Examen de Rapid dopamina Dinámica con Fast Scan voltametría cíclica Durante intraoral Administración saborizante en ratas Awake

El objetivo general de este procedimiento es medir las respuestas de dopamina por debajo de un segundo a la densidad del sabor oral. Esto se logra creando primero catéteres orales, electrodos de referencia y electrodos de fibra de carbono necesarios para los procedimientos quirúrgicos y el registro posterior a través de telemetría V cíclica de escaneo rápido. El segundo paso es implantar quirúrgicamente los catéteres orales, el electrodo intracraneal y la cánula guía para el electrodo de fibra de carbono.

Una semana más tarde, el microelectrodo de fibra de carbono se puede bajar al núcleo accumbens para registrar los cambios en la liberación de dopamina extracelular en respuesta a la administración intraoral de sabores. El paso final después del registro es calibrar el electrodo y utilizar el análisis de componentes principales para aislar los datos que contienen información sobre la dopamina. En última instancia, el uso combinado del gusto y la administración intraorales y la telemetría de volumen cíclico de escaneo rápido se utilizan para mostrar cambios en las respuestas de dopamina en menos de un segundo al taten.

Hay dos ventajas principales de esta técnica combinada sobre los métodos existentes. En primer lugar, la fotometría IC rápida tiene una alta resolución temporal y, en segundo lugar, la administración intraoral de taten minimiza el movimiento que la rata necesita hacer para obtener el tatin y nos permite aislar mejor las respuestas de dopamina al tatin. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la fabricación del catéter oral.

Sin embargo, la construcción de un catéter oral bueno y pagado asegurará un ajuste perfecto del catéter entre la mejilla y los molares superiores, y aumentará la probabilidad de un experimento exitoso. Para preparar el electrodo de registro, primero aspire una fibra de carbono T six 50 de siete micras de diámetro en un capilar de vidrio de silicato bora con un diámetro interior de 0,4 milímetros. A continuación, coloque el capilar en un electrodo vertical polar inicialmente tire con un calentador ajustado a 55.0 y el imán apagado, luego ajuste según sea necesario.

Después de colocar la pipeta bajo un microscopio, corte la fibra de carbono expuesta para que se extienda de 75 a 100 micras más allá del vidrio. La fibra del vidrio debe estar herméticamente sellada, de lo contrario, deseche la preparación. A continuación, retire el aislamiento de la mitad de un cable de calibre 30 de tres pulgadas, aplique termorretráctil para asegurar el electrodo al micromanipulador.

A continuación, aplica una fina capa de pintura plateada sobre el alambre mientras la pintura aún está húmeda. Inserte el cable en el extremo abierto del electrodo y conéctelo a la fibra de carbono que contiene. Verifique este contacto bajo un microscopio.

Tome el electrodo en el micro manipulador y asegúrelo con termorretráctil. Coloque el electrodo de fibra de carbono preparado en IPA durante al menos 10 minutos para limpiar la superficie del electrodo y aumentar la sensibilidad posterior a la dopamina. Después de quitar el electrodo del IPA, enjuague la fibra de carbono con agua del grifo para eliminar el IPA.

A continuación, prepare el electrodo de referencia a partir de un alambre de plata de 13 milímetros con una malla de plata y cloruro de plata de seis milímetros con un diámetro de 0,4 milímetros, corte la parte no mallada del alambre y suéldelo a un alfiler de oro. A continuación, aplique epoxi a la soldadura. A continuación, sumerja la porción de malla en un ácido copolímero cinco veces.

Déjalo secar durante 30 minutos al aire entre inmersiones después de la última inmersión. Déjalo secar al aire durante la noche. Al día siguiente.

Hornee la parte de malla del alambre a 120 grados centígrados durante una hora. Para hacer el catéter oral, primero se corta. Tubo de polietileno 100 en segmentos de seis centímetros.

A continuación, haz un pequeño disco plano en uno de los segmentos del tubo derritiendo el extremo y presionándolo sobre una superficie plana y fría en el centro del disco. Usa una aguja de calibre 18 para hacer un agujero. Conecte el otro extremo del segmento del tubo al extremo romo de una aguja de calibre 18.

Luego, con una perforadora, hace varias piezas de politetrafluoroetileno de seis milímetros de diámetro y 3,18 milímetros de grosor. Luego, en el centro de estos discos, cree un agujero, convirtiendo así los discos en arandelas. Corta la arandela en forma de trapecio para ayudar a alojarlos durante la implantación de los molares.

