Name: Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Aprenda a visualizar el tráfico de monocitos en la médula ósea del cráneo de ratón mediante microscopía de dos fotones. Este método revela mecanismos de movilización celular in vivo en estado estable y tras quimioterapia.

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Los autores desean agradecer a Anne Daron y Pierre Louis Loyher para asistencia editorial, la Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) para obtener ayuda con el microscopio de dos fotones y el Fondo para el animal &quot;NAC&quot; y Camille Baudesson para los ratones que se reproducen asistencia. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7 / 2007-2013) en virtud del acuerdo de subvención n ° 304810 - RAID, y n ° 241440-Endostem, del Inserm, de la Université Pierre et Marie Curie &quot;Emergence &quot;, de la&quot; Ligue contre le cancer &quot;, de&quot; Asociación para la Investigación sobre el Cáncer le &quot;y de la&quot; Agence Nationale de la Recherche &quot;Aparición Programa 2012 (ANR-EMMA-050). PH recibió el apoyo de la &quot;Ligue contre le cancer&quot;.

NOTA: Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Experimentación Animal y Ética francés y validados por el &quot;Servicio de Protección et Santé Animales, Environnement&quot; con el número A-75 hasta 2065. Los tamaños de muestra se eligen para asegurar la reproducibilidad de los experimentos, y de acuerdo con el 3R de la regulación ética animal. 1. Preparación del ratón <ol><li> Anestesia <ol><li> Para corto período de formación de imágenes (menos de 1 hr), anestesiar el ratón con una inyección intraperitoneal de 200 l de una solución salina que contiene ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). </li><li> Alternativamente, para el período de formación de imágenes más largo (hasta 4 horas), anestesiar el ratón con una inhalación de isoflurano 2,5% vaporizado en una mezcla 70/30 de O 2 / N 2 O, a través de una máscara adaptada. </li><li> NOTA: Este modo proporciona la inconsciencia más estable y evita la inyección intraperitoneal en serie de fármacos. </li&gt; <li> Una vez que el ratón está anestesiado, comprobar la inconsciencia a través de la estimulación de la pata con pinzas. </li></ol></li><li> Tinción Vascular / tinción adicional <ol><li> Para la tinción vascular: Inyectar por vía intravenosa en la vena de la cola, 200 l de rodamina-dextrano (2 MDA, 10 mg / ml en tampón de solución salina). </li><li> Para la tinción de neutrófilos: inyecte 2 g de Ly6G-PE (clon 1A8) en 100 l de solución salina por vía intravenosa en la vena de la cola. </li></ol></li><li> Inmovilización <ol><li> Para la inmovilización, utilizar un soporte estereotáctica por encargo adaptado al microscopio y al inhalador de gas anestésico. NOTA: El titular estereotáctica es un soporte de metal con dos soportes de placa de metal, que se está fijo y la otra extraíbles y adaptables, para apretar la cabeza del animal. </li><li> Instale la cabeza del ratón entre las placas de retención para asegurar el aislamiento de los movimientos respiratorios. Apriete los oídos entre placas de retención y la cabeza para estirar el sk. El registro para la estabilidad y la respiración bienestar del animal. </li></ol></li><li> Retire el cuero cabelludo <ol><li> Utilizar con cuidado etanol al 70% para mojar el cabello del cuero cabelludo con un aplicador estéril, evitando el contacto con los ojos. </li><li> Cortar la piel con las tijeras y alicates estériles para eliminar completamente el cuero cabelludo del retroceso del hueso parietal en el hueso frontal. Mantener alejado de hasta 3 mm de ojos y oídos para prevenir sangrado abundante. Retire el tejido conectivo laxo que cubre el cráneo (periostio). Lavar el cabello restante con una cálida toalla de papel empapada en PBS. </li></ol></li><li> Sistema de inmersión configurado <ol><li> Pegue un anillo de goma de 18 mm de diámetro con pegamento quirúrgico directamente en el cráneo usando una aguja de pequeño calibre para controlar la distribución. Pegamento de toda la periferia del anillo de goma para evitar fugas (30 l deberían ser suficientes). </li><li> Limpie el cráneo debajo del ring por última vez con una toalla de papel empapada en PBS y luego añadir 37 ° C PBS para la inmersión completa de lacráneo. Añadir una gota de NaCl 0.9% solución o ungüento oftálmico específico en cada ojo del ratón para evitar la sequedad de los ojos. Arrastre el titular estereotáctica con arreglo al objetivo. </li><li> Aproximadamente colocar el campo utilizando el ocular del microscopio a través de la transmisión directa. </li></ol></li></ol> 2. Dos fotones Imaging Acquisition <ol><li> Utilice un microscopio multifotónica junto con un láser de Ti: Cristal de zafiro, que proporciona 140fs pulsos de luz NIR, sintonizable selectivamente de 680 a 1080 nm, y un modulador acústico-óptico para el control de la potencia del láser. Utilice una configuración que incluye 3 detectores externos no descanned (NDD) (que permiten la grabación simultánea de 3 canales fluorescentes) con una combinación de 2 espejos dicroicos (565 nm y 690 nm), 565/610 y 500/550 filtros de paso de banda, y un filtro de paso corto 485, con un plan de apochromat × 20 (NA = 1) objetivo de inmersión en agua. </li><li> Establezca la cámara de calentamiento para permitir una buena homeotermia de los ANAESratón anestesiados., NOTA: La temperatura puede ajustarse de 1 hora antes de la formación de imágenes de sesión para una mejor estabilidad. En nuestro caso, 32 ° C ha sido elegido para obtener la temperatura corporal óptima del ratón anestesiado (36-37 ° C) y se mantiene hasta 4 horas. Esta temperatura puede ser adaptado para el sistema utilizado (sonda digital puede ser utilizado para comprobar este punto). Además, la cámara de calentamiento utilizado es oscuro / negro y cubre una parte del sistema (objetivos y la placa motorizada) para evitar la contaminación de luz externa. </li><li> Encienda el sistema <ol><li> Encienda el láser de Ti: Zafiro, entonces todo el sistema de microscopio. Inicie el software de adquisición. Ajuste el rango de longitud de onda del láser de 870 nm. Seleccione NDD apropiado para la grabación. NOTA: En nuestro caso, generación de segundo armónico (SHG) 19 y la proteína fluorescente cian (ECFP) son detectados por el DDN después del filtro de pase corto 485. ECFP también es detectado por el NDD después del filtro de paso de banda 500/550 y rodamina-dextrano es detectado por tél NDD después del filtro de paso de banda 565/610. </li></ol></li><li> Ajustar la configuración de adquisición <ol><li> Utilice el comando de imágenes &quot;adquisición en vivo&quot; del software y utilizar el control direccional microscopio, ajustar el enfoque en una región con ECFP y Rodamina señal. Ajustar la potencia del láser al mínimo para obtener la mejor relación señal a ruido con un mínimo de foto-daño. NOTA: El ajuste de la potencia que se utiliza varía según la profundidad de la zona de interés. Normalmente la configuración de OMA están distribuidas alrededor de un 20%, lo que representa una potencia de láser más allá del objetivo alrededor de 15 mW. Es mejor para aumentar el poder de ganancia en los PMT para cada NDD para reducir foto-blanqueo y foto-daño. Ajustes de adquisición típicos son la exploración individual con un tiempo de permanencia de píxel de 1,58 mS, y una resolución de 512 x 512 píxeles con un aumento de 1,5. </li></ol></li><li> Seleccione