Name: Altas medidas de precisión de zinc isotópicos aplicados a Ratón Órganos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprende a medir isótopos de zinc con alta precisión en órganos de ratón mediante cromatografía de intercambio iónico y espectrometría de masas. Este método revela mecanismos de transporte de zinc y ayuda a diagnosticar enfermedades relacionadas con el desequilibrio de este metal esencial.

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FM reconoce el financiamiento de la ANR a través de una chaire d&#39;Excellence IDEX Sorbonne Paris Cité, el INSU través de una subvención PNP, el Instituto Universitario de Francia, así como el programa Labex UniverEarth en la Sorbona de París Cité (ANR-10-LabX-0023 y la ANR -11-IDEX-0005-02). También agradecemos a la financiación del Consejo Europeo de Investigación en virtud de la Comunidad Europea H2020 Programa Marco / ERC acuerdo de subvención # 637503 (prístina).

NOTA: Los procedimientos con animales han sido aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) en la Université Paris Diderot. 1. Preparación de los materiales <ol><li> Sub-ebullición destilar 1 L de los ácidos (HNO 3, HBr) con el fin de purificarlos de la impureza. </li><li> Limpie los vasos y adaptador de punta en un caliente (~ 100 ° C) concentra HNO 3 baño ácido durante al menos dos días. </li><li> Lavar las puntas de pipeta en un resfriado 3 N HNO 3 baño durante varios días y enjuagar individualmente tres veces con agua desionizada. </li></ol> Preparación 2. Muestra <ol><li> Anestesiar a los ratones por inyección intraperitoneal de ketamina y xilazina. Evaluar la anestesia por el método pizca dedo del pie. </li><li> Recoger la sangre por una punción cardiaca en presencia de heparina en tubos de 1,5 ml. </li><li> Separar el plasma de los glóbulos por centrifugación (10 min, 1500 xg) y transferir el plasma a polipropileno cviales ryogenic utilizando puntas de polipropileno. </li><li> Retire la sangre restante a partir de órganos por el corte de la vena hepática y la inyección de DPBS a través del corazón. Evaluar la muerte del ratón por dislocación cervical. </li><li> Cosecha de los órganos con instrumentos de acero inoxidable estériles, liberarlos de la grasa que rodea su caso, y SNAP-congelarlos en polipropileno viales criogénicos. </li></ol> 3. Química Purificación <ol><li> En primer lugar, disolver las muestras en una mezcla de ~ 1 ml de concentrado (30%) H 2 O 2 y ~ 1 ml de concentrado (~ 15 M) HNO 3. ¿Todos estos pasos dentro de una campana de humos. <ol><li> Colocar todo el órgano de interés en un vaso de precipitados de teflón 15 ml. A continuación, añadir el H 2 O 2 / HNO 3 al vaso 5. Mantenga el vaso de precipitados abierto durante unos minutos con el fin de evitar salpicaduras debido a la reacción de oxidación de la materia orgánica y la liberación de CO 2. </li><li> Por último, poner el vaso de precipitados sobre una placa caliente a about 100 ° C durante un par de horas o hasta que la solución es perfectamente claro. </li></ol></li><li> Abrir el vaso de precipitados y secar la solución sobre una placa caliente a aproximadamente 100 ° C. </li><li> Una vez que la muestra está seca, añadir 1 ml de 1,5 N HBr a las muestras; cerrar el vaso y deje que se disuelva en una placa caliente a 100 ° C durante un par de horas. </li><li> Mientras tanto preparar las 500 columnas mu l. <ol><li> Añadir 500 l de la resina de malla AG1X8 200-400 a la columna