Name: El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Aprende a analizar el reclutamiento de leucocitos en modelos de flujo in vitro usando células endoteliales y mesenquimales. Este método revela cómo las células del estroma modulan la inflamación vascular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los cordones umbilicales se recogieron con la ayuda del Birmingham Women's Health Care NHS Trust. HMM contó con el apoyo de una beca de desarrollo profesional de Arthritis Research UK (19899) y Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).

<ol><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+on+endothelium+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration.</a> Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+stroma+as+a+regulator+of+leukocyte+recruitment+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation.</a> Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).</li>
<li>Serhan, C. N., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation%3A+the+beginning+programs+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation: the beginning programs the end.</a> Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).</li>
<li>Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+leukocyte+recruitment+and+its+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies.</a> Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).</li>
<li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Ability+of+Exogenous+Chemotactic+Agents+to+Disrupt+Transendothelial+Migration+of+Flowing+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).</li>
<li>Smith, C. W., Rothlein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+an+endothelial+determinant+for+CD+18-dependent+human+neutrophil+adherence+and+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration.</a> The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).</li>
<li>Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-leukocyte+adhesion+molecule-1-dependent+and+leukocyte+%28CD11%2FCD18%29-dependent+mechanisms+contribute+to+polymorphonuclear+leukocyte+adhesion+to+cytokine-activated+human+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium.</a> J. Immunol. 142 (7), (1989).</li>
<li>Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Each+step+during+transendothelial+migration+of+flowing+neutrophils+is+regulated+by+the+stimulatory+concentration+of+tumour+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+adhesion+and+communication%22%5BJournal%5D)">Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha.</a> Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).</li>
<li>Piali, L., Weber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+receptor+CXCR3+mediates+rapid+and+shear-resistant+adhesion-induction+of+effector+T+lymphocytes+by+the+chemokines+IP10+and+Mig%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig.</a> European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).</li>
<li>McGettrick, H. M., Smith, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+from+different+sites+may+promote+or+inhibit+recruitment+of+flowing+lymphocytes+by+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells.</a> European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).</li>
<li>McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+kinetics+of+migrating+T+cells+suggest+active+retention+by+endothelial+cells+with+continual+bidirectional+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration.</a> Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).</li>
<li>McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+differentially+regulate+neutrophil+and+lymphocyte+recruitment+through+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium.</a> Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).</li>
<li>Tull, S. P., Yates, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+Fatty+acids+and+inflammation%3A+novel+interactions+reveal+a+new+step+in+neutrophil+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment.</a> PLoS biology. 7 (8), e1000177(2009).</li>
<li>Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+D2+regulates+CD4%2B+memory+T+cell+trafficking+across+blood+vascular+endothelium+and+primes+these+cells+for+clearance+across+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium.</a> Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).</li>
<li>Bradfield, P. F., Amft, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+fibroblast-like+synoviocytes+overexpress+the+chemokine+stromal+cell-derived+factor+1+%28CXCL12%29%2C+which+supports+distinct+patterns+and+rates+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cell+migration+within+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue.</a> Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).</li>
<li>Filer, A., Parsonage, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+survival+of+leukocyte+subsets+mediated+by+synovial%2C+bone+marrow%2C+and+skin+fibroblasts%3A+site-specific+versus+activation-dependent+survival+of+T+cells+and+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils.</a> Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).</li>
<li>Lally, F., Smith, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+neutrophil+recruitment+in+a+coculture+model+of+the+rheumatoid+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium.</a> Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).</li>
<li>Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro.+model+for+analysing+neutrophil+migration+into+and+away+from+the+sub-endothelial+space%3A+Roles+of+flow+and+CD31%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31.</a> Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).</li>
<li>Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Pathology+of+Atherosclerosis+Smooth+Muscle+Cells+Prime+Cocultured+Endothelial+Cells+for+Enhanced+Leukocyte+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion.</a> Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).</li>
<li>Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+regulate+neutrophil+recruitment+by+glomerular+endothelial+cells+via+IL-6-mediated+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk.</a> Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).</li>
<li>Parsonage, G., Filer, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+address+code+defined+by+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">A stromal address code defined by fibroblasts.</a> Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).</li>
<li>Luu, N. T., McGettrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+mesenchymal+stem+cells+and+endothelial+cells+leads+to+downregulation+of+cytokine-induced+leukocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment.</a> Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).</li>
<li>Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-leukocyte+adhesion+molecules+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease.</a> Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).</li>
<li>Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endothelial+cell+surface+factor%28s%29+induced+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro.</a> 136 (12), 4548-4553 (1986).</li>
<li>Burton, V. J., Butler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+of+migrating+leukocytes+by+the+basement+membrane+deposited+by+endothelial+cells+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture.</a> Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).</li>
<li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD31+Regulates+Direction+and+Rate+of+Neutrophil+Migration+over+and+under+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells.</a> Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).</li>
<li>McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+stromal+cells+on+lymphocyte+adhesion+and+migration+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells.</a> Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).</li>
<li>Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+and+dynamic+assays+of+cell+adhesion+relevant+to+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature.</a> Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).</li>
<li>Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+effects+of+stromal+cells+on+the+migration+of+lymphocytes+into+and+through+inflamed+tissue+using+3-D+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models.</a> Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Aquí se describen los dos modelos &quot;in vitro&quot; en vasculares para estudiar el reclutamiento de neutrófilos circulantes por endotelio inflamado. Una gran ventaja de estos modelos es la capacidad de analizar cada paso en la cascada de adhesión de leucocitos en orden, como ocurriría in vivo. Hemos observado anteriormente un aumento dependiente de la dosis en la adhesión de neutrófilos y la transmigración a través de TNF estimulada CE 9,29. También describimos cómo ambos modelos se puede...

