Name: Examen de Rapid dopamina Dinámica con Fast Scan voltametría cíclica Durante intraoral Administración saborizante en ratas Awake (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a medir respuestas rápidas de dopamina a estímulos gustativos intraorales en ratas despiertas mediante voltametría cíclica de barrido rápido. Este método permite registrar la liberación de dopamina en el núcleo accumbens con alta resolución temporal.

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La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por una Beca de Investigación de Posgrado (RJW) de la NSF y por el Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas de los Institutos Nacionales de Salud y el Centro de Productos de Tabaco (CTP) de la FDA bajo el Premio Número P50DA036151(EJN y NAA). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.

<ol><li>Roitman, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+operates+as+a+subsecond+modulator+of+food+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking.</a> J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).</li>
<li>Aragona, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specificity+in+the+real-time+development+of+phasic+dopamine+transmission+patterns+during+acquisition+of+a+cue-cocaine+association+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats.</a> European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).</li>
<li>Wheeler, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+cues+drive+opposing+context-dependent+shifts+in+reward+processing+and+emotional+state%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state.</a> Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).</li>
<li>Wickham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+studying+phasic+dopamine+signaling+in+brain+reward+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Elite+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms.</a> Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).</li>
<li>Roitman, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+chemical+responses+in+the+nucleus+accumbens+differentiate+rewarding+and+aversive+stimuli%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli).</a> Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).</li>
<li>Cheer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasic+dopamine+release+evoked+by+abused+substances+requires+cannabinoid+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation.</a> J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).</li>
<li>Owesson-White, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+encoding+of+cocaine-seeking+behavior+is+coincident+with+phasic+dopamine+release+in+the+accumbens+core+and+shell%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell.</a> Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).</li>
<li>Phillips, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsecond+dopamine+release+promotes+cocaine+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking.</a> Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levels+of+mint+and+wintergreen+flavorants%3A+smokeless+tobacco+products+vs.+confectionery+products%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products.</a> Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).</li>
<li>Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavoured+cigarettes%2C+sensation+seeking+and+adolescents%27+perceptions+of+cigarette+brands%5BTitle%5D)+AND+%22Tob+Control%22%5BJournal%5D)">Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands.</a> Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).</li>
<li>Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+characterization+of+dissolvable+tobacco+products+promoted+to+reduce+harm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm.</a> J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).</li>
<li>Phillips, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+phasic+changes+in+extracellular+dopamine+concentration+in+freely+moving+rats+by+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry.</a> Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).</li>
<li>Robinson, D. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobinson%2C+DL+%22Rapid+Dopamine+Release+in+Freely+Moving+Rats.+Electrochemical+Methods+for+Neuroscience%22">Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).</li>
<li>Montague, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gain+control+of+dopamine+delivery+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals.</a> J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).</li>
<li>Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+neurotransmitters+detected+by+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry.</a> Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).</li>
<li>Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+concentration+determination+using+principal+component+regression+with+residual+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis.</a> Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).</li>
<li>Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rank+estimation+and+the+multivariate+analysis+of+in+vivo+fast-scan+cyclic+voltammetric+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data.</a> Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).</li>
<li>Rising, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+Young+Adults%3A+description+and+use+of+an+innovative+health+insurance+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Adolesc+Health%22%5BJournal%5D)">Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program.</a> J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).</li>
<li>Day, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+learning+mediates+dynamic+shifts+in+dopamine+signaling+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens.</a> Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholamines+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+reciprocally+respond+to+reward+and+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion.</a> Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).</li>
<li>Wheeler, R. A., Carelli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroscience+of+pleasure.+Focus+on+%27Ventral+pallidum+firing+codes+hedonic+reward%3A+when+a+bad+taste+turns+good%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good.</a> J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).</li>
<li>Bunin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+and+uptake+rates+of+5-hydroxytryptamine+in+the+dorsal+raphe+and+substantia+nigra+reticulata+of+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain.</a> J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).</li>
<li>Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+electrochemical+measurements+of+oxygen+and+dopamine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo.</a> Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).</li>
<li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+evaluating+the+reinforcing+properties+of+tastants+in+laboratory+rats%3A+operant+intraoral+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration.</a> J Vis Exp. (84), e50956(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Entrega saborizante intraoral combinada con FSCV permite el análisis del &quot;tiempo real&quot; respuestas DA a saborizantes orales. Hay tres pasos críticos en el protocolo que se requieren para mediciones exitosas DA. En primer lugar, la implantación adecuada del catéter oral es crítico para la entrega de saborizantes. Asegurarse de que el catéter se inserta detrás de la primera molar y encajada en su lugar evita que el catéter de la pérdida de permeabilidad y evita la extracción accidental por el animal. Lavado del c...

