Generación de células madre adiposas Humano a través Desdiferenciación de adipocitos maduros en culturas de techo
7 de marzo de 2015
Los adipocitos maduros pueden representar una fuente abundante de células madre a través de la desdiferenciación, lo que conduce a una población homogénea de células similares a los fibroblastos. La digestión de la colagenasa se utiliza para aislar los adipocitos maduros de la grasa humana. El objetivo de nuestro protocolo es obtener células grasas multipotentes y desdiferenciadas a partir de adipocitos maduros humanos.
Los depósitos maduros tienen la capacidad de diferenciarse en células precursoras in vitro. Esto se logra mediante el cultivo en sello, una técnica en la que las células maduras se cultivan en un frasco completamente lleno de medio y se cultivan boca abajo. Las células flotantes se adhieren al frasco y cambian su morfología, pasando de una célula redonda llena de lípidos a una célula alargada similar a un fibroblasto. Homogéneo.
Pueden obtenerse y procesarse poblaciones de células alargadas tras la recepción de muestras de tejido en el laboratorio. Pese los tejidos adiposos, según la cantidad de adipocitos necesarios, y coloque un volumen adecuado de muestra en un tubo de 50 ml. Tras la digestión, se puede esperar obtener aproximadamente 1 millón de células por gramo de tejido.
Los cultivos en placa se realizan con 500.000 células por matraz de 25 centímetros y 50.000 células para cada pocillo de una placa de seis pocillos; añada tampón KRH de trabajo suplementado con colagenasa, pique el tejido con tijeras e incube la preparación a 37 grados Celsius durante 45 minutos. Durante la incubación, prepare el montaje de tubos y jeringa. Vierta la solución translúcida a través de una malla de nylon en un vaso de plástico con pinzas.
Frote la preparación celular a través de la malla y lávela con cinco ml de tampón KRH de trabajo suavemente. Transfiera la suspensión celular filtrada a un tubo de 50 ml con sistema de jeringa. Deje reposar los adipocitos maduros durante aproximadamente 10 minutos.
Las células alcanzarán la parte superior del tampón por flotación. Aspire lentamente el tampón desde la parte inferior. Utilizando una jeringa y tubo, agregue 20 ml de tampón KRH de trabajo para lavar.
Repita los pasos de lavado dos veces. Recopile el tampón para llevar la suspensión de adipocitos a un volumen final de cinco ml y proceda a contar las células utilizando un hemocitómetro; llene un frasco T 25 hasta tres cuartas partes de su volumen con D-M-E-M-F 12 suplementado con 20% de suero de ternera, transfiera 500.000 adipocitos maduros al frasco. Complete el volumen del frasco con medio y elimine las burbujas de aire de la superficie superior.
Enrosque una tapa inventada al frasco. Incube el frasco boca abajo durante una semana en una incubadora de cultivo celular con 5% de dióxido de carbono. Evite mover el frasco, ya que las burbujas residuales podrían alterar la adherencia celular.
Coloque un cubreobjetos en la parte inferior de los pocillos. Añada el casquillo de plástico en el pocillo y llene el pocillo con ocho ml de medio. Asegúrese de que no haya burbujas.
Coloque un cubreobjetos sobre el casquillo, dejando un espacio para insertar la punta de su pipeta. Tome una muestra de 50.000 células e injéctelas colocando la punta entre el cubreobjetos y el casquillo. Incube la placa en una incubadora de cultivo celular con 5% de dióxido de carbono durante una semana o menos.
Según el diseño del experimento, se necesitan al menos tres días para que las células se adhieran al cubreobjetos en una placa diferente. Incubar los cubreobjetos en dos mililitros de medio. En cultivos continuos, los cubreobjetos pueden fijarse luego en formalina para experimentos de inmunofluorescencia o para extracciones de D-N-A-R-N-A y proteínas.
La desdiferenciación de adipocitos maduros provoca cambios importantes en la morfología celular. Durante este proceso, los adipocitos pierden su fenotipo y disminuyen la expresión de transcritos generalmente asociados con su función de almacenamiento de lípidos. Esta imagen de inmunofluorescencia representa células adiposas en diversos estados de desdiferenciación.
Las células con morfología redondeada aún expresan FABP cuatro, un marcador de adipocito maduro, mientras que las células alargadas ya no lo expresan según la literatura. Las células grasas diferenciadas, a menudo llamadas células grasas D, se pueden obtener de pacientes jóvenes, mayores, delgados o con base OB. Su capacidad de cultivo a largo plazo y su demostrada multivalencia.
Me gusta también su potencial para la ingeniería de tejidos y la terapia celular. Podrían representar un nuevo modelo para la investigación específica posterior de la fisiología del adipocito.
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Resumen
Este estudio explora la desdiferenciación de adipocitos maduros en células madre pluripotentes. Mediante el uso de digestión con colagenasa y técnicas de cultivo en sello, los investigadores pueden aislar y cultivar estas células para obtener una población homogénea de células similares a fibroblastos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación con células madre
- Biología del adipocito
- Técnicas de cultivo celular
Antecedentes
- Los adipocitos maduros pueden desdiferenciarse en células precursoras.
