Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos En Vivo

El objetivo general de este procedimiento es visualizar el tráfico de monocitos en el cráneo, la médula ósea de un ratón vivo utilizando imágenes de dos fotones. Primero, se anestesia al ratón y se le inyecta una solución de podredumbre, dextrano ruminal para marcar la vasculatura. A continuación, se coloca el ratón en un soporte metálico personalizado y se extrae el cuero cabelludo desde la parte posterior del hueso parietal hasta el hueso frontal.

A continuación, se aplica un anillo de goma directamente sobre el cráneo con pegamento quirúrgico y los depósitos se llenan con solución salina líquida. Por último, la microscopía multifotónica se utiliza para rastrear el desarrollo de células fluorescentes a lo largo del tiempo dentro de la médula ósea del cráneo. Este me puede ayudar a responder a una pregunta clave en el campo de la inmunohematología, como es el mecanismo de movilización de monocitos en estado estacionario o después de la quimioterapia.

Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre el comportamiento de los monocitos modulares. También se puede aplicar para estudiar otros subconjuntos de células de médula ósea dependiendo de la especificidad del indicador de la tasa de gripe utilizado. El siguiente protocolo utiliza un microscopio multifotónico junto con un láser de cristal de zafiro de titanio y un modulador de operación para el control de la potencia del láser.

Para permitir la grabación simultánea de tres canales fluorescentes, la configuración debe incluir tres detectores de escaneo externos no DS o nds con una combinación de espejos dicroicos de 565 nanómetros y 690 nanómetros, filtros de paso de banda de 565, 610 nanómetros y 500 550 nanómetros, y un filtro de paso corto de 485. Tenga en cuenta que en esta configuración, la generación de segundos armónicos o SHG y la proteína fluorescente cian cian o CFP son detectadas por el NDD después del filtro de paso corto 485. La CFP también es detectada por el NDD.

Después de que el NDD detecte el filtro de paso de banda 500 550 y Rod Domine, Dextran. Después del filtro de paso de banda 565 610, varias horas antes de la imagen, configure la cámara de calentamiento a 32 grados centígrados. Esta temperatura mantendrá al ratón a una temperatura corporal óptima durante todo el experimento.

Tenga en cuenta que la cámara de calentamiento utilizada aquí es oscura y cubre los objetivos y la placa motorizada del sistema. Esto ayuda a evitar la contaminación lumínica externa. Para encender primero el sistema, encienda el láser de zafiro de titanio y, a continuación, encienda el resto del sistema de microscopio.

Inicie el software de adquisición. En este caso, se utiliza el software Zeiss Zen. Establezca el rango de longitud de onda del láser en 870 nanómetros.

A continuación, seleccione el NDD adecuado para la grabación. El ratón utilizado en este experimento es un ratón transgénico llamado Mac blue, que expresa la proteína fluorescente cian bajo el control del promotor del receptor uno del LCR. El método de anestesia recomendado depende de la duración de las imágenes, por lo que es mejor consultar el documento adjunto para obtener más detalles.

Un aspecto difícil de este procedimiento es la inyección de la vena T, ya que es bastante fácil pasar por alto la vena. Si esto sucede, realice la inyección retroorbital en su lugar. Una vez que el ratón esté anestesiado, use unas pinzas para verificar si está inconsciente estimulando la almohadilla para los pies. Próximo.

Para teñir la vasculatura, inyectar 200 microlitros de dextrano bastón en la vena de la cola, o para la tinción de neutrófilos. Inyectar 100 microlitros de solución salina que contenga LY seis GPE. Después de la inyección, coloque la cabeza del ratón entre las placas de retención de un soporte estereotáctico hecho a medida y adaptado al microscopio y al inhalador de gas anestésico.

Esto asegura que los movimientos respiratorios no afecten las imágenes. Apriete las placas de retención para estirar la piel entre las orejas y la cabeza. Compruebe la estabilidad.

Al presionar suavemente la cabeza con unas pinzas, la cabeza no debe moverse. A continuación, asegúrese de que el animal respira normalmente. Para preparar el ratón para la obtención de imágenes de dos fotones, use un dedo para aplicar etanol al 70% en el cabello del cuero cabelludo, teniendo cuidado de evitar los ojos.

A continuación, coloca un paño con un recorte para exponer el cuero cabelludo. A continuación, con unas tijeras y tenazas estériles, corte la piel y retire completamente el cuero cabelludo desde la parte posterior del hueso parietal hasta el hueso frontal. Mantenga una distancia de tres milímetros de los ojos y los oídos para evitar sangrados abundantes.

Extirpar el tejido conectivo suelto o periostio que cubre el cráneo. Luego, con una toalla de papel tibia empapada en PBS, lave el cabello restante como se muestra aquí. Con una aguja de calibre pequeño, aplique pegamento quirúrgico en toda la periferia de un anillo de goma de 10 milímetros de diámetro.

