El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

El objetivo general de este procedimiento es examinar cómo las células residentes en el tejido influyen en la capacidad de las células endoteliales vasculares para favorecer el reclutamiento de leucocitos durante la inflamación. Esto se logra primero estableciendo cultivos mixtos de células endoteliales con células madre mesenquimales utilizando uno de dos modelos vasculares in vitro: el modelo de portaobjetos microscópico y el modelo de filtro. Luego, estos cultivos se tratan con citocina antes del ensayo de flujo.

El sistema de flujo basado en aian se ensambla luego paso a paso, con modificaciones realizadas según el sistema modelo que se utilice. El paso final consiste en perfundir leucocitos sobre las células endoteliales y observar su reclutamiento a partir del flujo, así como su comportamiento posterior. En última instancia, estos ensayos de adhesión basados en flujo y multicelulares han demostrado que la comunicación entre células madre mesenquimales y células endoteliales suprime el reclutamiento de neutrófilos durante la inflamación.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del tráfico de leucocitos, como por ejemplo, ¿cómo modifican este proceso las células residentes en los tejidos, tales como las células madre mesenquimales? ¿Este proceso cambia en enfermedades como la inflamación crónica o el cáncer? ¿Podemos utilizar este conocimiento para ayudar en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas? Para comenzar, establezca cultivos co-cultivos de células endoteliales con células madre mesenquimales utilizando el modelo de microportaobjetos o el modelo de filtro, tal como se describe en el protocolo del texto, para armar el sistema de flujo.

Primero encienda el calentador y ajústelo a 37 grados Celsius. Luego, coloque una jeringa de 20 mililitros sin émbolo, así como una jeringa de cinco mililitros, en una llave de tres vías. A continuación, mida y corte un trozo largo de tubo de 2.4 milímetros que tenga aproximadamente la distancia entre la válvula y la llave de tres vías.

Corte un trozo de tubo de 1,3 mm de largo entre ocho y diez milímetros e insértelo en uno de los extremos del tubo grueso. Conecte el extremo del tubo grueso a la llave de paso de tres vías y conecte el tubo delgado. Conecte el extremo a un puerto de la válvula microelectrónica de tres vías para formar el depósito de lavado.

Luego, sujete la llave al compartimento de plexiglás utilizando cinta microporo. A continuación, prepare un tramo de tubo grueso y tubo delgado de seis a ocho milímetros de longitud, e introduzca el tubo delgado en uno de los extremos del tubo grueso. Sujete el extremo del tubo grueso a una jeringa de dos mililitros con el émbolo retirado.

Ahora conecte el extremo del tubo delgado de la jeringa de dos mililitros a un puerto de la válvula microelectrónica para formar el depósito de muestra. A continuación, mida y corte un trozo largo de tubo delgado que tenga la distancia entre la válvula microelectrónica y el centro del platino del microscopio. Para el modelo de portaobjetos microscópicos, fije un trozo de tubo grueso de ocho a 10 milímetros al extremo del tubo delgado.

Luego coloque un conector en forma de L en el extremo del tubo grueso. Esto se conectará al portaobjetos microscópico o al modelo de filtro. Ate un trozo de tubo manométrico azul Portex de ocho a 10 milímetros a la conexión del extremo del tubo delgado.

A continuación, coloque el extremo del tubo delgado en la microválvula. El tubo se convierte en la salida común para los reservorios de lavado y de muestra. Llene los reservorios con solución salina tamponada con fosfato que contenga albúmina sérica bovina.

Primee brevemente la tubería con PBSA haciendo fluir PBSA a través de ella para eliminar cualquier burbuja de aire, luego conecte la tubería del manómetro a una jeringa de vidrio de 50 mililitros. Mientras que en el modelo de portaobjetos microscópico solo se conecta un trozo de tubo grueso de 10 a 12 milímetros al extremo de la tubería del manómetro que va hacia la jeringa de vidrio. Coloque un conector en forma de L en el extremo del tubo grueso.

Prepare la jeringa llenándola con 10 mililitros de PBSA. Invierta la jeringa de modo que el extremo conectado al tubo quede orientado hacia arriba y expulse todas las burbujas de aire antes de rellenarla con cinco mililitros de PBSA. Finalmente, coloque la jeringa de vidrio en una bomba de jeringa para infusión y retracción.

Establezca la velocidad de recarga y el diámetro de la jeringa de vidrio para configurar las microplacas para el flujo. Coloque la microplaca sobre la platina de un microscopio invertido de contraste de fase. Gire la llave de paso de tres vías para permitir que el PBSA fluya a través del tubo de entrada.

Conecte el conector en forma de L al puerto de entrada de un canal de microportaobjetos. A continuación, coloque el conector en forma de L de la bomba de jeringa en el puerto de salida del canal. Limpie cualquier PBSA que haya goteado sobre el microportaobjetos.

Alternativamente, para el modelo de filtro, primero corte un trozo de película de parafina al mismo tamaño que la lámina de vidrio utilizando una plantilla metálica. Luego, corte una ranura de 20 por cuatro milímetros en la película de parafina usando una plantilla metálica para crear el canal de flujo. Utilice la junta de paraform para marcar el canal de flujo sobre la lámina de vidrio.