Erratum: Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

La liberación de DA fásico juega un papel importante en la mediación del comportamiento dirigido a la recompensa [1-3]. Sin embargo, aislar y estudiar cómo una recompensa primaria altera la liberación fásica de DA a menudo se complica por procesos conductuales o cognitivos concurrentes que también son capaces de alterar la liberación fásica de DA, como los procesos de toma de decisiones o el comportamiento motor dirigido a la recompensa para adquirir la recompensa. En el trabajo actual, aislamos las respuestas fásicas de DA a los tasantes mediante el uso de voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV) in vivo combinada con la administración de catantes a través de cánulas intraorales. Esta técnica evita la elección y la acción y nos permite examinar la liberación extracelular de DA durante la infusión directa de un sabor en el paladar de una rata.
FSCV es una técnica electroquímica con alta resolución temporal y espacial, que permite mediciones de la liberación de DA en un área local discreta (aproximadamente 100 μm) en una escala de menos de un segundo (resolución de 10 Hz). La combinación de la administración intraoral y FSCV proporciona la ventaja de observar respuestas rápidas y "en tiempo real" de DA a un catante, que no se puede examinar con los métodos convencionales de microdiálisis. Además, la liberación fásica de DA en respuesta a las recompensas o a las señales asociadas a la recompensa se produce a concentraciones entre 20-100 nM, que está por encima del umbral de detección de 10-20 nM para FSCV [4]. La alta resolución espacial de FSCV también permite el registro de subregiones de pequeñas áreas cerebrales, como el núcleo accumbens (NAc). Por lo tanto, FSCV combinado con infusiones intraorales de saborizantes es un modelo ideal para estudiar cómo los saborizantes u otros estímulos alteran la liberación fásica de DA en animales despiertos que se comportan. De hecho, estas técnicas han permitido experimentos que investigan cómo los sabores gratificantes y aversivos alteran la liberación de DA extracelular [5]. 
Durante la última década, los análisis de FSCV se han combinado con éxito con los paradigmas de administración intravenosa de fármacos [6] y de autoadministración en ratas [7, 8] para identificar el papel de los mecanismos de DA fásica en modelos de adicción a las drogas. Además, la administración intraoral combinada con FSCV se ha utilizado para examinar cómo las señales de sabor junto con la disponibilidad de cocaína modulan la liberación fásica de DA y las respuestas conductuales que reflejan el afecto emocional [3]. Esta metodología combinada intraoral y FSCV también se puede utilizar poderosamente para examinar las respuestas fásicas de DA a saborizantes, como el mentol y los edulcorantes orales, que se agregan a los cigarrillos y productos de tabaco solubles [9-11]. Aunque muchos de los saborizantes añadidos a los productos de tabaco son apetitivos [9-11], se desconoce si estos saborizantes aumentan la liberación fásica de DA de una manera consistente con una valencia hedónica gratificante. De hecho, los aromatizantes añadidos a los cigarrillos y a los productos de tabaco solubles pueden tener efectos directos en el sistema de recompensa de DA y pueden actuar a través de mecanismos dopaminérgicos para influir en la valencia gratificante de los cigarrillos y otros productos de tabaco. Por lo tanto, la administración intraoral combinada con FSCV puede proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo los saborizantes modulan la liberación rápida de DA. El uso de la metodología combinada de FSCV intraoral e in vivo, y los datos obtenidos de dichos estudios, también pueden facilitar futuros estudios para determinar cómo interactúan los saborizantes y la nicotina para alterar la señalización de DA y modular potencialmente el refuerzo de nicotina. Además, los datos obtenidos de dichos estudios se pueden utilizar para informar las decisiones regulatorias sobre los saborizantes de productos de tabaco.

