Autoensamblaje de formas bidimensionales complejas de una sola hebra de ADN Azulejos

El objetivo general del siguiente experimento es formar nanoestructuras complejas de ADN con mosaicos monocatenarios. Esto se logra mezclando hebras de ADN sintético cuidadosamente diseñadas en la solución tampón deseada para formar la nanoestructura de ADN deseada como segundo paso. La muestra es un arrodillado durante el cual se lleva a cabo el autoensamblaje de la estructura.

A continuación, se realiza una electroforesis en gel de agros nativos y un microscopio de fuerza atómica para verificar la formación exitosa de las nanoestructuras. Los resultados muestran nanoestructuras de ADN autoensambladas basadas en agros nativos, electroforesis en gel e imágenes de microscopio de fuerza atómica. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la preparación de la muestra de tal autoensamblaje parecía ser complicada: antes de comenzar este procedimiento, obtuve hebras de componentes de ADN de secuencias específicas disueltas en ARN, agua libre de un fabricante de oligonucleótidos en placas de 96 pocillos Vbo, pipeteo un microlitro de cada uno de los 362 pocillos para las 24 hélices por 28 vueltas.

Rectángulo: agregue 100 micromolares por hebra en un tubo de ensayo de dos mililitros. Luego agregue 138 microlitros de agua destilada desionizada al tubo de ensayo para hacer una solución madre. A una concentración de 200 nano molares por hebra.

Agregue 50 microlitros de la solución madre de 200 ano molares, 10 microlitros de 10 x tampón de recocido A y 40 microlitros de agua destilada desionizada a un tubo de PCR de 0,2 mililitros. A continuación, se tomó una muestra durante 17 horas en un termociclador que se enfrió de 90 a 25 grados centígrados.

Después de preparar un gel nativo de 2%agros preteñido con SYBR safe, hágalo funcionar durante dos horas a 100 voltios en un baño de agua helada. Cuando termine, tome una imagen del gel usando un escáner de gel con un filtro apropiado para la tinción segura SYBR en un transluminador de luz azul, extirpe la banda dominante con una movilidad similar a la banda de 1,500 pares de bases de la escalera de ADN de una kilobase usando una hoja de afeitar limpia y afilada. Coloque las piezas de gel deseadas en una columna de centrifugación y luego triture el gel en piezas finas con un microtubo Pele, luego centrifugue a 438 G durante tres minutos a cuatro grados centígrados.

Después de la centrifugación. Mida la concentración del ADN utilizando un espectrofotómetro ultravioleta a 260 nanómetros. En este punto, retire la MICA unida a un disco metálico de muestra con cinta adhesiva para obtener una superficie plana y coloque un disco de muestra en la platina de imágenes del microscopio.

Agregue 40 microlitros de una x y un tampón de rodillas A seguido de cinco microlitros de la muestra purificada de las 24 HELOC por un rectángulo de 28 vueltas a la superficie de Micah recién escindida. Deje que la mezcla se asiente durante aproximadamente dos minutos. Instale un chip en voladizo de nitrito de silicio FM A en un soporte de voladizo, imagine la muestra en el modo de golpeteo de fluido utilizando un tamaño de escaneo de dos micrómetros, 1024 líneas para la resolución.

Y una velocidad de escaneo de 0,5 a un hercio para el etiquetado interno adjunto a tres segmentos principales de 17 nucleótidos a ocho mosaicos internos y seis mosaicos de límite del rectángulo. Mezcle las 28 hebras con asas con el resto de las hebras componentes de las 24 HELOC en un rectángulo de 28 vueltas para hacer una solución madre de 200 NANOMOLAR para el etiquetado de límites. Mezclar las 14 hebras con asas con el resto de las hebras componentes de los 24 heel seas por 28 vueltas rectángulo para obtener una solución de stock de 200 Nanomolar para el etiquetado interno.

Para el etiquetado del límite, agregue 50 microlitros de la solución madre de 200 nanomolares. 60 microlitros de las 100 hebras antimango modificadas con biotina de 100 micromolares. 10 microlitros de 10 x tampón de recocido A y 34 microlitros de agua destilada desionizada en el tubo de ensayo de PCR A.