y lo puso en el estante de la columna con un vaso de la basura debajo de ella. Lavar la resina alternando: 5 ml de 18,2 mO ⋅ cm de agua, 5 ml de 0,5 N HNO 3, 5 ml de agua, 5 ml de 0,5 N HNO 3, y luego 5 ml de agua. Acondicionar la resina con 5 ml de 1,5 N HBr. </li></ol></li><li> Retire los vasos de la placa caliente y los puso en un baño de ultrasonidos durante aproximadamente 30 minutos, y luego dejar que los vasos se enfríen a temperatura ambiente. </li><li> Una vez que el vaso de precipitados se enfrió y la resina se lava, abra el vaso de precipitados. Ponga el adaptador de punta a tél jeringa, añadir una punta de pipeta; pipetear los 1 ml de muestra y cargarlo en la resina (muy lentamente a fin de no agitar la resina). </li><li> Una vez que todo el líquido pasa a través de la columna, añadir 5 ml de 1,5 N HBr. </li><li> Una vez que los 5 ml de 1,5 N HBr pasan a través de la columna, reemplazar el vaso de precipitados de basura con un limpio vaso de precipitados de 15 ml. </li><li> Añadir 5 ml de 0,5 N HNO 3 2,5 ml a la vez. En esta etapa el Zn se eluye de la resina. </li><li> Una vez 5 ml de HNO 3 pasa a través de la columna, retire el vaso de precipitados y colocarlo en una placa caliente a 100 ° C hasta que se seca. </li><li> Retire la columna del soporte columna; trash la resina (usar una nueva resina para cada muestra). </li><li> Una vez que la muestra está seca, repetir el protocolo con el mismo volumen de ácidos sobre una columna más pequeña (100 l) y luego se coloca en un plato caliente hasta que se seca. La muestra está ahora listo para espectrometría de masas. </li></ol> 4. Masa-espectrometría de Medición <ol><li> Analizar el compo isotópica Znsición en un colector acoplado inductivamente espectrómetro de masas con plasma multi (MC-ICP-MS). <ol><li> Utilice los parámetros de la máquina que se resumen en la Tabla 1. </li></ol></li><li> Coloque las tazas de Faraday para recoger en masa (m / z) de 62 Ni, 63 Cu, Zn 64, 65 Cu, Zn 66, 67 y 68 de Zn Zn. </li><li> Preparar una solución que contiene Zn 500 ppb en 0,1 M HNO 3 para el análisis isotópico. </li><li> Analizar la solución 500 ppb de Zn mediante el uso de una cámara de pulverización combinada con un / nebulizador teflón min 100 l. Para cada muestra, mida 30 exploraciones (1 bloque de 30 ciclos) en la que el tiempo de integración de cada exploración es 8,389 seg. </li><li> Corrija el fondo restando las intensidades de cero en pico de una solución en blanco (la M HNO 3 0,1 solución utilizada para volver a disolver las muestras). </li><li> Control y corregir posibles 64 Ni interferencia isobárica mediante la medición de la intensidad del pico 62 Ni.Suponga que la relación 62 64 Ni / Ni es algo natural (0.2548), corregir el valor del sesgo masa instrumental, y luego retire el 64 Ni en la masa 64 como: 64 Zn reales = 64 Zn medido - 64 Ni = 64 Zn medido - (64 Ni / 62 Ni) naturales x 62 mide Ni. </li><li> Corregir el sesgo masa instrumental de horquillado cada una de las muestras con una solución de 500 ppb de la norma JMC Lyon Zn (u otro estándar disponibles, tales como IRMM-3702). Realizar el horquillado estándar dividiendo la relación Zn Zn 66/64 de la muestra por el promedio de la relación Zn Zn 66/64 de los dos estándares medidos antes y después de la muestra menos 1 y multiplicada por 1000 (véase la ecuación 1). Precisión externa típica en el estándar JMC Lyon Zn es 0,05 permil / amu (2 desviación estándar, 2 sd). </li></ol>