<table><tbody><tr><td>Electrodo estimulante</td><td>PlasticsOne</td><td>MS303/2-A/SPC</td><td>al pedirlo, solicite un corte de 22 mm por debajo del pedestal</td></tr><tr><td>Cánula para electrodo</td><td>BioAnalytical Systems</td><td>MD-2251</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio</td><td>A-M systems</td><td>624503</td><td></td></tr><tr><td>Fibra de carbono</td><td>Thornel</td><td>T650</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de electrodos</td><td>Narishige International</td><td>PE-22</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/neurolog-system/" target="_blank"&gt;Aislador de estímulo Neurolog&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://digitimer.com" target="_blank"&gt;Digitimer Ltd.&lt;/a&gt;</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds4-bi-phasic-stimulus-isolator/" target="_blank"&gt;DS4&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Encogimiento por calor</td><td>3M</td><td>FP-301</td><td></td></tr><tr><td>Cables aislados para electrodos</td><td>Squires electronics</td><td>Personalizado</td><td>L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Univ. de Illinois en Chicago, Taller de Máquinas de Ingeniería</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epoxi</td><td>ITW Devcon</td><td>14250</td><td>"epoxi de 5 minutos"</td></tr><tr><td>Copolímero de perfluoro-3,6-dioxo-4-metil-7-octeno-sulfónico y tetrafluoroetileno</td><td>Ion Power</td><td>LQ-1105</td><td>&lt;em&gt;es decir,&lt;/em&gt; Nafion</td></tr><tr><td>Pintura de plata</td><td>GC Electronics</td><td>22-023</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>BK Precision</td><td>9110</td><td></td></tr><tr><td>Tubo para catéteres intraorales</td><td>Intramedic</td><td>427426</td><td>PE 100, D.I. = 0,86 mm; D.E. = 1,52 mm</td></tr><tr><td>Tubo para infusión intraoral</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-587-1A</td><td>D.I. 1/32"; D.E. 3/32"</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa para celda de flujo</td><td>Pump Systems Inc.</td><td>NE 1000</td><td></td></tr><tr><td>Cemento quirúrgico</td><td>Dentsply Caulk</td><td>675571 y 675572</td><td></td></tr><tr><td>Actuador neumático</td><td>VICI</td><td>A60</td><td>Interfaz de válvula digital de 6 posiciones</td></tr><tr><td>Interfaz de válvula digital</td><td>VICI</td><td>DVI</td><td>230 VAC</td></tr><tr><td>Cabezal cuádruple</td><td>Univ. de Carolina del Norte, Instalación de Electrónica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación UEI</td><td>Univ. de Carolina del Norte, Instalación de Electrónica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caja de interfaz UEI</td><td>Univ. de Carolina del Norte, Instalación de Electrónica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación para la bomba de jeringa de sustancias sapidas</td><td>Med Associates</td><td>SG-504</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa para sustancias sapidas</td><td>Med Associates</td><td>PHM-107</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrodo de tungsteno</td><td>MicroProbes</td><td>WE30030.5A3</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de plata con AgCl como referencia</td><td>InVivo Metric</td><td>E255A</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>80497</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Ácido perclórico</td><td>Sigma</td><td>244252</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (4 M)</td><td>Sigma</td><td>54435</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>306576</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de dopamina</td><td>Sigma</td><td>H8502</td><td></td></tr><tr><td>Software TarHeel HDCV</td><td>Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.chem.unc.edu/facilities/index.html?display=electronics&amp;amp;content=software&amp;amp;software_id=2" target="_blank"&gt;Debe solicitar el software: haga clic aquí para acceder a la página de solicitud&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

examen de rapid dopamina dinámica con fast scan voltametría cíclica durante intraoral administración saborizante en ratas awake

Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

La liberación rápida y fásica de dopamina (DA) en el cerebro de los mamíferos desempeña un papel fundamental en el procesamiento de recompensas, el aprendizaje por refuerzo y el control motivacional. La voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV) es una técnica electroquímica con alta resolución espacial y temporal (sub-segundo) que se ha utilizado para examinar la liberación fásica de DA en varios tipos de preparaciones. Se han utilizado experimentos in vitro en células individuales y cortes de cerebro, y experimentos in vivo en roedores anestesiados para identificar los mecanismos que median la liberación y absorción de dopamina en condiciones normales y en modelos de enfermedad. En los últimos 20 años, los experimentos in vivo con FSCV en roedores despiertos que se mueven libremente también han proporcionado información sobre los mecanismos dopaminérgicos en el procesamiento de la recompensa y el aprendizaje de la recompensa. Una de las principales ventajas de la preparación despierta y que se mueve libremente es la capacidad de examinar las fluctuaciones rápidas de DA que están bloqueadas en el tiempo por eventos conductuales específicos o para recompensar o indicar la presentación. Sin embargo, una limitación de los experimentos combinados de comportamiento y voltamperometría es la dificultad de disociar los efectos del DA que son específicos de los estímulos primarios gratificantes o aversivos de las fluctuaciones concurrentes del DA que median las conductas motoras dirigidas a la recompensa u otras conductas motoras. Aquí, describimos un método combinado que utiliza FSCV in vivo e infusión intraoral en una rata despierta para investigar directamente las respuestas de DA a los sabores orales. En estos experimentos, los saborizantes orales se infunden directamente en el paladar de la rata, evitando el comportamiento dirigido a la recompensa y el comportamiento voluntario de bebida, lo que permite un examen directo de las respuestas de DA a los estímulos gustativos.

FSCV combinada con la implantación del catéter intraoral se utilizó para examinar cómo sacarosa, un saborizante apetitiva, modula fásica la liberación de DA en el núcleo NAc. Antes de la infusión saborizante, la estimulación eléctrica (150 mu, 60 Hz, 24 pulsos, indicada por la barra roja) de la VTA produce aumentos sólidos en fásica liberación de DA en el NAc (Figura 1) Figura 1 muestra un gráfico de color con potencial sobre. el eje y, el tiempo en el eje x, y la corriente (representado como falso colo...

Las rápidas fluctuaciones en la dopamina extracelular (DA) median tanto el procesamiento de la recompensa como el comportamiento motivado en los mamíferos. Este manuscrito describe el uso combinado de voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV) y la administración intraoral de saborizantes para determinar cómo los saborizantes alteran la liberación rápida de dopamina en ratas despiertas que se mueven libremente.

Examen de Rapid dopamina Dinámica con Fast Scan voltametría cíclica Durante intraoral Administración saborizante en ratas Awake

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. ...