las regiones de interés <ol><li> Una vez que los parámetros de grabación se establecen, utilice de nuevo el comando de adquisición &quot;en vivo&quot;,y examinar el tejido para elegir un campo deseado (x, y, z) para monitorizar en tiempo real. NOTA: Por lo general, se optó por un campo que incluye tanto vascular y áreas del parénquima. </li><li> Registrar el campo con el comando de software &quot;posición&quot;. NOTA: Este comando memoriza x, y, z las coordenadas de los diferentes campos distantes. </li><li> Seleccionar y registrar campos de interés adicionales (hasta 3), utilizando el mismo procedimiento. </li><li> Establecer una pila Z 3D con el comando de software &quot;z-stack&quot; en la primera posición memorizada de acuerdo con el volumen requerido con aumento elegido. Memorizar posición más profunda primero, y luego la posición más alta. Normalizar la potencia del láser con la profundidad. NOTA: Para imágenes campo concomitante múltiple, adquirimos 5 rebanadas separadas por 3 micras z pasos para cada campo para adquirir un volumen de 12 micras de espesor. Estas configuraciones pueden ser adaptados para el tipo de célula estudiado. </li></ol></li><li> Adquisición de Lanzamiento <ol><li> Seleccione el220, el tiempo de la serie de comandos de software &quot;y seleccione la duración de intervalo de tiempo y el número de ciclos. Comience time-lapse de acuerdo con el lapso de tiempo y la duración requerida seleccionando el comando de software &quot;iniciar el experimento&quot;. NOTA: En nuestro caso, vamos adquiriendo un volumen cada 30 segundos durante 60 ciclos que representan a 30 min en tiempo real. Más pequeño lapso de tiempo se puede realizar para pista de rodadura celular rápido en el vaso sanguíneo. En este caso más delgado z-pila y no más de 2 campos diferentes se pueden grabar al mismo tiempo. </li><li> El control regular de la puesta en marcha. <ol><li> Siempre controlar al animal para asegurarse de que está inconsciente. NOTA: Sacudida de bigotes o las piernas del animal son indicadores de avivamiento. En el caso de la respiración del animal es carne seca, la cantidad de isoflurano se puede reducir ligeramente. La deriva de tejido fuerte durante la adquisición es un indicador del renacimiento del ratón. </li><li> Asegúrese de que el objetivo se sumerge correctamente. Renovar 37 ° C PBS between dos adquisiciones (30 min). NOTA: la desaparición progresiva de la señal durante la adquisición es indicador de PBS fugas. </li></ol></li></ol></li><li> Fin del procedimiento <ol><li> Una vez que se registran los videos requeridos, la eutanasia a los animales por dislocación cervical rápidamente antes de la reanimación. NOTA: la curación de heridas conduce a la formación de una costra en 24 a 48 horas lo que limita la posibilidad de realizar las imágenes longitudinal. </li></ol></li></ol> Análisis 3. Datos <ol><li> Corrección de la deriva <ol><li> Utilice software Imaris Bitplane para el seguimiento automático 3D. </li><li> Abra la secuencia de imágenes 3D en Imaris. Seleccione &quot;spot&quot; de comandos, y generar el seguimiento manual (clic del ratón + shift) para todos los puntos de tiempo por un mínimo de 4 puntos de anclaje diferentes, si es posible distribuida homogéneamente en el campo. </li><li> Aplicar la corrección de la deriva con el comando &quot;deriva correcta&quot; en la pestaña &quot;editar pista&quot;. </li><li> Compruebe tque la calidad de la corrección en x, y y z en particular para evitar la vacilación artefactual. NOTA: Si la corrección no es satisfactoria, pruebe otros puntos de anclaje o excluir el video del análisis. </li></ol></li><li> Seguimiento de la célula <ol><li> Utilice &quot;añadir nuevos puntos&quot; del sistema y seleccione &quot;puntos de la pista con el tiempo&quot; ajuste algoritmo. Vaya al paso siguiente. </li><li> Aplicar el procedimiento de seguimiento automático de células, ya sea en todo el canal de interés con el comando &quot;canal de origen&quot;. Objetos Set (es decir, las células) de diámetro a 10 micras. Vaya al paso siguiente. NOTA: La elección dependerá de la distinción entre los objetos y la especificidad de la señal medida. En resumen, el seguimiento automático de todo el canal es posible sólo si la señal detectada es específica para el objeto de interés. Debido a que tanto SHG y ECFP son detectados por el NDD después del filtro 485 pase corto, de seguimiento será más específica y eficiente utilizando la señal de ECFP registrada por el NDD después de la 500/550 filtros de paso de banda. Agrupados o objetos embalados densas requieren selección manual de objetos individuales similares al paso 3.1.2. </li><li> Seleccione el tipo de filtro &quot;de calidad&quot;, ajustar el umbral para excluir el seguimiento de objetos inespecíficos. Vaya al paso siguiente. </li><li> Elija &quot;browniano algoritmo Motion&quot; con parámetros precisos de &quot;distancia Max&quot; y &quot;tamaño Gap&quot; entre dos puntos. Validar generación pista. </li><li> Una vez que las pistas se calculan automáticamente, seleccione &quot;Duración pista&quot; tipo de filtro, ajustar el umbral para eliminar pistas más cortas que 120 segundos (lo que representa 4 puntos de tiempo). </li><li> Obligatorio: Después de seguimiento automático, comprobar la calidad de las pistas. <ol><li> Desenrolle la barra de tiempo para comprobar que los objetos siguen los caminos de pista. Si no, utilice las opciones de corrección de punto de seguimiento disponibles en la pestaña &quot;editar&quot;: Eliminar pistas falsas o incorrectas con &quot;borrar&quot; de comandos (borrar cualquier pista point individualmente con el comando &quot;desconexión&quot;). Si pista de atletismo es discontinua, añadir puntos de tiempo que faltan (clic con el ratón + shift), seleccione todos los puntos en una pista dada, y el uso de &quot;conectar&quot; de comandos en la pestaña &quot;editar pista&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Parámetros de cuantificación <ol><li> Seleccione la pestaña &quot;Estadísticas&quot; al mando &quot;Preferencias&quot;, seleccione los parámetros dinámicos de interés de la lista. Seleccione &quot;Exportar todas las estadísticas para presentar&quot; comando y guardar el archivo de Excel generado. NOTA: Varios parámetros dinámicos se obtienen directamente desde el software como longitudes de pista, velocidad instantánea, velocidad media, y un seguimiento de la rectitud. Coeficiente de Motilidad 6, 20 puede determinarse, pero no está directamente proporcionada por el software. </li><li> Para cada celda, calcular la media de los desplazamientos para cada período de tiempo (dt) (para una película de lapso de tiempo de 30 seg, dt será de 30, 60, 90 seg, etc).Trazar la media del desplazamiento cuadrado como una función del intervalo de tiempo. Obtener coeficiente de la motilidad mediante el cálculo de la pendiente de la parte lineal de la curva. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Los puntos críticos de la metodología de formación de imágenes en vivo son para asegurar la estabilidad del foco a fin de maximizar la duración de la formación de imágenes y para reducir al mínimo el riesgo de contaminación bacteriana y la inflamación, lo que podría afectar la dinámica de las células inflamatorias. Imaging del hueso del cráneo ósea sigue estos objetivos como la cirugía realizada para obtener acceso a la médula ósea es mínima. El uso de material estéril y antisépticos es esencial para lim...

