Autoensamblaje de formas bidimensionales complejas de una sola hebra de ADN Azulejos

El objetivo general del siguiente experimento es formar nanoestructuras de ADN complejas mediante baldosas de cadena sencilla. Esto se logra mezclando hebras sintéticas de ADN cuidadosamente diseñadas en una solución tampón adecuada para formar la nanoestructura de ADN deseada como un segundo paso. La muestra se incuba durante el cual tiene lugar el autoensamblaje de la estructura.

A continuación, se realiza una electroforesis en gel de agarosa nativa y se obtienen imágenes mediante microscopía de fuerza atómica para verificar la formación exitosa de las nanoestructuras. Los resultados muestran que las nanoestructuras de ADN se autoensamblaron según lo confirmado por electroforesis en gel de agarosa nativa e imágenes de microscopía de fuerza atómica. Generalmente, las personas nuevas en este método experimentarán dificultades porque la preparación de muestras de este tipo de autoensamblaje parece complicada. Antes de iniciar este procedimiento, obtenga las cadenas de componentes de ADN con secuencias especificadas disueltas en agua libre de ARN de un fabricante de oligonucleótidos en placas Vbo de 96 pocillos; pipetee un microlitro de cada uno de los 362 pocillos para las 24 hélices por 28 vueltas.

Añada 100 micromolar por cadena en un tubo de ensayo de dos mililitros. Luego, añada 138 microlitros de agua destilada desionizada al tubo de ensayo para obtener una solución stock. A una concentración de 200 nanomolar por cadena.

Agregue 50 microlitros de la solución madre de 200 anos molar. 10 microlitros de tampón de hibridación 10 x A y 40 microlitros de agua destilada desionizada a un tubo de PCR de 0,2 mililitros. A continuación, incube una muestra durante 17 horas en un termociclador con enfriamiento de 90 a 25 grados Celsius.

Después de preparar un gel nativo de agarosa al 2 % preteñido con SYBR Safe, eléctroforesíselo durante dos horas a 100 voltios en un baño de hielo y agua. Una vez finalizada la electroforesis, visualice el gel utilizando un escáner de geles con un filtro adecuado para la tinción con SYBR Safe en un transiluminador de luz azul, y corte la banda dominante con movilidad similar a la banda de 1 500 pares de bases de la escalera de ADN de un kilobase utilizando una cuchilla limpia y afilada. Coloque los fragmentos de gel deseados en una columna giratoria y luego tritúrelos en trozos finos usando un Pele de microtubo; a continuación, centrifugue a 438 ×g durante tres minutos a cuatro grados Celsius.

Tras la centrifugación, mida la concentración del ADN utilizando un espectrofotómetro ultravioleta a 260 nanómetros. En este punto, retire la MICA adherida a un disco metálico de muestra usando cinta adhesiva para obtener una superficie plana y coloque el disco de muestra sobre la platina de imagen del microscopio.

Añada 40 microlitros de un tampón X y buffer A seguido de cinco microlitros de la muestra purificada de los 24 HELOCs mediante 28 vueltas rectangulares a la superficie frescamente escindida de Micah. Deje que la mezcla repose durante aproximadamente dos minutos. Instale un chip de palanca en cantiléver de nitruro de silicio de A FM en un soporte de palanca e imagine la muestra en modo de tanteo en fluido utilizando un tamaño de escaneo de dos micrómetros con 1024 líneas para la resolución.

Y una velocidad de barrido de 0,5 a un hercio para la marcación interna unida a un segmento interno de 17 nucleótidos a ocho baldosas internas y seis baldosas de borde del rectángulo. Mezcle los 28 filamentos con manijas con el resto de los filamentos componentes de los 24 HELOCs mediante un rectángulo de 28 giros para obtener una solución stock de 200 nanomolares para la marcación de borde. Mezcle los 14 filamentos con manijas con el resto de los filamentos componentes de los 24 HELOCs mediante un rectángulo de 28 giros para obtener una solución stock de 200 nanomolares para la marcación interna.

Para la etiquetado del borde, agregue 50 microlitros de la solución stock de 200 nanomolar, 60 microlitros de las cadenas modificadas con biotina de 100 micromolar, 10 microlitros de tampón de hibridación 10 x A y 34 microlitros de agua destilada desionizada a un tubo de PCR.