<ol><li>Marechal, C. N., Telouk, P., Albarede, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+analysis+of+copper+and+zinc+isotopic+compositions+by+plasma-source+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Geology%22%5BJournal%5D)">Precise analysis of copper and zinc isotopic compositions by plasma-source mass spectrometry.</a> Chemical Geology. 156 (1), 251-273 (1999).</li>
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<li>Balter, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+Cu%2C+Fe%2C+and+Zn+isotopic+patterns+in+organs+and+body+fluids+of+mice+and+sheep%2C+with+emphasis+on+cellular+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Contrasting Cu, Fe, and Zn isotopic patterns in organs and body fluids of mice and sheep, with emphasis on cellular fractionation.</a> Metallomics. 5 (11), 1470-1482 (2010).</li>
<li>Urgast, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+isotope+ratio+imaging+of+rat+brain+thin+sections+from+stable+isotope+tracer+by+LA-MC-ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Zinc isotope ratio imaging of rat brain thin sections from stable isotope tracer by LA-MC-ICP-MS.</a> Metallomics. 4, 1057-1063 (2012).</li>
<li>Marin-Carbonne, J., Rollion-Bard, C., Luais, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+measurements+of+iron+isotopes+by+SIMS%3A+MC-ICP-MS+intercalibration+and+application+to+a+magnetite+crystal+from+the+Gunflint+chert%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Geol%22%5BJournal%5D)">In-situ measurements of iron isotopes by SIMS: MC-ICP-MS intercalibration and application to a magnetite crystal from the Gunflint chert.</a> Chem. Geol. 285 (1-4), 50-61 (2011).</li>
<li>Fietzke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boron+isotope+ratio+determination+in+carbonates+via+LA-MC-ICP-MS+using+soda-lime+glass+standards+as+reference+material%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anal.+Atom.+Spec%22%5BJournal%5D)">Boron isotope ratio determination in carbonates via LA-MC-ICP-MS using soda-lime glass standards as reference material.</a> J. Anal. Atom. Spec. 25, 1953-1957 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La reproducibilidad de las mediciones se evalúa a través de análisis replicados de las mismas muestras realizadas durante las diferentes sesiones de análisis. Por ejemplo 6, hemos reproducido la misma roca terrestre 7 veces y hemos obtenido los resultados presentados en la Tabla 2. Como se esperaba de la teoría de fraccionamiento isotópico 10 y como se mide en cualquier material sistema solar hasta el momento (por ejemplo, meteorito 11-13,...

La medición de alta precisión (mejor que 100 ppm / unidad de masa atómica) de zinc composición de isótopos estables sólo ha sido posible por cerca de 15 años gracias al desarrollo de varios colectores de plasma de código espectrómetros de masa y desde entonces ha sido aplicado en su mayoría en la Tierra y las ciencias planetarias. Las aplicaciones en el campo médico son nuevos y tienen un fuerte potencial como biomarcadores para enfermedades que modifican el metabolismo del zinc (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer). Este trabajo presenta un método para medir con alta precisión las proporciones de isótopos estables naturales de zinc en diversos órganos de ratón. Lo mismo sería aplicable a muestras humanas. El método consiste en la disolución de los órganos, la purificación química de zinc del resto de los átomos, y luego el análisis de la relación isotópica en un espectrómetro de masas. La calidad de Zn mediciones isotópicas depende de la calidad de la purificación química (pureza de Zn, bajo un borrador en blancoared a la cantidad de Zn presente en la muestra, rendimiento alto química del procedimiento) y en el control del sesgo instrumental. Se necesita la alta pureza de la fracción de Zn final para eliminar ambos interferencias isobáricas e interferencias no isobárica que crean un efecto de la matriz. Nucleidos isobáricas crean interferencias directas (por ejemplo, 64 Ni). Interferencias no isobáricas generan el llamado efecto de &quot;matriz&quot; y alteran la precisión analítica de las mediciones por el cambio de la condición de la ionización en comparación con el estándar de zinc puro a la que las muestras se comparan con 1. Un bajo blanco (&lt;10 ng) indica que no hay contaminación de las muestras por Zn externa que sesgo la composición isotópica medido. Como isótopos de Zn pueden fraccionarse durante la cromatografía de intercambio iónico 2, la colección de todos los átomos de Zn asegura que ningún fraccionamiento isotópico se produce, lo que implica que el procedimiento químico debe tener un rendimiento completo. Por último, la corrección del fraccionamiento isotópico decisivo durante la medición espectrometría de masas se realiza mediante el método de &quot;horquillado estándar&quot;. Por lo tanto, las principales dificultades para obtener mediciones precisas son el control de la contaminación externa (es decir, baja en blanco), la producción de una purificación química pleno rendimiento que está limpio de cualquier otros átomos o moléculas, y corregir el fraccionamiento isotópico instrumental en el espectrómetro de masas. En este artículo vamos a describir nuestro protocolo de análisis para separar Zn de los órganos de ratón, así como las mediciones de espectrometría de masas. La extracción se realiza usando una baja cantidad de ácidos diluidos (HBr / HNO 3 medios de comunicación) en micro-columnas (0.5 mu l y 0,1 mu l) de resina de intercambio aniónico. Tiene un rendimiento total y las mediciones tienen una reproducibilidad externa mejor que 50 ppm en la relación de 66 Zn / Zn 64. Otra ventaja de la metod es que es muy rápido. El método está por lo tanto muy bien adaptada a las ciencias médicas, en el que uno tiene que analizar un gran número de muestras en comparación con ciencias de la tierra, donde se desarrollaron estos métodos analíticos.