El objetivo general de este procedimiento es medir las respuestas de dopamina en subsegundos frente a sabores orales intensos. Esto se logra primero creando catéteres orales, electrodos de referencia y electrodos de fibra de carbono necesarios para las intervenciones quirúrgicas y la posterior grabación mediante voltametría cíclica rápida por telemetría. El segundo paso consiste en implantar quirúrgicamente los catéteres orales, el electrodo intracraneal y la cánula guía para el electrodo de fibra de carbono.Una semana después, se puede introducir el microelectrodo de fibra de carbono en el núcleo accumbens para registrar los cambios en la liberación extracelular de dopamina en respuesta a la administración intraoral de sabores. El paso final después de la grabación consiste en calibrar el electrodo y utilizar el análisis de componentes principales para aislar los datos que contienen información sobre la dopamina. En última instancia, el uso combinado de la administración intraoral de sabores y la voltametría cíclica de barrido rápido se emplea para mostrar los cambios en las respuestas de dopamina de subsegundo frente al sabor.Existen dos ventajas principales de esta técnica combinada frente a los métodos existentes. Primero, la fotometría de IC rápida tiene una alta resolución temporal, y segundo, la administración intraoral de taten minimiza el movimiento que la rata necesita realizar para obtener el tatin y nos permite aislar mejor las respuestas de dopamina al tatin. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la fabricación del catéter oral.Sin embargo, la construcción de un catéter oral adecuado y bien ajustado garantizará un ajuste firme del catéter entre la mejilla y los molares superiores, y aumentará la probabilidad de un experimento exitoso. Para preparar el electrodo de registro, aspire primero una fibra de carbono T650 de siete micrones de diámetro en una capilar de vidrio borosilicatado con un diámetro interno de 0,4 milímetros. A continuación, coloque el capilar en un tirador de electrodos vertical; inicialmente realice la tracción con el calentador ajustado a 55,0 y el imán desactivado, luego ajuste según sea necesario.Después de extraer la pipeta bajo un microscopio, corte la fibra de carbono expuesta para que sobresalga entre 75 y 100 micrómetros más allá del vidrio. La fibra dentro del vidrio debe estar herméticamente sellada; de lo contrario, deseche la preparación. A continuación, retire el aislamiento de la mitad de un alambre de calibre 30 de tres pulgadas, y aplique un tubo termoretráctil para asegurar el electrodo al micromanipulador.Luego, aplique una capa delgada de pintura de plata al alambre mientras la pintura aún esté húmeda. Introduzca el alambre en el extremo abierto del electrodo y conéctelo a la fibra de carbono en su interior. Verifique este contacto bajo un microscopio.Tome el electrodo con el micromanipulador y sujételo con un tubo termoretráctil. Coloque el electrodo de fibra de carbono preparado en IPA durante al menos 10 minutos para limpiar la superficie del electrodo y aumentar posteriormente la sensibilidad a la dopamina. Después de retirar el electrodo del IPA, enjuague la fibra de carbono con agua del grifo para eliminar el IPA.A continuación, prepare el electrodo de referencia a partir de un alambre de plata de 13 milímetros con una malla de plata/cloruro de plata de seis milímetros y un diámetro de 0,4 milímetros. Corte la porción del alambre sin malla y sujétela mediante soldadura a un pin de oro. Luego aplique epoxi a la soldadura. A continuación, sumerja la porción con malla en un ácido copolímero cinco veces.Déjelo secar durante 30 minutos al aire entre inmersiones después de la última inmersión. Déjelo secar al aire durante la noche. El día siguiente.Hornee la porción de malla del alambre a 120 grados Celsius durante una hora. Para fabricar el catéter oral, primero corte. Tubos de polietileno 100 en segmentos de seis centímetros.Luego, haga un pequeño disco plano en uno de los segmentos del tubo derritiendo el extremo y presionándolo sobre una superficie plana y fría en el centro del disco. Utilice una aguja de calibre 18 para crear un orificio. Sujete el otro extremo del segmento del tubo al extremo romo de una aguja de calibre 18.Luego, utilizando un perforador, se hacen varias piezas de politetrafluoroetileno de seis milímetros de diámetro y 3,18 milímetros de grosor. A continuación, en el centro de estos discos, se crea un orificio, convirtiendo así los discos en arandelas. Corte la arandela en forma de trapecio para facilitar su fijación durante la implantación molar.Para completar el catéter, introduzca completamente una aguja conectada a un tubo de polietileno a través de la arandela y deslice la arandela hasta ajustarla al tubo. El