Alinee los bordes del sexto filtro de pozo sobre el cubreobjetos de vidrio. Asegúrese de que el filtro cubra las marcas del canal de flujo. Corte cuidadosamente el filtro utilizando un escalpelo tipo 10.

A continuación, cubra cuidadosamente el filtro con una junta de paraformaldehído, asegurándose de que la ranura del canal de flujo quede en el centro del filtro. Utilice un trozo de papel limpio y elimine cualquier burbuja. Ahora coloque la lámina de cubierta en el hueco de la placa inferior de la cámara de flujo de plexiglás.

Coloque la placa superior de plexiglás sobre la junta y atornille las placas juntas. Gire la llave de tres vías para permitir que el tampón de lavado PBSA fluya a través de la válvula. A continuación, conecte el tubo del manómetro al puerto de entrada de la placa superior de plexiglás.

Corra PBSA a través del canal de flujo para permitir que las burbujas pasen. Luego, conecte el tubo del manómetro de la bomba de jeringa al puerto de salida de la placa de plexiglás. Incline cualquier PBSA que haya goteado sobre la placa superior de la cámara.

Finalmente, coloque la cámara sobre la platina de un microscopio invertido de contraste de fases y ajuste el enfoque para visualizar las células endoteliales por encima de los filtros y perfundir leucocitos sobre las células endoteliales. Configure la bomba de jeringa para rellenado y presione iniciar una vez que se haya ajustado el enfoque. Para visualizar la monocapa de células endoteliales, agregue dos mililitros de neutrófilos purificados al depósito de muestra y deje calentar durante dos minutos.

Luego lave el endotelio con PBSA durante dos minutos. Gire la válvula para perfundir neutrófilos sobre el endotelio. Administre la dosis de neutrófilos durante cuatro minutos.

Cierre la válvula y perfunda PBSA desde el depósito de lavado durante el resto del experimento. Al realizar el experimento, asegúrese de que las burbujas de aire no pasen en ningún momento durante el ensayo, ya que esto alteraría la monocapa de células endoteliales y provocaría la desprendimiento de neutrófilos adheridos. Registre el reclutamiento de neutrófilos ya sea durante el flujo de neutrófilos o después de la perfusión utilizando software de captura de imágenes digital.

Identifique el centro del canal moviendo el objetivo hacia el borde del canal en el puerto de entrada e identificando el centro del puerto. Realice grabaciones digitales de al menos cinco a diez campos en el centro del canal de flujo durante el flujo de neutrófilos. Tome imágenes de un solo campo cada 10 segundos durante un minuto, muévase a lo largo del canal y registre otro campo durante un minuto.

Repita este proceso durante toda la duración del bolo para registrar después de la perfusión. Realice una grabación de diez segundos de cinco a diez campos en el centro del canal de flujo para evaluar el comportamiento de los leucocitos. Tome imágenes cada segundo dentro del intervalo de diez segundos.

Esto permite tiempo suficiente para capturar desde el flujo y analizar el comportamiento de neutrófilos adherentes. Registre un solo campo que contenga al menos 10 neutrófilos transmigrados durante cinco minutos, tomando imágenes cada 30 segundos. Esto puede utilizarse para calcular la velocidad de las células migradas; registre otra serie de campos de diez segundos.

Esto permite que los neutrófilos tengan tiempo para migrar a través de la monocapa endotelial. Finalmente, detenga la bomba de jeringa y retire el tubo de salida, luego el tubo de entrada, desarme la cámara de flujo y enjuague el depósito de muestra con PBSA; repita este procedimiento para los filtros y canales de microportaobjetos subsiguientes antes de pasar al análisis del reclutamiento y comportamiento de los leucocitos, tal como se describe en el protocolo del texto. En el modelo de microportaobjetos, la estimulación con citocinas mediante el factor de necrosis tumoral alfa aumentó significativamente la adhesión de neutrófilos al endotelio de manera dependiente de la dosis.

Además, se observó una disminución dependiente de la dosis de TNF-alfa en el porcentaje de neutrófilos que rulan sobre la superficie endotelial. Esto se reflejó en un aumento dependiente de la dosis de TNF-alfa en el porcentaje de neutrófilos que migran a través de la monocapa endotelial y, por lo tanto, en la migración transendotelial. Resultados similares se observaron con el ensayo de flujo basado en filtros.

Por ejemplo, la estimulación con TNF alfa aumentó la adhesión de neutrófilos de manera dependiente de la dosis. El cultivo conjunto de células endoteliales con células madre mesenquimales derivadas de médula ósea redujo significativamente la adhesión de neutrófilos en comparación con las células endoteliales cultivadas solas, como era esperado para el modelo de portaobjetos microscópico.

Nuevamente, se observaron efectos similares cuando se utilizó el modelo basado en filtros, con menos adhesión observada en la co-cultura en comparación con la monocultura. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo examinar la forma en que las células estromales se comunican con las células endoteliales para influir en el reclutamiento de leucocitos durante la inflamación.