La inflamación es una respuesta protectora a la infección microbiana o la lesión del tejido que requiere una estrecha regulación de la entrada de leucocitos y salida de el tejido inflamado para permitir la resolución 1,2. Cross-talk entre las células endoteliales (CE) que los vasos sanguíneos línea, leucocitos circulantes y las células del estroma residente de tejidos es esencial para coordinar este proceso 3. Sin embargo, la contratación incontrolado de leucocitos y su limpieza ineficaz de apuntalan el desarrollo de enfermedades inflamatorias crónicas 4. Nuestra comprensión actual de reclutamiento de leucocitos en la salud y la enfermedad es incompleta y se necesitan modelos más robustos para analizar este proceso. Los mecanismos de apoyo el reclutamiento de leucocitos de la sangre a través de CE vascular en las vénulas post-capilares han sido bien descritos 1,2,5. Leucocitos circulantes son capturados por los receptores especializados (por ejemplo, VCAM-1, E-selectina, P-selectina), queestán reguladas por el endotelio inflamado. Estas interacciones transitorias permiten leucocitos interactuar con quimiocinas unidas a la superficie y mediadores derivados de lípidos (ya sea endoteliales o estroma en origen) que activan las integrinas expresadas por los leucocitos 6- 11. Esto a su vez estabiliza la adhesión y la migración de las unidades a través del endotelio y en el tejido 12- 15. Dentro del tejido, reclutados leucocitos se someten a los agentes derivado del estroma que influyen en su motilidad, la función y supervivencia 16,17. La creciente evidencia sugiere que las señales recibidas en cada etapa de las condiciones del proceso de reclutamiento de leucocitos para la próxima. Sin embargo, nuestra comprensión de reclutamiento de leucocitos sigue siendo incompleta y muy poco se sabe sobre el movimiento de leucocitos componentes conformación dentro del tejido. En Birmingham hemos desarrollado varios modelos in vitro &quot;vasculares&quot; para estudiar el reclutamiento de leucocitos defluir 9,18,19. Ahora entendemos que vascular acto CE reguladores como inmediatos de reclutamiento de leucocitos en respuesta a los cambios en su microambiente local. Específicamente, las células del estroma de tejido residente pueden regular activamente la respuesta inflamatoria, en parte por conversar con vecinos CE vascular para influir en su papel en el reclutamiento 3. Hemos demostrado anteriormente que las diversas células del estroma modulan la capacidad de CE para apoyar la adhesión y migración de leucocitos en un tejido de manera específica, y que estos efectos se vuelven alterada en enfermedades crónicas 13,16,20,21. Así, las células del estroma de tejido establecen &#39;de direcciones códigos&#39; que definen el contexto de cada respuesta inflamatoria 22. Más recientemente, hemos demostrado que la médula ósea derivada MSC (BMMSC) potentemente regular a la baja la respuesta de la CE a las citoquinas, lo que lleva a una reducción en el reclutamiento de neutrófilos y linfocitos 23. Los mecanismos govreclutamiento sejo de dilucidado in vitro han utilizado en gran medida ensayos que incorporan un solo tipo de células (por ejemplo, CE) o la proteína aislada. Sin embargo, estos estudios no tienen en cuenta los efectos del entorno local de los tejidos (es decir, la presencia de células del estroma) en el reclutamiento de leucocitos y su posterior migración en el tejido. Aquí se describen dos métodos basados ​​en el flujo en el que las células del estroma, específicamente las células madre mesenquimales (MSC), somos co-cultivadas con CE 23. Estos modelos nos permiten examinar el efecto de las células del estroma en las respuestas endoteliales, en particular su capacidad para apoyar el reclutamiento de leucocitos de flujo.

