Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

El objetivo de este procedimiento es aislar y cultivar de manera eficiente neuronas primarias del mesencéfalo ventral de roedores. Esto se logra primero mediante la disección del mesencéfalo de embriones de roedores. El segundo paso consiste en aislar cuidadosamente el mesencéfalo ventral.

A continuación, el tejido neuronal debe disociarse para obtener una suspensión de células individuales. El paso final consiste en sembrar los neuronas primarios en un pequeño volumen sobre cubreobjetos antes de transferir las células adheridas a una placa de 24 pocillos más adelante. Finalmente, se utiliza un anticuerpo y microscopía de inmunofluorescencia para identificar las neuronas dopaminérgicas dentro del cultivo.

Las neuronas dopaminérgicas en el cerebro medio participan en diversas funciones, incluido el control del movimiento y la emoción en la cognición, así como en el sistema de recompensa del cerebro. También están implicadas en trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos, como la enfermedad de Parkinson, la adicción y la esquizofrenia. El método de reparación del cerebro medio ventral.

Los cultivos neuronales pueden utilizarse para estudiar la fisiología y las propiedades celulares de las neuronas dopaminérgicas, así como para comprender la causa de su degeneración durante trastornos como la enfermedad de Parkinson. Primero, prepare las laminillas.

Hervirlos en etanol al 70 % durante al menos 30 minutos para eliminar cualquier rastro de grasa. Luego, autoclavar las laminillas. Transferir las laminillas a placas de 24 pocillos y añadir medio mililitro de poliol de alteno a cada uno.

Bien, deje que las placas se incuben durante una hora a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que la vida útil de la solución de poliol o de Athene en uso es de un mes. Luego, lave las laminillas tres veces con medio mililitro de agua por lavado.

Sin los tres lavados, las células cultivadas no sobrevivirían 24 horas. A continuación, repare la solución de laminina. Asegúrese de descongelarla lentamente sobre hielo.

Luego, disuelva la laminina en D-M-E-M-F 12 frío y utilícela inmediatamente. Añada ahora medio mililitro de la solución de trabajo de laminina recién preparada a cada pocillo y deje que las placas incuben durante la noche a 37 grados Celsius. Por último, al preparar la pipeta de vidrio, pulo sus puntas hasta reducirlas a la mitad de su tamaño normal.

Realice una incisión abdominal para exponer los sacos uterinos y, utilizando fórceps, corte y libere el útero. Transfiera el útero a HBSS frío con hielo en una placa de 100 milímetros y comience a retirar los embriones con fórceps. Transfiera los embriones aislados a una nueva placa con HBSS frío.

Ahora, bajo un microscopio de disección, prepárese para acceder a esta ubicación del mesencéfalo ventral con un aumento de 10x. Diseque el mesencéfalo y el arco cefálico cortando el cerebro en la región del istmo y en el límite mesencéfalo-diencefálico utilizando tijeras quirúrgicas o pinzas. Después de extraer todo el mesencéfalo, realice un corte en la región media dorsal del mesencéfalo.

Utilizando fórceps, retire las meninges. Este paso es fundamental para el éxito del cultivo neuronal. Las células no neuronales morirán en las condiciones de cultivo y señalarán adversamente a las neuronas vecinas.

Ahora aplane el tejido del mesencéfalo en forma de mariposa. Corte aproximadamente la mitad de cada ala con una hoja estéril, dejando el mesencéfalo ventral. Transfiera el mesencéfalo ventral al HBSS frío con hielo en un tubo cónico de 15 mililitros.

Luego, proceda a diseccionar el siguiente embrión, procesando tantos embriones como sea posible dentro de una hora. Los embriones mantenidos en hielo durante más de una hora tienen baja viabilidad celular. Para asegurar una alta viabilidad de las neuronas dopaminérgicas, el tiempo desde la disección hasta la siembra no debe exceder una hora.

Además, la eliminación de las meninges es crucial para la supervivencia de las neuronas bajo una campana extractora. Retire el HBSS del conjunto del mesencéfalo ventral. A continuación, agregue un mililitro de tripsina al 0,05 % en A DTA, suficiente solución para 12 fragmentos de tejido.

Incube el tejido a 37 grados Celsius durante cinco a 10 minutos. Bajo la campana, reemplace la tripsina A DTA con un mililitro de medio de desactivación. Agite suavemente para mezclar, y luego retire el medio de desactivación, pero deje suficiente medio para que las células disociadas no se descarten.

A continuación, lave los tejidos dos veces con medio completo sin perder las células. Ahora agregue un mililitro de medio completo. Luego, triture el tejido con la pipeta de fuego pulido sin formar burbujas hasta obtener una suspensión de células individuales.

Aproximadamente ocho a diez pasajes deberían ser suficientes. Transcurrido este tiempo, centrifugar las células a 400 Gs durante cinco minutos. Eliminar el medio y resuspender las células en un mililitro de medio completo.

Pipetee las células hasta cuatro veces para obtener una suspensión. Comience contando y evaluando la salud de las células en la suspensión. Utilice la exclusión con azul de tripano con un hemocitómetro.

Ahora ajuste la suspensión celular a 1500 células por microlitro. Luego transfiera las tapas de los tubos microcentrífugos esterilizadas a placas de 100 milímetros. Coloque los cubreobjetos preparados sobre las tapas utilizando pinzas.

No lave las laminillas y trate de evitar que se sequen. Aplique 100 microlitros de suspensión sobre cada laminilla. Este método algo inusual proporciona una viabilidad del 90 % de la cultura y es un paso crítico para el éxito.

Luego, cierre la placa de Petri y transfiérala al incubador durante una hora; después de la incubación, transfiera cuidadosamente las laminillas con el medio a placas de 24 pocillos que contengan 400 microlitros de medio completo precalentado a 37 grados Celsius en cada pocillo, y luego incube las células durante la noche. Las primeras horas son las más críticas para la supervivencia celular dentro de las 24 horas. Añada suavemente medio completo medio mililitro a cada pocillo.

Cada dos semanas. Cambie la mitad del medio. Si el cultivo se vuelve amarillo, entonces se puede realizar el cambio de la mitad del medio antes, pero el cambio aún debe ser infrecuente.

Las neuronas dopaminérgicas sobrevivirán más de seis semanas bajo estas condiciones. Después de dos semanas de cultivo, la inmunohistoquímica frente a tirosina, hidroxilasa y marcadores neuronales muestra que el 1% de las células son dopaminérgicas. Las proyecciones neuronales aparecen dentro de las dos horas posteriores a la siembra.

Al final del primer día en cultivo, se pueden distinguir axones y dendritas. En última instancia, las neuronas sobreviven más de seis semanas y muestran un crecimiento extenso tras seguir este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos como la transducción viral, la inmunofluorescencia o la electrofisiología para responder preguntas mecanicistas en neuronas dopaminérgicas.