<table><tbody><tr><td>Espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente multicolección</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina de intercambio aniónico AG1 X8 200-400</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1443-MSDS</td><td></td></tr><tr><td>Vasos de precipitados de teflón</td><td>Savillex&nbsp;</td><td>200-015-12</td><td></td></tr><tr><td>Colunmos de teflón de fabricación propia con teflón</td><td></td><td></td><td></td> retráctil</tr></tbody></table>

altas medidas de precisión de zinc isotópicos aplicados a ratón Órganos

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

Se presenta un procedimiento para medir con alta precisión las proporciones de isótopos de zinc en órganos de ratón. Zinc se compone de 5 isótopos estables (64 Zn, Zn 66, 67, 68 Zn Zn y Zn) 70 que se fraccionan naturalmente entre los órganos de ratón. En primer lugar, mostramos cómo disolver los diferentes órganos con el fin de liberar a los átomos de Zn; este paso se realiza por una mezcla de HNO 3 y H 2 O 2. A continuación, purificamos los átomos de zinc de todos los otros elementos, en particular de interferencias isobáricas (por ejemplo, Ni), por cromatografía de intercambio aniónico en un / HNO 3 HBr medio diluido. Estos dos primeros pasos se realizan en un laboratorio limpio utilizando productos químicos de alta pureza. Por último, las proporciones de isótopos se miden usando un multi-colector-plasma de acoplamiento inductivo-espectrómetro de masas, en baja resolución. Las muestras se inyectaron usando una cámara de pulverización y el fraccionamiento isotópico inducido por el espectrómetro de masas es corrected mediante la comparación de la relación de las muestras a la relación de un estándar (técnica de horquillado estándar). Este procedimiento típico completo produce una relación isotópica con un 50 ppm (2 sd) reproducibilidad.

En 1,5 N HBr, las principales especies de zinc (ZnBr3-) forma complejos muy fuertes con la resina de intercambio de aniones, mientras que la mayoría de otros elementos no interactúan con la resina. El zinc se recupera a continuación cambiando el medio a HNO 3 diluido, el cambio de la especiación de Zn a Zn 2+ que se libera de la resina de 6,7. Las relaciones de isótopos se expresan típicamente como partes por 1000 desviaciones relativas a un estándar: <p ...

Presentamos la técnica para medir con alta precisión las proporciones de isótopos de zinc en órganos de ratón.

Altas medidas de precisión de zinc isotópicos aplicados a Ratón Órganos

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

El objetivo general de este procedimiento es medir las relaciones de isótopos de zinc en órganos de ratón con alta precisión. Esto se logra primero disolviendo los diferentes órganos en ácidos para liberar todos los átomos en solución, seguido de la corrección de aberraciones; el material seco se resuspende entonces en bromuro de hidrógeno y se utiliza cromatografía de intercambio iónico para purificar el zinc de todos los demás elementos de la muestra mediante una columna de gravedad acondicionada. El zinc se eluye de la resina utilizando ácido nítrico.El paso final consiste en medir las relaciones de isótopos de zinc utilizando un espectrómetro de masas con plasma acoplado inductivamente y múltiples colectores. En última instancia, la composición isotópica se utiliza para diagnosticar enfermedades que modifican el equilibrio de zinc en el cuerpo mediante la medición de la distribución en equilibrio de los isótopos de zinc en diferentes órganos. Por lo tanto, este método ha sido desarrollado para obtener información sobre la distribución natural y los mecanismos de transporte de zinc entre los órganos del ratón.Se puede aplicar a cualquier animal y, en última instancia, puede util

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Investigación

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Chemistry

Química

La metástasis del cáncer de ovario se caracteriza por numerosas lesiones intraperitoneales difusas, por lo que la cuantificación visual precisa de la carga tumoral es un desafío.  En este trabajo describimos un método para la cuantificación in situ y ex vivo de la carga tumoral metastásica utilizando células tumorales marcadas con proteína fluorescente roja (RFP) e imágenes ópticas.