La médula ósea desempeña un papel central en la hematopoyesis y representa el principal reservorio de monocitos que recirculan constitutivamente entre la sangre y el parénquima medular, renuevan el conjunto de monocitos circulantes con una vida corta 2,3 y participan en la reconstitución de los tejidos-macrófagos y células dendríticas en estado estacionario 4. Durante la inflamación o después de una aplasia transitoria, los monocitos se movilizan activamente desde la médula ósea o el bazo 5, 6, 7 y colonizan los órganos inflamados. Varios ejes quimioatrayentes han estado involucrados en el proceso de movilización de células mieloides de la médula ósea 8, 5, 6,9. Más allá del compartimento mieloide, la médula ósea también es un sitio importante de cebado de linfocitos T 10 y un nicho de memoria inmunológica 11,12. Por lo tanto, este tejido es central para numerosas investigaciones en el campo de la hematología y la inmunología. Nuestro conocimiento sobre la organización estructural de las células mieloides medulares surge principalmente del análisis de la sección histológica de los tejidos fijados 13. Esta visión estática no permite estudiar la dinámica del intercambio celular entre los diferentes compartimentos de la médula ósea, que es la base de su actividad funcional.
Las imágenes intravitales constituyen un importante aporte biológico en el estudio de la movilidad celular, la adherencia celular y las interacciones entre células, que anteriormente solo se describían a partir de sistemas in vitro. Los desafíos técnicos para la adquisición adecuada de imágenes intravitales incluyen la capacidad de alcanzar el tejido de interés desde un punto de vista óptico y maximizar su aislamiento de las derivas fisiológicas (contracciones respiratorias, musculares o peristálticas) o mecánicas (disrupción y extensión del tejido después de la cirugía, y exposición al objetivo del microscopio, así como a las perturbaciones de la temperatura y vascular/oxigenación). Las derivas microscópicas pueden limitar la capacidad de mantener el enfoque durante mucho tiempo y podrían introducir artefactos en la cuantificación de la motilidad celular. Una alternativa, validada para varios tejidos para reducir estas dificultades técnicas, es trabajar con tejido explantado incubado en un medio termostatizado y oxigenado; Sin embargo, la interrupción completa de la circulación linfática y vascular puede ser problemática. Las imágenes intravitales de la médula ósea del cráneo tienen varias ventajas en relación con estos temas. En primer lugar, requiere una acción quirúrgica mínima. En segundo lugar, el grosor del hueso en esta región permite la visualización directa de los nichos de la médula ósea sin abrasión, reduciendo así las perturbaciones fisiológicas. La red medular se puede visualizar en la región parasagital del hueso; Sin embargo, los sinusoides son más visibles en la zona fronto-parietal, donde la matriz ósea es más delgada12,14. 
Las imágenes intravitales dependen de la disponibilidad del indicador fluorescente más preciso que marca la población de interés. El marcaje in vitro de la población de células purificadas antes de la transferencia adoptiva condujo a una importante caracterización de los nichos de células madre hematopoyéticas 15 o de los microdominios endoteliales de la médula ósea que favorecen el injerto tumoral 16, y proporcionó varias aportaciones fundamentales sobre conceptos clave en inmunología 17 . Sin embargo, este enfoque generalmente requiere cientos de miles de células para tener la oportunidad de detectarlos posteriormente in vivo. Esto podría explicarse por la alta tasa de mortalidad después de la tinción, la dilución en todo el cuerpo y el cambio en el estado de activación, lo que podría conducir a un homing sesgado. El marcaje endógeno a partir de un sistema de ratón transgénico supera en gran medida estas limitaciones y ha permitido obtener imágenes del comportamiento de los osteoblastos endógenos 8, megacariocitos 18 o subconjuntos de linaje mieloide 6. Sin embargo, hay que ser cauteloso al considerar la especificidad del reportero fluorescente entre el subconjunto estudiado. 
El Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, llamado ratón MacBlue 1, es un valioso sistema transgénico para estudiar monocitos medulares con imágenes en tiempo real 6. La inyección intravenosa de rodamina-dextrano de alto peso molecular distingue el parénquima medular de la red sinusoide vascular de la médula ósea. Con este enfoque, es posible rastrear el comportamiento de los monocitos en los diferentes compartimentos medulares en un contexto fisiopatológico específico de interés. Además, proponemos una estrategia adicional para comparar la dinámica de los monocitos con la de los neutrófilos mediante el marcaje in vivo utilizando un anticuerpo específico.

