Generación de murino cardíaca marcapasos celulares Agregados Basado en ES-Cell-Programación en combinación con MYH6-promotor-Selección

El objetivo general de este procedimiento es generar células nodales sinusales de alta pureza. Esto se logra induciendo primero la diferenciación celular modificando el medio y haciendo gotas colgantes que dan como resultado la formación de cuerpos embrionarios de un tamaño definido. A continuación, los cuerpos embrionarios se asientan en un plato recubierto de gelatina para que formen una capa de células.

Luego se inicia la selección de antibióticos y solo sobreviven los cardiomiocitos. Finalmente, la capa celular se disocia para obtener células nodales de seno único de latido rápido o cuerpos ganglionares de seno pequeño. En última instancia, las imágenes de células vivas se utilizan para mostrar altas frecuencias de latido de las células ganglionares sinusales.

La principal ventaja de este método es que se pueden producir células nodales sinusales de alta pureza, por ejemplo, para pruebas de drogas. El método puede ayudarnos a responder preguntas clave en la enfermedad de los ganglios sinusales porque las células nos darán información sobre los mecanismos subyacentes. La tecnología será presentada en el laboratorio por Julia Yung, nuestra estudiante de doctorado que desarrolló el método, comenzando con una línea celular ES y células madre pluripotentes cocultivadas con células alimentadoras irradiadas como se describe en el protocolo de texto dos días antes del procedimiento de diferenciación que eliminó las PSC de las células alimentadoras aspirando primero el medio.

Use 10 mililitros de PBS para lavar las células. A continuación, añadir siete mililitros de solución de colagenasa cuatro e incubar las células durante 10 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, coloque un filtro estéril de 40 micrómetros en un tubo de 50 mililitros.

A continuación, enjuague cuidadosamente las colonias de PSC pipeteando la solución de colagenasa hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Transfiera la suspensión celular al filtro y use ocho mililitros de PBS para enjuagar el filtro tres veces. A continuación, dé la vuelta al filtro y colóquelo boca abajo en una placa de Petri y pipetee 10 mililitros de PBS en la parte inferior del filtro.

Para eliminar las colonias de PSC, ahora transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugue durante cinco minutos a 300 veces. G.Retirar el PBS, suspender las células en un mililitro de Accutane e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, agregue 10 mililitros de PBS.

Mezcle la solución celular pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces y centrifugue durante cinco minutos a 300 veces G. Una vez que se haya eliminado el PBS, use 10 mililitros de medio de cultivo celular para resuspender las células y determinar el número de células semilla. 15, 000 células por centímetro cuadrado en un matraz de filtro de 75 centímetros cuadrados y cultivarlas durante dos días a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono cuando el matraz debe ser 50 hasta un 70%confluente. Después de recolectar las células y suspenderlas en un medio de diferenciación según el protocolo de texto, pipetee 20 mililitros de agua y cinco mililitros de gota colgante o solución de HD en una placa de Petri cuadrática para evitar que se sequen las HDS.

A continuación, pipetee hasta 50 mililitros de suspensión celular en una bandeja. A continuación, dé la vuelta a la tapa de la placa de Petri y, con una pipeta de 12 canales, coloque 180 HDS, cada uno de los cuales contiene 20 microlitros de suspensión celular en la tapa. Dale la vuelta a la tapa con cuidado y colócala en la placa de Petri.

Después de incubar durante dos días para dejar que las células formen ebs, voltee con cuidado la tapa de la placa de Petri cuadrática y transfiera el EBS derivado de dos placas de Petri a un tubo de 50 mililitros. Espere 10 minutos para que el EBS se asiente en el fondo del tubo, luego aspire la mayor cantidad de medio posible. Utilice 10 mililitros de medio de diferenciación para suspender el EBS y transferir la suspensión a una placa de Petri de 10 centímetros.

Una vez que las células se hayan cultivado en suspensión durante cuatro días, de acuerdo con el protocolo de texto, transfiera el EBS a una placa de cultivo celular de 10 centímetros cuadrados recubierta de gelatina e incube durante los próximos dos a seis días bajo un microscopio, verifique las células para ver si hay focos de batido y la formación de una capa celular tres días después de que las células hayan comenzado a latir, Aspirar el medio y añadir 10 mililitros de diferenciación fresca. Medio que contenía 400 microgramos por mililitro de G 4 18 a las células cuatro días después. Retire con cuidado el medio sin aspirar la capa de células.

Luego agregue 10 mililitros de PBS para lavar las células. Después de retirar cuidadosamente el PBS, agregue 10 mililitros de solución de colagenasa cuatro y transfiera las células a un tubo de 50 mililitros. A continuación, después de incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos, mezcle vigorosamente la suspensión pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces e incube las células a 37 grados centígrados durante cinco minutos más.

Debe haber una suspensión de pequeños grupos. Luego agregue 20 mililitros de PBS y centrifugue durante 10 minutos a 300 veces. G, aspire cuidadosamente el PBS y si genera cuerpos auriculares inducidos o sabs, use 12 mililitros de medio de diferenciación que contenga 400 microgramos por mililitro de G 4 18 para Resus, suspenda las células y vea dos mililitros cada una en seis pocillos de una placa recubierta de gelatina de 24 pocillos para generar células nodales individuales en lugar de agregar medio de diferenciación.

Después de retirar el PBS, use cinco mililitros de Accutane para suspender las células e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta vigorosamente. Mezclar la suspensión después de incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos.

Añadir 20 mililitros de PBS y centrifugar durante cinco minutos a 300 veces G con 12 mililitros de diferenciación. Medio que contiene G cuatro 18. Suspenda las células y vea dos mililitros cada una en seis pocillos de un cultivo en placa recubierta de gelatina de 24 pocillos y realice el análisis de las células de acuerdo con el protocolo de texto.

Usando el protocolo demostrado en este video, se puede generar isab S a partir de células madre pluripotentes con una frecuencia de latido de aproximadamente 450 latidos por minuto, como se ve aquí después de la disociación de isab S. Las células individuales observadas muestran las formas típicas de las células del nódulo sinusal que incluye células fusiformes y arañas. Estas células muestran altos niveles de expresión de proteínas esenciales para la función del nódulo sinusal, como la hiperpolarización activada por catión activado por nucleótidos cíclicos. Canal cuatro, HCN cuatro, conexión cuatro, conexión cinco, conexión 30.2 y MYH seis.

Cuando se tratan con el bloqueador de canales ZD 7 2 88, o el agonista del receptor muscarínico caracol, las células derivadas de isab exhiben una frecuencia de latido significativamente reducida. El agonista del receptor suprarrenal beta isopreno, por otro lado, conduce a una frecuencia de latido elevada. En general, nuestra técnica allanará el camino para comprender mejor la funcionalidad y las enfermedades de los marcapasos cardíacos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar células nodales sinusales completamente funcionales a partir de potentes células madre PLU.