La cuantificación de la intra-peritoneal del cáncer ovárico Metástasis

Aquí, describimos un protocolo para el radiomarcaje y las pruebas in vivo de derivados tridentados de quelato-tetrazina de Tc(I) 99mpara la química bioortogonal y de pre-targeting.

Preparación y Evaluación de<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-etiquetados tridentado Los quelatos de orientación previa Usando Bioorthogonal Química

Este protocolo describe el uso de un analizador de composición corporal y el sistema metabólico de control animal para caracterizar la composición corporal y parámetros metabólicos en ratones. Un modelo de obesidad inducido por la alimentación alta en grasas se utiliza como un ejemplo para la aplicación de estas técnicas.

Composición corporal y análisis jaulas metabólico en ratones de reserva grasa alta

Las líneas celulares cultivadas primarias o establecidas se utilizan comúnmente para abordar las cuestiones biológicas y mecanicistas fundamentales como un enfoque inicial antes de usar modelos animales. Este protocolo describe cómo preparar extractos celulares enteros y fracciones subcelulares para estudios de zinc (Zn) y otros oligoelementos con espectroscopía de absorbancia atómica.

Espectroscopía de absorbancia atómica para medir las agrupaciones intracelulares de zinc en células de mamífero

El objetivo del protocolo es demostrar las técnicas utilizadas para investigar la enfermedad viral aislándose y cuantificando el virus del Zika, a partir de múltiples órganos en un ratón después de la infección.

Aislamiento y cuantificación del virus del Zika de múltiples órganos en un ratón

Presentamos un método robusto, rentable y flexible para medir los cambios en el número de hepatocitos y la ploidía nuclear dentro de muestras de tejido fijo/crioconservado que no requieren citometría de flujo. Nuestro enfoque proporciona una poderosa firma de citología hepática en toda la muestra ideal para rastrear la progresión de las lesiones y enfermedades hepáticas.

Un método in situ de alto rendimiento para la estimación de la ploideide nuclear de hepatocitos en ratones

La tomografía microcomputarizada de doble fundición de resina, o DUCT, permite la visualización, digitalización y segmentación de dos sistemas tubulares simultáneamente para facilitar el análisis 3D de la arquitectura de órganos. DUCT combina la inyección ex vivo de dos resinas radiopacas seguida de la tomografía microcomputarizada y la segmentación de los datos tomográficos.

DUCT: Fundición de doble resina seguida de tomografía microcomputarizada para análisis hepático 3D

Este artículo demuestra cómo preparar y administrar hierro isotópico no radiactivo unido a transferrina para estudios de transporte de hierro en el embarazo de ratón. También se describe el enfoque para cuantificar el hierro isotópico en compartimentos fetoplacentarios.

Cuantificación del transporte de hierro a través de la placenta del ratón in vivo utilizando isótopos de hierro no radiactivos

En este artículo se detalla la metodología para el radiomarcaje de un anticuerpo monoclonal anti-CD19 específico para humanos y cómo utilizarlo para cuantificar las células B en el sistema nervioso central y los tejidos periféricos de un modelo murino de esclerosis múltiple mediante imágenes PET in vivo, recuento gamma ex vivo y enfoques de autorradiografía.

Obtención de imágenes de células B CD19+ en un modelo experimental de ratón con encefalomielitis autoinmune mediante tomografía por emisión de positrones

Este artículo describe la radiosíntesis, la formulación y el control de calidad de una nueva sonda radiomarcada (es decir, NANOBODY NM-02 marcada con 68Ga) y su uso para la obtención de imágenes PET/CT de animales pequeños en un modelo de xenoinjerto.

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