<table><tbody><tr><td>Ketamin</td><td>Merial</td><td></td><td>100 mg/ml, anestésico</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer HealthCare</td><td></td><td>10 mg/ml, anestésico</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td></td><td>2,5%, anestésico</td></tr><tr><td>O2/NO2</td><td></td><td></td><td>70/30 mezcla, anestésico</td></tr><tr><td>Rhodamin-Dextran</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>2 MDa, 10 mg/ml, Tinción vascular</td></tr><tr><td>Ly6G-PE</td> clon <td>de Becton-Dickinson</td><td></td><td>1A8, tinción de neutrófilos</td></tr><tr><td>Soporte estereotáctico Cirugía</td><td>casera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td></td><td></td><td>cirugía</td></tr><tr><td>Cirugía de tijeras y pinzas</td><td></td><td></td><td></td>estériles</tr><tr><td>Anillo</td><td></td><td></td> de goma <td>de 18 mm de diámetro, cirugía</td></tr><tr><td>Glubran 2</td><td>Queryo Médico</td><td></td><td>Quirúrgico Pegamento, fijación de anillo de goma</td></tr><tr><td>Agujas de calibre pequeño</td><td>Cirugía Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 NLO Microscopio multifotónico&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>Microscopio</td>Ti:Láser de cristal de <td></td></tr><tr><td>zafiro&nbsp;</td><td>Coherente Chameleon Ultra</td><td></td><td>140 fsec pulsos de luz NIR</td></tr><tr><td>Zen 2010</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Acquistion Software</td></tr><tr><td>Imaris Bitplane&nbsp;</td>Software de análisis de <td>plano de bits</td><td></td><td>, seguimiento automático 3D</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>D. Cirugía Dutscher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara termostatizada</td><td>Carl Zeiss</td><td>Imágenes intravitales</td><td></td></tr></tbody></table>

seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; en vivo</em

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Las imágenes multifotónicas en tiempo real ofrecen una gran oportunidad para estudiar el tráfico celular y las interacciones entre células en su entorno fisiológico tridimensional. Las actividades biológicas de las células inmunitarias dependen principalmente de su capacidad de motilidad. Los monocitos sanguíneos tienen una vida media corta en el torrente sanguíneo; Se originan en la médula ósea y se liberan constitutivamente de ella. En la afección inflamatoria, este proceso se intensifica, lo que conduce a la monocitosis sanguínea y la posterior infiltración de los tejidos inflamatorios periféricos. La identificación de los eventos biomecánicos que controlan el tráfico de monocitos desde la médula ósea hacia la red vascular es un paso importante para comprender la relevancia fisiopatológica de los monocitos. Realizamos imágenes de lapso de tiempo in vivo mediante microscopía de dos fotones de la médula ósea del cráneo del ratón Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue). El ratón MacBlue expresa la proteína fluorescente cian mejorada (ECFP) bajo el control de un promotor mieloide específico 1, en combinación con el marcaje de la red vascular. Describimos cómo este enfoque permite el seguimiento de monocitos medulares individuales en tiempo real para cuantificar aún más el comportamiento migratorio dentro del parénquima de la médula ósea y la vasculatura, así como las interacciones célula a célula. Este enfoque proporciona nuevos conocimientos sobre la biología de los subconjuntos de monocitos de la médula ósea y permite abordar aún más cómo se puede influir en estas células en condiciones patológicas específicas.