<table><tbody><tr><td>Colagenasa Tipo Ia</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>Diluir en 10 ml de PBS para obtener una concentración final de 10 mg/ml. Almacenar a -20 & grados; C en alícuotas de 1 ml.</td></tr><tr>PBS <td>Sigma</td><td>D8662</td> <td>de Dulbecco</td><td>Con cloruro de calcio y magnesio. Manténgalo estéril y guárdelo en RT.</td></tr><tr><td>1X Medio M199</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td>Cálido en 37 &deg; C Baño de agua antes de usar.</td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td>Conservar a 4 &deg;C. Añadir a M199 Frasco de 500 ml.</td></tr><tr><td>factor de crecimiento epidérmico humano</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Tienda en -20 &deg; C en 10 y micro; l alícuotas.</td></tr><tr><td>Suero fetal de ternera (FCS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>FCS debe ser probado por lotes para asegurar el crecimiento y la viabilidad de la CE aislada. Inactivación por calor a 56 °C. Almacenar en alícuotas de 10 ml a -20 °C.</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td>Potente y se vuelve tóxico en una semana, por lo que el medio HUVEC completo y fresco debe reponerse cada semana. Almacenar a -20 &deg; C en alícuotas de 1 ml.</td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td>El stock está en etanol. Almacenar a -20 &deg; C en 10 y micro; l alícuotas.</td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo II</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td>Diluir el caldo en PBS hasta una concentración final de 100 mg/ml. Almacenar a -20 & grados; C en 100 y micro; l alícuotas.</td></tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>Sigma</td><td>H3631</td><td>Diluir el stock en PBS hasta una concentración final de 20.000 U/ml. Almacenar a -20 & grados; C en 100 y micro; l alícuotas.</td></tr><tr><td>100 y micro; Filtro de células m para tubo de centífugo de 50 ml</td><td>Scientific Lab Supplies (SLS)</td><td>352360</td><td>También se pueden utilizar otros filtros de células disponibles en el mercado (por ejemplo, Greiner bio-one).</td></tr><tr><td>DMEM baja glucosa</td><td>Biosera</td><td>LM-D1102/500</td><td>Warm en 37 &deg; C Baño de agua antes de usar.</td></tr><tr><td>Mezcla de penicilina/estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Tienda a -20 &deg; C en alícuotas de 1 ml.</td></tr><tr><td>Matraz de cultivo de tejidos de 25 cc</td><td>SLS 353109</td><td></td><td></td></tr><tr><td>matraz de cultivo de tejidos de 75 cc</td><td>SLS</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de células madre mesenquimales de médula ósea</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Almacenar en nitrógeno líquido a su llegada. Las celdas están en el pasaje 2 a su llegada, pero están designadas como pasaje 0. Explique al pasaje 3 y almacene en nitrógeno líquido para su uso posterior.</td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células madre mesenquimales (MSCGM)</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>Warm in 37 &deg; C Baño de agua antes de usar. Para la tinción Cell Tracker Green, use medio sin FCS.</td></tr><tr><td>Solución EDTA (0.02%)</td><td>Sigma</td><td>E8008</td><td>Almacene a 4 &deg;C. Caliente en 37 &deg; C Baño de agua antes de usar.</td></tr><tr><td>Solución de tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4424</td><td>Tienda a -20 &deg; C en alícuotas de 2 ml. Descongele en RT y úselo inmediatamente.</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Greiner bio-one</td><td>2019-02</td><td>Mantener en hielo antes de agregar antes de agregar la suspensión celular.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty Contenedor de congelación</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>Tienda en RT. Al agregar crioviales con células, almacene a -80 & grados; C durante 24 horas antes de transferir las células a nitrógeno líquido.</td></tr><tr><td>Ibidi u-Slide VI (0.4), tratamiento T/C, estéril</td><td>Ibidi</td><td>IB-80606</td><td>Los modelos alternativos incluyen capilares de vidrio, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), placas BioFlux (www.fluxionbio.com/bioflux/) y cámaras de flujo de placas paralelas GlycoTech (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).</td></tr><tr><td>Rastreador celular tinte verde Life</td><td>technologies</td><td>C2925</td><td>Tienda en 5 y micro; l alícuotas a -20 ° C. Diluir en 5 ml precalentado (a 37 ° C; C) MSCGM.