Para completar el catéter, empuje una aguja conectada al tubo de PE completamente a través de la arandela y deslice la arandela al ras del tubo. El siguiente protocolo tarda unos 75 minutos en completarse. Comience con una rata preparada para la cirugía y abra su boca con un hisopo de algodón.

Luego, empuje la aguja de una cánula en el tejido entre la mejilla y el primer molar superior para que la aguja salga justo detrás y medial a las orejas. A continuación, suba la cánula y fije la arandela a los molares para estabilizar el catéter en la aguja expuesta. Deslice una arandela y colóquela firmemente en la incisión.

Asegure esta arandela en su posición. Corta el tubo de modo que queden expuestos de dos a cuatro centímetros por encima de la cabeza de la rata. Luego, usando la misma técnica, coloque un catéter en el otro lado de la boca.

A continuación, coloque la rata en un marco estereotáxico y perfore tres agujeros para que las cánulas y los electrodos hagan grabaciones en la posición del núcleo accumbens. La cánula guía de 1,2 milímetros anterior y 1,4 milímetros. Torema lateral.

Baje el aparato de cánula hasta que la base de plástico quede al ras con el cráneo. Coloque el electrodo de referencia en el hemisferio contralateral a la cánula guía. Baje la referencia unos dos milímetros por debajo de la duramadre.

A continuación, coloque el electrodo estimulador, 5,2 milímetros posterior y 1,0 milímetros lateral torema. Para dirigirse al área tegmental ventral. Baje el electrodo estimulante 8,0 milímetros por debajo de la duramadre.

A continuación, asegure los componentes con tornillos y cemento y proporcione cuidados postoperatorios. Antes de realizar un experimento, siempre verifique la permeabilidad de la cánula oral mediante una infusión de 200 microlitros de agua y observe si la rata prueba el agua despejar el sitio de registro retirando la cánula ficticia, agregándole dos gotas de heparina al 50% y luego reposicionándola suavemente. El maniquí no debe estar a menos de dos milímetros del lugar de grabación.

A continuación, fije y estabilice la platina de la cabeza al estimulador implantado en el VTA y, a continuación, baje el electrodo de registro hasta el núcleo accumbens. Ahora, siguiendo el protocolo de texto, genere un conjunto de datos de entrenamiento. Espere siempre al menos dos minutos, pero hasta cuatro o cinco minutos entre estimulaciones para permitir la recarga vesicular y el mosto.

El paso más crítico en el experimento es obtener un electrodo de alta calidad. Si el fondo es una forma redondeada característica en la fase ascendente es un buen electrodo. Si la forma redondeada es pequeña o coincide estrechamente con la forma de onda aplicada, pruebe con un electrodo diferente.

Si el fondo está justo donde se ha desplazado, aplique un desplazamiento a la forma de onda aplicada en una dirección positiva en incrementos de 0,1 voltios. Una vez que se genera un conjunto de entrenamiento en el sitio de registro, recopile datos mientras infunde 200 bolos de microlitros de taten cada uno a tres minutos durante 25 infusiones. Luego espere al menos 30 minutos e infunda el siguiente sabor de la misma manera.

La FSCV combinada con el implante de catéter intraoral se utilizó para examinar cómo la sacarosa y la AIT de taten modula la liberación fásica de dopamina en el núcleo accumbens antes de la infusión de taten, la estimulación eléctrica indicada por la barra roja del VTA produjo aumentos robustos en la liberación de dopamina fásica en el núcleo del núcleo accumbens después de que se adquirió el conjunto de entrenamiento. Infusiones de 6,5 segundos de 200 microlitros de sacarosa indicadas por la barra roja producida en la elevación en corriente indicada por la flecha blanca. Esto ocurrió en el potencial de oxidación de la dopamina, que se indica mediante la línea discontinua blanca, transformando los datos en un gráfico de concentración frente al tiempo. Después de que PCA verificó que el aumento de corriente en respuesta al sabor es el resultado de un aumento en la concentración de dopamina.

También se observó un aumento de la concentración de dopamina después de la infusión de mentol Una vez dominada, la cirugía intraoral y de canulación combinadas se puede realizar en 75 minutos. Esta técnica puede combinarse con otras formas de comportamiento, como un condicionamiento pavloviano y operístico competitivo y aversivo, con el fin de responder a preguntas sobre la señalización de dopamina subsegundo durante estos procesos.