La estructura del cráneo del ratón ofrece una buena oportunidad para estudiar la fisiología de la médula ósea por intravital de imágenes. El hueso ser delgado alrededor de la zona frontal parietal, es posible obtener acceso a nichos medulares sin abrasión del hueso. La figura 1 representa un amplio campo 2D del cráneo de un ratón transgénico MacBlue. La matriz ósea está compuesta principalmente de colágeno I fácilmente detectable por SHG 19. La inyección de rodamina-dextrano tiñe la red vascu...

Los monocitos son reguladores clave de la inmunidad innata y desempeñan un papel crítico en la renovación del sistema fagocítico mononuclear periférico y en caso de inflamación. Este manuscrito describe el procedimiento de obtención de imágenes en tiempo real de la médula ósea calvaria del ratón para estudiar el mecanismo de movilización de monocitos.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar el tráfico de monocitos en la médula ósea del cráneo de un ratón vivo mediante imágenes de dos fotones. Primero, se anestesia al ratón y se inyecta una solución de dextrano rojo marcado con rumina para etiquetar la vasculatura. Luego, se coloca al ratón en un soporte metálico personalizado y se elimina el cuero cabelludo desde la parte posterior del hueso parietal hasta el hueso frontal.A continuación, se aplica un anillo de goma directamente sobre el cráneo con adhesivo quirúrgico y se llenan los reservorios con solución salina líquida. Finalmente, se utiliza microscopía de múltiples fotones para rastrear la evolución de células fluorescentes a lo largo del tiempo dentro de la médula ósea del cráneo. Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la inmunohematología, como el mecanismo de movilización de monocitos en estado estable o tras quimioterapia.Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre el comportamiento de los monocitos modulares. También puede aplicarse para estudiar otros subconjuntos de células de la médula ósea, dependiendo de la especificidad del reportero fluorescente utilizado. El siguiente protocolo utiliza un microscopio de múltiples fotones acoplado a un láser de cristal de zafiro de titanio y un modulador óptico para el control de la potencia del láser.Para permitir la grabación simultánea de tres canales fluorescentes, la configuración debe incluir tres detectores externos no DS o NDD con una combinación de espejos dicróicos de 565 nanómetros y 690 nanómetros, filtros de paso de banda de 565, 610 nanómetros y de 500 a 550 nanómetros, y un filtro de paso corto de 485 nanómetros. Tenga en cuenta que en este montaje, la generación de segundo armónico (SHG) y la proteína fluorescente cian (CFP) se detectan mediante el NDD después del filtro de paso corto de 485 nanómetros. La CFP también se detecta mediante el NDD.Después del filtro de paso de banda 500-550, el Rod Domine Dextran es detectado por el NDD. Después del filtro de paso de banda 565-610, varias horas antes de la adquisición de imágenes, configure la cámara de calentamiento a 32 grados Celsius. Esta temperatura mantendrá al ratón a una temperatura corporal óptima durante todo el experimento.Tenga en cuenta que la cámara de calentamiento utilizada aquí es oscura y cubre los objetivos y la placa motorizada del sistema. Esto ayuda a evitar la contaminación por luz externa. Para encender el sistema primero, encienda el láser de zafiro de titanio y luego encienda el resto del sistema del microscopio.Inicie el software de adquisición. Aquí se utiliza el software Zeiss Zen. Establezca el rango de longitud de onda del láser en 870 nanómetros.Luego seleccione el NDD adecuado para la grabación. El ratón utilizado en este experimento es un ratón transgénico denominado Mac blue, que expresa la proteína fluorescente cian bajo el control del promotor del receptor de CSF uno. El método de anestesia recomendado depende de la duración de la imagen, por lo que es mejor consultar el documento adjunto para obtener detalles.Un aspecto difícil de este procedimiento es la inyección en la vena T, ya que es bastante fácil fallar en la vena. Si esto ocurre, realice en su lugar una inyección retroorbital. Una vez que el ratón esté anestesiado, use pinzas para verificar la inconsciencia estimulando la planta del pie. Siguiente.Para teñir la vasculatura, inyecte 200 microlitros de dextrano rodamina en la vena de la cola, o para la tinción de neutrófilos, inyecte 100 microlitros de solución salina que contenga LY seis GPE. Después de la inyección, coloque la cabeza del ratón entre las placas de sujeción de un portaestereotáctico personalizado adaptado al microscopio y al inhalador de gas anestésico.Esto asegura que los movimientos respiratorios no afectarán la adquisición de imágenes. Ajuste las placas de sujeción para estirar la piel entre las orejas y la cabeza. Verifique la estabilidad.Al presionar suavemente la cabeza con pinzas, la cabeza no debería moverse. A continuación, asegúrese de que el animal respire con normalidad. Para preparar al ratón para la imagenología de dos fotones, use un dedo para aplicar etanol al 70 % al cabello del cuero cabelludo, teniendo cuidado de evitar los ojos.Luego, coloque un campo quirúrgico con una abertura para exponer el cuero cabelludo. A continuación, utilizando tijeras y pinzas estériles, corte la piel y retire completamente el cuero cabelludo desde la parte posterior del hueso parietal hasta el hueso frontal. Mantenga una distancia de tres milímetros respecto a los ojos y las orejas para prevenir una hemorragia extensa.Elimine el tejido conectivo suelto o el periostio que cubre el cráneo. Luego, utilizando una toalla de papel empapada en PBS tibio, lave el cabello restante como se muestra aquí. Con una aguja de calibre pequeño, aplique