siguiente protocolo tarda aproximadamente 75 minutos en completarse. Comience con una rata preparada para la cirugía y abra su boca utilizando un hisopo de algodón.Luego, introduzca la aguja de una cánula en el tejido entre la mejilla y el primer molar superior de modo que la aguja emerja justo detrás y medial a las orejas. A continuación, deslice hacia arriba la cánula y asegure la arandela a los molares para estabilizar el catéter sobre la aguja expuesta. Deslice una arandela y apriétela contra la incisión.Sujete esta arandela en su lugar. Recorte el tubo de modo que queden expuestos de dos a cuatro centímetros por encima de la cabeza de la rata. Luego, utilizando la misma técnica, introduzca un catéter en el otro lado de la boca.A continuación, coloque la rata en un marco estereotáxico y perfore tres orificios para las cánulas y los electrodos con el fin de realizar grabaciones en la región del núcleo accumbens. La cánula guía a 1,2 milímetros anterior y 1,4 milímetros lateral respecto al agujero interhemisférico.Baje el aparato de la cánula hasta que la base de plástico quede al ras con el cráneo. Coloque el electrodo de referencia en el hemisferio contralateral a la cánula guía. Baje el electrodo de referencia aproximadamente dos milímetros por debajo de la duramadre.Luego coloque el electrodo estimulante, 5,2 milímetros posteriores y 1,0 milímetro lateral respecto al rema. Para dirigirse al área tegmental ventral. Baje el electrodo estimulante 8,0 milímetros por debajo de la duramadre.Luego asegure los componentes con tornillos y cemento y proporcione cuidados postoperatorios. Antes de realizar un experimento, verifique siempre la permeabilidad de la cánula oral infundiendo 200 microlitros de agua y observe si la rata percibe el sabor del agua; limpie el sitio de grabación retirando la cánula simulada, agregando dos gotas de heparina al 50 % y luego reposicionándola suavemente. La cánula simulada no debe estar a menos de dos milímetros del sitio de grabación.Ahora sujete y estabilice la etapa de la cabeza al estimulador implantado en el VTA y luego baje el electrodo de registro hasta el núcleo del accumbens. Ahora siga el protocolo del texto para producir un conjunto de datos de entrenamiento. Espere siempre al menos dos minutos, pero hasta cuatro o cinco minutos entre estimulaciones para permitir la recarga vesicular y debe.El paso más crítico del experimento consiste en obtener un electrodo de alta calidad. Si el fondo tiene una forma redondeada característica en la fase ascendente, se trata de un buen electrodo. Si la forma redondeada es pequeña o coincide estrechamente con la forma de onda aplicada, pruebe con un electrodo diferente.Si el fondo está correctamente desplazado, aplique un desplazamiento de compensación a la forma de onda aplicada en dirección positiva en incrementos de 0,1 voltio. Una vez generado un conjunto de entrenamiento en el sitio de grabación, recolecte datos mientras infunde bolos de 200 microlitros de taten cada uno a tres minutos durante 25 infusiones. Luego espere al menos 30 minutos e infunda el siguiente sabor de la misma manera.Se utilizó la FCSV combinada con la implantación de un catéter intraoral para examinar cómo la sacarosa y un AIT de sabor modulan la liberación fásica de dopamina en el núcleo accumbens antes de la infusión. La estimulación eléctrica en la VTA, indicada por la barra roja, produjo aumentos robustos en la liberación fásica de dopamina en el núcleo accumbens tras adquirir el conjunto de entrenamiento. Infusiones de 6,5 segundos de 200 microlitros de sacarosa, indicadas por la barra roja, produjeron un incremento en la corriente, indicado por la flecha blanca. Este evento ocurrió en el potencial de oxidación de la dopamina, indicado por la línea discontinua blanca, transformando los datos en un gráfico de concentración versus tiempo. Tras confirmar mediante ACP que el aumento en la corriente en respuesta al sabor se debe a un incremento en la concentración de dopamina.Otro tatin mentol se infundió durante las grabaciones de FSCV en el núcleo accumbens; también se observó un aumento en la concentración de dopamina tras la infusión de mentol. Una vez dominada, la cirugía combinada intraoral y por cánula puede realizarse en 75 minutos. Esta técnica puede combinarse con otras formas de conducta, como condicionamiento pavloviano competitivo y aversivo, y condicionamiento operante, con el fin de responder preguntas sobre la señalización de dopamina en subsegundos durante estos procesos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

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Dinámica presináptica de dopamina estriatal en rodajas de cerebro de voltametría cíclica rápida de exploración

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