Para el etiquetado interno, agregue 50 microlitros de la solución madre de 200 nanomolares. Tres microlitros de la hebra interna anti mango de biotina modificada a 100 micromolares. 10 microlitros de 10 x tampón de recocido A y 37 microlitros de agua destilada desionizada a un tubo de ensayo de PCR.

A continuación, pesa 0,06 gramos de formiato urinario en tres mililitros de agua destilada. Para preparar una solución acuosa de formiato de urinario al 2%, filtre la solución de tinción con un filtro de 0,2 microlitros conectado a la jeringa. Agregue cinco microlitros de cinco hidróxidos de sodio normales a un mililitro de la solución de tinte filtrada.

Después de un breve vórtice de la solución centrífuga a 20.000 G de brillo. Descargue las rejillas recubiertas de carbono con el lado recubierto hacia arriba utilizando los siguientes ajustes: Cuando termine, pipetee 3,5 microlitros de muestra en la rejilla tratada con descarga incandescente. Después de cuatro minutos, use un trozo de papel de filtro para absorber la muestra poniendo el papel de filtro en contacto con la rejilla desde el lado.

A continuación, añada inmediatamente 3,5 microlitros de la solución de tinte a la rejilla. Después de un minuto, absorbe la mancha y sostén el papel de filtro contra la rejilla durante uno o dos minutos. Transfiera la rejilla a un portamuestras TEM.

Una imagen utilizando A-J-E-O-L GM 1400, operada a 80 kilovoltios con un aumento que oscila entre 10 K y 80 K. Una vez identificada la forma, seleccione las hebras que corresponden a la forma en el lienzo molecular. Reemplace el dominio expuesto con un segmento Poly T, de 10 a 11 nucleótidos de largo, o agregue un protector de borde que sea complementario al dominio expuesto y termínelo con un segmento Poly T largo de 10 a 11 nucleótidos. Para evitar la agregación, cree una biblioteca de hebras para el lienzo molecular de 310 píxeles, que incluye el corsé.

Conjunto de una estrella, conjunto de dos estrellas, juego de tres estrellas y conjunto de cuatro estrellas para dar un total de 1.344 protectores de bordes. Después de centrifugar las placas de 96 pocillos para los diferentes conjuntos, pipetee un microlitro de 206 hebras del conjunto central, cero del conjunto, una estrella cero del conjunto, dos estrellas cero del conjunto, tres estrellas y 24 hebras del conjunto de cuatro estrellas en un tubo de centrífuga de dos mililitros. Agregue 20 microlitros de agua destilada desionizada al tubo para hacer una solución madre de 400 nanomolares de las hebras de ADN.

A continuación, agregue 50 microlitros de la solución madre de 400 nanomolares, 10 microlitros de 10 x tampón de recocido B y 40 microlitros de agua destilada desionizada a un tubo de PCR de 0,2 mililitros y mezcle la mezcla en el termociclador durante 17 horas como se describió anteriormente. Después de purificar la muestra y medir la imagen de concentración de ADN, la muestra que usa un FM de la misma manera que antes de cuatro finalmente construye rectángulos de diferentes tamaños simplemente alterando el número de heoc paralelos y el número de vueltas helicoidales.

El autoensamblaje de baldosas monocatenarias producirá 24 HELOC por 28 vueltas: las secuencias de ADN rectangulares para las diferentes baldosas monocatenarias se pueden modificar y optimizar para permitir la división por estreptococos y el etiquetado de la transformación de un rectángulo en un tubo. El autoensamblaje programable de baldosas de una sola hebra para formar tubos y rectángulos de diferentes tamaños y la construcción de formas arbitrarias bidimensionales utilizando el diseño de sustitución de dominio de lona molecular y el diseño de protector de bordes se probaron como soluciones a la agregación a lo largo de dominios expuestos de formas arbitrarias. Ambos diseños tienen un rendimiento de gel e integridad estructural comparables, pero el diseño del protector de bordes es más rentable ya que requiere menos especies auxiliares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer nanoestructuras complejas de ADN basadas en mosaicos de una sola hebra.