pegamento quirúrgico a toda la periferia de un anillo de goma de 10 milímetros de diámetro.Luego, coloque el anillo de goma directamente sobre el cráneo con otra toalla de papel empapada en PBS. Limpie el interior del anillo una última vez. Añada PBS tibio para sumergir completamente el cráneo.Luego, coloque el soporte estereotáctico debajo del objetivo. Una vez que el ratón esté en su lugar, utilice el ocular del microscopio con transmisión directa para ver el cráneo y posicionarlo aproximadamente en el campo de visión del microscopio. En la parte superior izquierda de la ventana del software de imagen, haga clic en adquisición en vivo.Una exploración en vivo del tejido aparecerá en el centro de la ventana utilizando el control direccional del microscopio en el software. Localice una región con señal de CFP y dominio de bastón para ajustar el enfoque. Luego, configure la potencia del láser al mínimo para obtener la mejor relación señal-ruido con daño fotónico mínimo.A continuación, en el software, haga clic en la pestaña de canal y aumente la ganancia en los PMT para cada NDD con el fin de reducir el blanqueo fotónico y el daño por luz, luego haga clic en la pestaña correspondiente para configurar los parámetros de adquisición en escaneo simple con un tiempo de permanencia por píxel de 1,58 microsegundos y una resolución de 512 por 512 píxeles con un aumento de 1,5. Una vez establecidos los parámetros de grabación, haga clic en el comando de adquisición en vivo y examine el tejido para seleccionar un campo x, y, Z deseado que será monitoreado en tiempo real. Aquí, se elige un campo que incluye áreas tanto vasculares como parenquimatosas.A continuación, guarde o registre las coordenadas X, Y, Z del campo mostrado en la pestaña de posiciones. Haga clic en agregar. Repita este proceso con hasta tres campos adicionales para registrar todas las coordenadas de interés.Las coordenadas aparecerán en la pestaña de posiciones junto a la instrucción del software. Para capturar una serie tridimensional de imágenes, haga clic en mover a en la pestaña de posiciones del software para ir a la primera posición registrada y seleccione Zack en el cuadro superior izquierdo del software. Esto abrirá la pestaña de serie Z, muévase a la posición Z más alta y ajuste la potencia del láser en consecuencia.Haga clic en establecer último, luego muévase a la posición más profunda. Ajuste la potencia del láser. A continuación, haga clic en establecer primero.El grosor de la serie analizada debe adaptarse rápidamente a la célula estudiada. Las células en movimiento saldrán rápidamente del plano de enfoque, por lo que será necesario adquirir una serie más gruesa. Luego se adquiere para células de movimiento lento.En el cuadro superior izquierdo, seleccione el comando de series temporales para abrir la pestaña de series temporales. Establezca el número de ciclos y el intervalo de tiempo. Aquí, se adquirirá un volumen cada 30 segundos durante 60 ciclos.Esto representa 30 minutos en tiempo real. Para iniciar la adquisición de imágenes lapse en la ventana principal, seleccione comenzar experimento. Durante todo el procedimiento, continúe monitoreando al animal para asegurarse de que se encuentre inconsciente. Asegúrese también de que el objetivo esté adecuadamente sumergido.Después de que se haya capturado la secuencia, utilice una pipeta para agregar PBS tibio. Luego, inicie una segunda adquisición de 30 minutos. Si se observa una desaparición progresiva de la señal durante la adquisición, verifique si hay fugas de PBS.Una vez que se han grabado todos los videos requeridos, se realizó el análisis de datos según se describe en el documento adjunto para estudiar la fisiología de la médula ósea mediante imágenes intravital. A un ratón transgénico Mac blue se le inyectó dextrano de dominio de varilla de 2 millones de Dalton y se obtuvieron imágenes mediante microscopía de barrido láser de dos fotones. Como se demuestra en este video, en la micrografía resultante, la vasculatura teñida con dextrano de dominio de varilla de 2 millones de Dalton se muestra en rojo, mientras que el hueso, mostrado en azul, se visualiza mediante generación de segundo armónico. Los monocitos positivos para ECFP, mostrados en cian, se localizan dentro de nichos parenquimatosos, que aparecen como áreas oscuras entre la vasculatura y el hueso, así como dentro de los vasos.Para calcular la trayectoria individual de las células, se realizó imágenes de lapso de tiempo. Este video muestra el comportamiento migratorio de los monocitos del parénquima. La señal de ECFP aparece en cian y las trayectorias migratorias de cada punto rojo aparecen en verde.Aquí se puede observar el comportamiento migratorio de los monocitos vasculares. Estos datos pueden utilizarse para calcular tanto la velocidad media como el desplazamiento cuadrático medio de las células. Téngase en cuenta que los monocitos vasculares muestran tanto un mayor desplazamiento como una velocidad incrementada en comparación con los monocitos parenquimatosos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo rastrear monocitos de médula ósea de ratón in vivo mediante dos técnicas de imagen fotoacústica tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la migración celular y las interacciones en la médula ósea, que representa un sitio muy importante de hematopoyesis, pero también otras funciones fundamentales como la presentación de antígenos y la memoria inmunológica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video describe un protocolo detallado para aislar médula ósea entera fresca de las extremidades traseras del ratón para investigar defectos completos de la MO en pacientes con trastornos sanguíneos como la leucemia.