</td></tr><tr><td>Cámaras de recuento de células</td><td>Nexcelom</td><td>SD-100</td><td>Alternativamente, se puede utilizar un hemocitómetro.</td></tr><tr><td>Celómetro auto T4 contador de células</td><td>Nexcelom</td><td>Auto T4-203-0238</td><td></td></tr><tr><td>Factor de necrosis tumoral y alfa; (TNF&alfa;)</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA-100</td><td>Diluir el stock en PBS hasta una concentración final de 100.000 U/ml. Almacenar a -80 & grados; C en 10 y micro; l alícuotas.</td></tr><tr><td>6 pocillos, 0,4 y micro; m Filtros PET Transwell</td><td>SLS</td><td>353090</td><td></td></tr><tr><td>K2-EDTA en tubos de 10ml</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>Store en RT.</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Almacenar a 4 &deg;C. Calentar a RT antes de usar.</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Almacenar a 4 &deg;C. Calentar a RT antes de usar.</td></tr><tr><td>Tubo de fondo redondo de 10 ml</td><td>Appleton Woods</td><td>SC211 142 AS</td><td></td></tr><tr><td>7.5% BSA Fracción V solución</td><td>Life technologies</td><td>15260-037</td><td>Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>20 ml Jeringas Plastipak</td><td>BD falcon</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Jeringas Plastipak</td><td>BD falcon</td><td>302187</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Jeringas Plastipak</td><td>BD falcon</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>3M cinta quirúrgica hipoalergénica 9 m x 2,5 cm</td><td>Micropore</td><td>1530-1</td><td>Utilícelo para fijar el grifo de la jeringa en la pared de la cámara de metacrilato.</td></tr><tr><td>Tubo de caucho de silicona, diámetro interno/diámetro externo (ID/OD) de 1/3 mm (tubo delgado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB68854</td><td>Corte el tubo de silicona al tamaño adecuado. Todos los tubos que conducen directamente a la microválvula electrónica deben ser delgados.</td></tr><tr><td>Tubo de caucho de silicona ID/OD de 2/4 mm (tubo grueso)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB68855</td><td></td></tr><tr><td>Portex Blue Line Tubo manómetro</td><td>Smiths</td><td>200/495/200</td><td>Tubo que conduce a la bomba de jeringa.</td></tr><tr><td>Llave de paso de 3 vías</td><td>BOC Ohmeda AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Jeringa de 50 ml para bomba</td><td>Popper Micromate 550962</td><td></td><td>Debe cebarse antes de su uso eliminando las burbujas de aire.</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Raymond A Lamb</td><td></td><td>26 x 76 mm cubreobjetos hechos por encargo. Número de lote 2440980.</td></tr><tr><td>Corte</td><td></td><td></td><td>una pieza de parafilm de 26 x 76 mm con una plantilla de aluminio y corte una ranura de 20 x 4 mm con un bisturí 10a. El grosor de la junta es de aproximadamente 133 &micro;m.</td></tr><tr><td>Dos placas paralelas de metacrilato Wolfson</td><td>Applied Technology Laboratory</td><td></td><td>Cámara especialmente diseñada que consta de placas paralelas unidas por 8 tornillos. La placa inferior tiene una ranura de visualización recortada en el medio y un hueco poco profundo fresado para dejar espacio para el cubreobjetos, el filtro y la junta. La placa superior de metacrilato tiene un orificio de entrada y salida colocado sobre el canal de flujo.</td></tr><tr><td>Microválvula electrónica de 3 vías con espacio muerto mínimo</td><td>Lee Products Ltd.</td><td>LFYA1226032H</td><td>Conectado electrónicamente a una fuente de alimentación de CC de 12 voltios.</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa para infusión/extracción (PHD2000)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2001</td><td>Ajuste el diámetro a 29 mm y la tasa de llenado (flujo).</td></tr><tr><td>Conector en forma de L</td><td>Labhut</td><td>LE876</td><td>Para acoplar a los puertos de entrada y salida en el canal de microcorredera Ibidi.</td></tr><tr><td>Cámara de vídeo</td><td>Qimaging</td><td>01-QIC-F-M-12-C</td><td>Conectada a un ordenador que permite grabar vídeos digitales.</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td>Media Cybernetics</td><td>41N70000-61592</td><td>Para el análisis de datos. Etiquete manualmente las celdas mostrando los diferentes comportamientos. Células de seguimiento para el análisis de las velocidades de rodadura y migración.</td></tr><tr><td colspan="4">Consulte las hojas de datos del producto para obtener detalles sobre los peligros de usar los reactivos descritos aquí.</td></tr></tbody></table>

el análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de flujo

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Las células del estroma regulan el reclutamiento de leucocitos circulantes durante la inflamación a través de la diafonía con células endoteliales vecinas. Aquí se describen los dos modelos &quot;in vitro&quot; en vasculares para estudiar el reclutamiento de neutrófilos circulantes de flujo por las células endoteliales inflamadas. Una gran ventaja de estos modelos es la capacidad de analizar cada paso en la cascada de adhesión de leucocitos en orden, como ocurriría in vivo. También describimos cómo ambos modelos se pueden adaptar para estudiar el papel de las células del estroma, en este caso las células madre mesenquimales (MSC), en la regulación de reclutamiento de leucocitos. Células endoteliales primarias se cultivaron solas o junto con MSC humano en contacto directo en microportaobjetos ibidi o en lados opuestos de un filtro Transwell durante 24 horas. Los cultivos se estimularon con factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) durante 4 horas y se incorporan en un ensayo de adherencia basado en el flujo. Un bolo de neutrófilos se perfundiósobre el endotelio durante 4 min. La captura de fluir neutrófilos y sus interacciones con el endotelio fue visualizado por microscopía de contraste de fase. En ambos modelos, la estimulación de citoquinas-aumento del reclutamiento de neutrófilos endotelial que fluyen de una manera dependiente de la dosis. Análisis del comportamiento de los neutrófilos reclutados mostró una disminución dependiente de la dosis en la rodadura y un aumento dependiente de la dosis en la transmigración a través del endotelio. En co-cultivo, MSC suprimida la adhesión de neutrófilos al endotelio TNF estimulada. Nuestros modelos de adhesión basados ​​en el flujo imitan las fases iniciales de reclutamiento de leucocitos de la circulación. Además de leucocitos, pueden usarse para examinar el reclutamiento de otros tipos de células, como las células tumorales circulantes MSC o administrados terapéuticamente. Nuestros modelos de co-cultivo de varias capas han demostrado que el MSC se comunica con el endotelio de modificar su respuesta a las citoquinas pro-inflamatorias, Altering el reclutamiento de neutrófilos. Se requiere investigación adicional utilizando dichos modelos para entender completamente las células estromales de la forma de diferentes tejidos y condiciones (trastornos inflamatorios o cáncer) influyen en el reclutamiento de leucocitos durante la inflamación.

Inicialmente, se analizó el efecto de estimular la CE con TNFa en el reclutamiento de neutrófilos de flujo utilizando el modelo microportaobjetos ibidi (Sección 7-9). En ausencia de TNF, poco o ningún neutrófilos se adhirieron a la monocapa endotelial (Figura 2A). Esto se esperaba, ya que sin tratar / descansando CE no expresan las moléculas necesarias de adhesión (selectinas) o quimiocinas para apoyar la unión 25,26. En contraste, la estimulación por citoquinas aumentó signi...

La capacidad del endotelio inflamado para reclutar leucocitos de flujo se regula por las células estromales mesenquimales. Se describen dos modelos in vitro que incorporan células humanas primarias que se pueden utilizar para evaluar el reclutamiento de neutrófilos de flujo y examinar el papel que las células estromales mesenquimales desempeñan en la regulación de este proceso.

El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar cómo las células residentes en el tejido influyen en la capacidad de las células endoteliales vasculares para favorecer el reclutamiento de leucocitos durante la inflamación. Esto se logra primero estableciendo cultivos mixtos de células endoteliales con células madre mesenquimales utilizando uno de dos modelos vasculares in vitro: el modelo de portaobjetos microscópico y el modelo de filtro. Luego, estos cultivos se tratan con citocina antes del ensayo de flujo. El sistema de flujo basado en aian se ensambla luego paso a paso, con modificaciones realizadas según el sistema modelo que se utilice. El paso final consiste en perfundir leucocitos sobre las células endoteliales y observar su reclutamiento a partir del flujo, así como su comportamiento posterior. En última instancia, estos ensayos de adhesión basados en flujo y multicelulares han demostrado que la comunicación entre células madre mesenquimales y células endoteliales suprime el reclutamiento de neutrófilos durante la inflamación.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del tráfico de leucocitos, como por ejemplo, ¿cómo modifican este proceso las

analyzing-effects-stromal-cells-on-recruitment-leukocytes-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un ensayo basado en flujo laminar para caracterizar la interacción de leucocitos y socios celulares como las células endoteliales. Este método proporciona información dinámica sobre la adhesión, la muerte y la transmigración de los leucocitos cuando se perfunden sobre una capa intacta y confluente de células vasculares.