- Este proceso puede realizarse in vitro utilizando métodos específicos de cultivo.
- El aislamiento de adipocitos es crucial para obtener células madre.
- La digestión con colagenasa es un método estándar para el aislamiento celular.
Objetivo del estudio
- Obtener células grasas multipotentes y desdiferenciadas a partir de adipocitos maduros humanos.
- Establecer un protocolo para aislar y cultivar estas células.
- Investigar los cambios morfológicos durante la desdiferenciación.
Métodos Utilizados
- Digestión con colagenasa para aislar adipocitos maduros.
- Técnica de cultivo sellado para promover la desdiferenciación.
- Evaluación de la morfología celular para confirmar la desdiferenciación.
- Cuantificación del rendimiento celular basada en el peso del tejido.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de aproximadamente 1 millón de células por gramo de tejido adiposo.
- Las células dediferenciadas exhibieron una morfología alargada similar a la de los fibroblastos.
- Se obtuvieron poblaciones homogéneas de células mediante los métodos descritos.
- Se demostró el potencial de los adipocitos maduros como fuente de células madre.
Conclusiones
- Los adipocitos maduros pueden convertirse eficazmente en células madre pluripotentes.
- Los métodos descritos proporcionan un enfoque confiable para la investigación de células madre.
- Este estudio contribuye al entendimiento de la plasticidad de los adipocitos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La desdiferenciación de adipocitos maduros en células madre pluripotentes ofrece una fuente novedosa para aplicaciones en medicina regenerativa e ingeniería de tejidos. Este enfoque permite la caracterización específica de depósitos de la función de los adipocitos y sus propiedades metabólicas, apoyando la validación de dianas en la investigación de enfermedades metabólicas. El método proporciona una plataforma escalable para generar células con morfología similar a la de fibroblastos y con pluripotencialidad demostrada, facilitando el desarrollo de modelos preclínicos y la reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento de terapias centradas en adipocitos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de la plasticidad de los adipocitos y la comprobación de hipótesis terapéuticas en las vías de enfermedades metabólicas.
- Valor operativo: Proporciona un sistema reproducible para la validación funcional de objetivos mediante el aislamiento de adipocitos específicos de cada depósito.
- Valor científico: Apoya la confianza predictiva al generar poblaciones homogéneas de células dediferenciadas para la aclaración de vías.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante técnicas estandarizadas de digestión con colagenasa y cultivo en techo.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante un rendimiento controlado de adipocitos (aproximadamente 1 millón de células por gramo de tejido).
- Valor científico: Permite la evaluación confiable de compuestos utilizando células de tipo fibroblasto con la regulación negativa confirmada de FABP4 como marcador de desdiferenciación.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya el desarrollo de sistemas relevantes para la enfermedad, destinados a la investigación específica de la fisiología de los adipocitos.
- Valor operativo: Asegura la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la capacidad de cultivo a largo plazo de las células grasas dediferenciadas.
- Valor científico: Facilita la toma de decisiones sobre avances ajustados al riesgo al demostrar la multipotencialidad y el potencial de ingeniería tisular de las células D-grasas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y los estudios preclínicos, particularmente para programas de enfermedades metabólicas y medicina regenerativa.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la reducción del riesgo biológico mediante la modelización de la dediferenciación de adipocitos in vitro.
- Tamizaje: Ofrece preparación para ensayos y resultados cuantitativos mediante el aislamiento estandarizado de células y la evaluación de la morfología.
- Análisis: Proporciona lecturas mensurables, como cambios en la expresión de FABP4, para comparar estados de dediferenciación bajo distintas condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la demostración del cultivo a largo plazo y la multipotencialidad de los adipocitos dediferenciados.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para generar células madre derivadas de adipocitos en múltiples investigaciones específicas de depósitos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista en el cambio de fenotipo de adipocitos.
- Valor operativo: Normalización y escalabilidad mediante protocolos definidos de digestión con colagenasa y cultivo invertido.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance/no avance al permitir la caracterización específica por depósito de propiedades metabólicas antes de la optimización del fármaco líder.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo mediante la evaluación validada del rendimiento de células madre y su potencial de diferenciación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de adipocitos primarios y en técnicas de digestión con colagenasa.
- Necesita una infraestructura de cultivo celular capaz de mantener cultivos en posición invertida en matraces o placas de 6 pocillos.
- Exige una estandarización entre equipos para lograr un rendimiento constante de adipocitos y una evaluación uniforme de la dediferenciación en distintos laboratorios.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicar el protocolo a tejido adiposo procedente de diferentes depósitos o con características distintas de los donantes.
- Presenta limitaciones prácticas, como la necesidad de llenar con precisión los medios para evitar la formación de burbujas que interrumpan el cultivo invertido.