Cosecha de médula ósea de la extremidad trasera del ratón

Este protocolo describe un procedimiento para la toma de muestras en serie de médula ósea femoral (BM) sin requerir el sacrificio de ratones. Este procedimiento facilita los estudios longitudinales de la composición de la BM de los ratones a lo largo del tiempo y proporciona acceso en serie a las células dentro de la BM para estudios ex vivo y de trasplante.

Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

La naturaleza de las interacciones entre las células madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) y nichos de la médula ósea es poco conocido. Modificaciones de hardware personalizados y un protocolo de adquisición de múltiples pasos permiten el uso de dos fotones y microscopía confocal a la imagen ex vivo HSPCs etiquetados alojados dentro de las áreas de la médula ósea, las interacciones de seguimiento y el movimiento.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

El protocolo describe un novedoso modelo de cámara de ventana de fémur murino que se puede utilizar para rastrear el movimiento de las células en la médula ósea femoral in vivo. La microscopía de fluorescencia multifotónica intravital se utiliza para obtener imágenes de tres componentes de la médula ósea femoral (vasculatura, matriz de colágeno y neutrófilos) a lo largo del tiempo.

Fémur Window Cámara Modelo de<em&gt; En Vivo</em&gt; Seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de en vivo de la activación de las células (células T) CD4 T ingenua, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por el GM-CSF de la médula (BM)-derivado de las células dendríticas (DCs). Además, este protocolo describe aislamiento del BM y del T-cell, la generación de C.C. y transferencia adoptiva de DC y del T-cell.

Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea

Aquí, presentamos un protocolo para procesar la médula ósea fresca (BM) aislada del ratón o humana para el análisis de citometría de masa de alta dimensión (citometría por tiempo de vuelo, CyTOF) de células de linaje neutrófilo.

Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la ultraestructura de los megacariocitos in situ utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las médulas óseas murinas se recogen, se fijan, se incrustan en resina epoxi y se cortan en secciones ultrafinas. Después de la tinción por contraste, la médula ósea se observa bajo un microscopio TEM a 120 kV.

In situ Exploración de la megacariopoyesis murina mediante microscopía electrónica de transmisión

Este protocolo describe la inyección intrafemoral de unas pocas células madre hematopoyéticas o leucémicas, incluidas las células editadas genéticamente, en modelos de xenoinjertos murinos, lo que no solo permitirá el trasplante rápido y seguro de células, sino también análisis seriados de la médula ósea.

Las inyecciones intrafemorales simplificadas con ratones vivos permiten un análisis continuo de la médula ósea

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Aprenda a visualizar el tráfico de monocitos en la médula ósea del cráneo de ratón mediante microscopía de dos fotones. Este método revela mecanismos de movilización celular in vivo en estado estable y tras quimioterapia.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos

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