Ensayo basado en flujo laminar para estudiar las interacciones entre los leucocitos y las células endoteliales

El video muestra un método para investigar el impacto de las células estromales en el reclutamiento de leucocitos. En un modelo de cámara de flujo de placas paralelas, las citocinas proinflamatorias inducen la expresión de receptores de adhesión por parte de las células endoteliales, lo que facilita el reclutamiento y la migración de neutrófilos. La diafonía entre las células estromales y las células endoteliales disminuye el reclutamiento de neutrófilos a las células endoteliales.

Una investigación de flujo in vitro del efecto de las células estromales en el reclutamiento de leucocitos

El dispositivo de cámara de flujo tridimensional es una...

Un dispositivo de cámara de flujo tridimensional Novel para el Estudio de quimioquinas-dirigida extravasación de células circulantes en condiciones de flujo fisiológicas

El reclutamiento de leucocitos en el hígado se produce dentro de los canales especializados de los sinusoides hepáticos que se alinean por las células endoteliales sinusoidales hepáticas únicas. Microscopía de contraste de fase de reclutamiento de leucocitos a través del endotelio sinusoidal hepático humano en condiciones de tensión de cizallamiento fisiológica puede facilitar la elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a este proceso.

Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

A continuación, presentamos un protocolo que permite al investigador evaluar la dinámica de reclutamiento de leucocitos ex vivo mediante la conexión de una cámara recubierta con moléculas de adhesión endoteliales derivado al sistema circulatorio de un ratón. Este método ofrece ventajas significativas ya que permite la evaluación de leucocitos en condiciones biológicas relativas.

La evaluación de las interacciones leucocito-endotelio en condiciones de flujo en un Ex Vivo Ensayo Autoperfused Cámara Microflow

Se presenta una estrategia para analizar cuantitativamente los datos histológicos en la médula ósea. La microscopía confocal de células marcadas con fluorescencia en secciones de tejido da como resultado imágenes bidimensionales, que se analizan automáticamente. Los análisis de colocalización de diferentes tipos de células se comparan con los datos de imágenes simuladas, lo que proporciona información cuantitativa sobre las interacciones celulares.

Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Aquí, presentamos un protocolo integrado que mide la subpoblación de monocito tráfico bajo flujo in vitro por el uso de marcadores de superficie específicos y microscopía de fluorescencia confocal. Este protocolo puede utilizarse para explorar medidas de reclutamiento secuencial así como a otros subtipos de leucocitos usando otros marcadores de superficie específicos del perfil.

Estudio simultáneo de la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo In Vitro

Las células de la zona marginal B (MZBs) responden a la fuerza de esquileo del flujo por reorientar su ruta de migración el flujo. Este protocolo muestra cómo grabar y analizar la migración utilizando una unidad de fluidos, bomba, sistema de proyección de imagen del microscopio y software libre.

Análisis de cortante inducida por el flujo de migración de las células B de zona Marginal de Murine In Vitro

En este protocolo, se emplea un ensayo biomimético de microfluidos, que puede reproducir un entorno microvascular fisiológicamente relevante y reproducir toda la cascada de adhesión/migración de leucocitos, para estudiar las interacciones leucocitarios-células endoteliales en la enfermedad inflamatoria.

Un sistema microfisiológico para estudiar la interacción leucocitario-endotelial durante la inflamación

Aquí, describimos un protocolo simple para el aislamiento y tinción de células murinas de médula ósea para fenotipo de células madre hemopoyéticas y progenitoras junto con las células madre endoteliales y mesenquimales de nicho de soporte. También se incluye un método para enriquecer las células ubicadas en las áreas endosteal y central de la médula ósea.

Análisis por citometría de flujo de células madre y progenitoras hematopoyéticas de médula ósea murina y células de nicho estromal

Aprende a analizar el reclutamiento de leucocitos en modelos de flujo in vitro usando células endoteliales y mesenquimales. Este método revela cómo las células del estroma modulan la inflamación vascular.

El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

Explorar más videos