Luego, coloque el anillo de goma directamente sobre el cráneo con otra toalla de papel empapada en PBS. Limpia el interior del anillo por última vez. Agregue PBS tibio para sumergir completamente el cráneo.

A continuación, coloque el soporte estereotáctico debajo del objetivo. Una vez que el ratón esté en su lugar, use el microscopio ocular con transmisión directa para ver el cráneo y colocarlo aproximadamente en el campo de visión del microscopio. En la parte superior izquierda de la ventana del software de imágenes, haga clic en adquisición en vivo.

Aparecerá un escaneo en vivo del tejido en el centro de la ventana utilizando el control direccional del microscopio en el software. Localice una región con CFP y señal de domine de varilla para ajustar el enfoque. A continuación, ajuste la potencia del láser al mínimo para obtener la mejor relación señal/ruido con un daño mínimo en las fotos.

A continuación, en el software, haga clic en la pestaña de canales y aumente la potencia de ganancia en los PMT para cada NDD para reducir el blanqueo de fotos y el daño de las fotos, luego haga clic en la pestaña correspondiente para establecer la configuración de adquisición en un solo escaneo con un tiempo de permanencia de píxeles de 1,58 microsegundos y una resolución de 512 por 512 píxeles con un aumento de 1,5. Una vez configurados los parámetros de registro, haga clic en el comando de adquisición en vivo y examine el tejido para elegir el campo x, y, Z que desee monitorear en tiempo real. En este caso, se elige un campo que incluye tanto las áreas vasculares como las parenquimatosas.

Junto a guardar o registrar las coordenadas X, Y, Z del campo que se muestra en la pestaña de posiciones. Haga clic en agregar. Repita este proceso con hasta tres campos adicionales para registrar todas las coordenadas de interés.

Las coordenadas aparecerán en la pestaña de posiciones junto a instruir al software. Para capturar una pila de imágenes de tres DZ, haga clic en mover a en la pestaña de posiciones del software para ir a la primera posición registrada y seleccione Zack en el cuadro superior izquierdo del software. Esto abrirá la pestaña de la pila Z, se moverá a la posición Z más alta y ajustará la potencia del láser en consecuencia.

Haga clic en establecer el último, luego muévase a la posición más profunda. Ajuste la potencia del láser. A continuación, haga clic en establecer primero.

El espesor de la pila analizada debe adaptarse rápidamente a la celda estudiada. Las celdas en movimiento dejarán de funcionar rápidamente, por lo que deberá adquirir una pila más gruesa. Luego se adquieren para las células de movimiento lento.

En el cuadro superior izquierdo, seleccione el comando de serie temporal para abrir la pestaña de serie temporal. Establezca el número de ciclos y el intervalo de tiempo. Aquí, se adquirirá un volumen cada 30 segundos durante 60 ciclos.

Esto representa 30 minutos en tiempo real. Para comenzar la generación de imágenes de lapso de tiempo en la ventana principal, seleccione iniciar experimento durante todo el procedimiento, continúe monitoreando al animal para asegurarse de que esté inconsciente. También asegúrese de que el objetivo esté correctamente sumergido.

Una vez capturada la secuencia, utilice una pipeta para añadir PBS caliente. A continuación, comienza una segunda adquisición de 30 minutos. Si se observa una desaparición progresiva de la señal durante la adquisición, compruebe si hay fugas de PBS.

Una vez que se grabaron todos los videos requeridos, se realizó el análisis de datos como se describe en el documento adjunto para estudiar la fisiología de la médula ósea mediante imágenes intravitales, se inyectó un ratón transgénico Mac blue con 2 millones de Dalton rod domine dextran y se obtuvieron imágenes mediante microscopía de escaneo láser de dos fotones. Como se demuestra en este video, en la micrografía resultante, la vasculatura teñida con 2 millones de Dalton rod domine dextrano se muestra en hueso rojo, se muestra en azul se visualiza por segunda generación armónica. Los monocitos positivos para ECFP que se muestran en cian se localizan dentro de los nichos parenquimatosos, que se ven como áreas oscuras entre la vasculatura y el hueso, y dentro de los vasos.

Para calcular la trayectoria de cada célula, se realizaron imágenes de lapso de tiempo. Este video muestra el comportamiento migratorio de los monocitos parenquimatosos. La señal ECFP está en cian y las trayectorias migratorias de cada mancha roja aparecen en verde.

Aquí se puede observar el comportamiento migratorio de los monocitos vasculares. Estos datos se pueden utilizar para calcular tanto la velocidad media como el desplazamiento cuadrático medio de las celdas. Nótese que los monocitos vasculares muestran tanto un mayor desplazamiento como una mayor velocidad en comparación con los monocitos parenquimatosos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo rastrear monocitos de médula ósea de ratón in vivo utilizando dos imágenes fotográficas después de su desarrollo. Esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la migración celular y la interacción en la médula ósea, que representa un sitio muy importante de la hematopoyesis, pero también otras funciones fundamentales como el cebado de antígenos y la memoria inmunológica.