Para la marcación interna, agregue 50 microlitros de la solución stock de 200 nanomoles. Tres microlitros de la cadena modificada con biotina anti-handle interna a 100 micromoles. 10 microlitros de tampón de hibridación 10 x A y 37 microlitros de agua destilada desionizada a un tubo de PCR.

A continuación, pese 0,06 gramos de formiato de uranilo en tres mililitros de agua destilada. Para preparar una solución acuosa de tinción al 2% de formiato de uranilo, filtre la solución de tinción utilizando un filtro de 0,2 microlitros acoplado a la jeringa. Añada cinco microlitros de hidróxido de sodio 5 N a un mililitro de la solución de tinción filtrada.

Después de agitar brevemente la solución, centrifugar a 20.000 G. Descargue las rejillas recubiertas de carbono con el lado recubierto hacia arriba utilizando los siguientes parámetros. Cuando finalice, pipetee 3,5 microlitros de muestra sobre la rejilla tratada con descarga de resplandor. Después de cuatro minutos, use un trozo de papel de filtro para eliminar la muestra por capilaridad, poniendo en contacto el papel de filtro con la rejilla desde un lado.

A continuación, agregue inmediatamente 3,5 microlitros de la solución de tinción sobre la rejilla. Después de un minuto, retire la tinción mediante una punta de papel de filtro y mantenga el papel contra la rejilla durante uno o dos minutos. Transfiera la rejilla a un portamuestras para TEM.

Una imagen utilizando A-J-E-O-L GM 1400, operado a 80 kilovoltios con un aumento que varía de 10 K a 80 K. Una vez identificada la forma, seleccione los filamentos que correspondan a la forma en el lienzo molecular. Reemplace el dominio expuesto con un segmento de poli T, de 10 a 11 nucleótidos de longitud, o agregue un protector de borde complementario al dominio expuesto y termínelo con un segmento de poli T de 10 a 11 nucleótidos de longitud. Para prevenir la agregación, cree una biblioteca de filamentos para el lienzo molecular de 310 píxeles, que incluya el corsé.

Establezca un conjunto estrella, dos conjuntos estrella, tres conjuntos estrella y cuatro conjuntos estrella para obtener un total de 1.344 protectores de borde. Después de centrifugar las placas de 96 pocillos para los diferentes conjuntos, pipetee un microlitro de 206 cadenas del conjunto principal, cero del conjunto uno estrella, cero del conjunto dos estrella, cero del conjunto tres estrella y 24 cadenas del conjunto cuatro estrella en un tubo centrífugo de dos mililitros. Añada 20 microlitros de agua destilada desionizada al tubo para obtener una solución madre de 400 nanomolar de las cadenas de ADN.

A continuación, agregue 50 microlitros de la solución stock de 400 nanomoles. 10 microlitros de tampón de hibridación 10 x B y 40 microlitros de agua destilada desionizada a un tubo de PCR de 0,2 mililitros y mezcle en el ciclador térmico durante 17 horas según se describió previamente. Después de purificar la muestra y medir la concentración de ADN, image la muestra utilizando un microscopio de fuerza en la misma forma que antes, y finalmente construya rectángulos de diferentes tamaños modificando simplemente el número de hebras paralelas y el número de giros helicoidales.

La autoensamblaje de baldosas de cadena simple producirá un rectángulo de 24 HELOCs por 28 vueltas. Las secuencias de ADN para las diferentes baldosas de cadena simple pueden modificarse y optimizarse para permitir la división estreptavidina y la marcación, así como la transformación de un rectángulo en un tubo. La autoensamblaje programable de baldosas de cadena simple para formar tubos y rectángulos de tamaños variables, y la construcción de formas arbitrarias bidimensionales utilizando el lienzo molecular, se evaluaron mediante el diseño por sustitución de dominios y el diseño de protectores de bordes como soluciones a la agregación en dominios expuestos de formas arbitrarias. Ambos diseños presentan rendimiento en gel e integridad estructural comparables, pero el diseño de protectores de bordes es más económico, ya que requiere menos especies auxiliares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo elaborar nanoestructuras de ADN complejas basadas en baldosas de cadena sencilla.