un recipiente, y cinco mililitros de agua ultrapura en otro para enjuagar los voladizos también tienen 20 mililitros de agua ultrapura para almacenarlos.

Coge los voladizos y sumerge cada uno en tampón Boite, seguido de agua ultrapura para enjuagar. Luego sumérjalo en agua ultrapura para almacenarlo. Los voladizos ahora se pueden utilizar para la adquisición de datos.

Una vez que la punta A FM esté funcionalizada y se haya preparado y montado una superficie, comience los pasos para una adquisición de datos FM. En primer lugar, coloque el voladizo funcionalizado en un soporte de voladizo A FM que sea adecuado para medir en líquidos. A continuación, conecte el soporte en voladizo al cabezal A FM.

Proceda vertiendo agua en la celda de fluido para sumergir el voladizo y la superficie. A continuación, baje el cabezal A FM sobre la célula líquida. Deje que el sistema se equilibre durante al menos media hora.

Después del equilibrio e. Coloque el voladizo lejos de la superficie, luego registre los espectros de ruido térmico Se requieren 10 o más espectros para obtener una relación señal/ruido suficiente para excluir los efectos de amortiguación de la superficie. A continuación, acérquese con cuidado a la superficie para realizar una medición de la sensibilidad inversa de la palanca óptica

Esto implica empujar la punta del voladizo contra una superficie dura para registrar la fuerza frente a la distancia de recorrido del pizo. Mida la pendiente durante el contacto e inviértala para determinar la sensibilidad inversa de la palanca óptica. A continuación, la sensibilidad de la palanca óptica inversa y los espectros de ruido térmico Determine la constante de resorte del voladizo ajustando un oscilador armónico al espectro de ruido térmico.

Ahora establezca los parámetros apropiados para la recopilación de datos. Registre numerosas curvas de distancia forzada para cada condición experimental al final de la recopilación de datos. Determine la sensibilidad y la constante del resorte nuevamente, para verificar la consistencia y estabilidad del sistema.

Este ejemplo de un trazado de distancia forzada en rojo proviene de la retracción de politirosina de una monocapa de metilo autoensamblada con agua impura. La caída de un solo paso a la fuerza cero indica el desprendimiento de una sola molécula. El ajuste sigmoidal se muestra en negro.

La longitud de la meseta extraída y la fuerza de la meseta se indican con flechas. La velocidad de retracción de extensión del voladizo fue de 0,5 micras por segundo y el tiempo de permanencia en la superficie fue de un segundo. Diferentes ambientes líquidos para la medición causaron cambios en la fuerza de la meseta extraída.

Estos histogramas reflejan la fuerza de meseta extraída para mediciones en agua pura y mediciones en agua. Mezclas de etanol Se registraron al menos 300 trazas de distancia de fuerza para cada solución con una en el mismo polímero. Aquí se muestran histogramas análogos para la longitud de la meseta extraída en agua pura y en mezclas de etanol en agua.

La adición de etanol debilita la interacción hidrofóbica entre la politirosina y la superficie, lo que conduce a una menor fuerza de meseta y una disminución en la longitud de la meseta. Esto se resume en esta placa de la longitud máxima de la meseta frente a la fuerza máxima de la meseta. Una vez dominado, el protocolo de funcionalización se puede realizar en unas cuatro horas después del desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la física y la química exploraran la adhesión de la infracción de polímeros en las interfaces.