Name: Autoensamblaje de formas bidimensionales complejas de una sola hebra de ADN Azulejos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprende a construir nanoestructuras complejas de ADN mediante autoensamblaje de azulejos de una sola hebra. Este protocolo detalla la preparación de muestras, electroforesis en gel de agarosa nativo e imagen por microscopía de fuerza atómica para verificar la formación estructural.

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Este trabajo fue financiado por la Oficina del Premio Programa Investigador Naval de Investigación Joven N000141110914 de la Oficina de Investigación Naval de Grant N000141010827, NSF CARRERA Premio CCF1054898, Nueva Innovator Award 1DP2OD007292 del Director NIH y un Instituto Wyss de inspiración biológica Ingeniería Fondo inicio Facultad (PY) y Centro de Ciencias de la Vida Fondo de inicio (para PC) Tsinghua-Pekín.

1. Secuencia de ADN Diseño <ol><li> Utilice el software UNIQUIMER 27 de diseñar una estructura SST-finito, especificando el número de hélices dobles, longitudes de hélice superior e inferior para cada doble hélice, y el patrón cruzado para crear un lienzo 24H × 28T. Después de definir estos parámetros, la arquitectura general (capítulo composición y el arreglo complementariedad) se ilustra gráficamente en el programa. </li><li> Generar secuencias para las hebras de la estructura especificada para satisfacer la disposición de la complementariedad y los requisitos adicionales (si los hay). Diseño de secuencias de ADN, reduciendo al mínimo la simetría secuencia de 28 (para la mayoría de las estructuras). <ol><li> Generar nucleótidos (A, C, G y T) al azar, uno por uno. </li><li> Nucleótidos partido complementarias a las generadas siguiendo la regla de apareamiento de bases: de A a T y viceversa; C y G, y viceversa. </li><li> No utilice segmentos que se repiten más de ocho o nueve nucleótidos. Cuando tal representantecomer segmentos surgen durante el diseño, mutar los nucleótidos más recientemente generados hasta el requisito de repetir segmentos está satisfecho. </li><li> No utilice cuatro bases consecutivas A, C, G o T. </li><li> Utilice nucleótidos pre-especificados en los puntos de enlace de cadena sencilla (por ejemplo, T y G como el vigésimo primer y vigésimo segundo nucleótidos, respectivamente, para la mayoría de las cadenas) para evitar deslizamiento bases alrededor de los puntos de enlace (por ejemplo, si ambos XXI y vigésimo segundo nucleótidos fueron T, fue posible para el vigésimo primer nucleótido se una al de nucleótidos que el vigésimo segundo nucleótido se supone que se unen a). </li></ol></li><li> Modificar secuencias de ADN manualmente para el etiquetado de estreptavidina, la transformación de los rectángulos en tubos, la formación de diferentes rectángulos y tubos a través de diferentes escalas, y para evitar la agregación causada por los dominios expuestos en SST. <ol><li> Reemplace los dominios expuestos en el límite del lienzo molecular con poli-T tracts. </li><li> Para el etiquetado de estreptavidina, el diseño de los segmentos de la manija (el segmento adicional añadido a la cadena componente que puede unirse a un homólogo complementario tal como una hebra anti-mango) tales que puedan acomodar una hebra anti-mango con 3 &#39;modificación biotina. </li><li> Para la conversión de un rectángulo en un tubo, quite las filas superior e inferior del rectángulo y insertar una nueva fila cuya TSM tienen complementariedad específica a las baldosas correspondientes en la segunda fila superior de la segunda a la fila inferior. </li><li> Para un dominio de una sola hebra expuesta de diferentes formas, reemplace con segmentos de poli-T de 10 a 11 nucleótidos de longitud, o cubrir por protectores de bordes que son complementarias al dominio expuesto y terminan con unos 10-11 nucleótidos largos segmentos de poli-T. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de las Lienzo Molecular <ol><li> Obtener hebras de componentes de ADN de secuencias especificados disueltos en agua libre de RNasa de una oligonucleotide fabricante en V de fondo placas de 96 pocillos con oligonucleótidos sintetizados en una escala de 10 nmol con desalado estándar. Centrifugar las placas de 96 pocillos con las hebras de ADN de aproximadamente 10 s a 600 x g. <ol><li> Pipetear 1 l de cada uno de los 362 pozos con hebras de ADN para la 24H × 28T rectángulo (Figura 3A) a 100 mM por filamento (especificación del fabricante) en un tubo de ensayo 2 ml. Añadir 138 l de H destilada desionizada 2 O al tubo de 2 ml de prueba para hacer una disolución madre de la mezcla de hebra a una concentración de 200 nM por filamento. </li></ol></li><li> Añadir 50 l de la solución 200 nM de stock de mezcla hebra, 10 l de tampón 10X de recocido A (50 mM Tris, pH 7,9, EDTA 10 mM, 250 mM de MgCl 2), y 40 l de H destilada desionizada 2 O a un 0,2 tubo ml PCR. Esto hace que una muestra de 100 l de la lona molecular en tampón de hibridación 1X A (5 mM Tris, pH 7,9, EDTA 1 mM, 25 mM de MgCl 2). </li><li> Recocer el sample durante 17 horas en un termociclador de enfriamiento de 90 ° C a 25 ° C. Programa el termociclador de la siguiente manera: la rampa hacia abajo desde 90 ° C a 61 ° C a una velocidad constante de 5 min por ° C; la rampa hacia abajo desde 60 ° C a 25 ° C a una velocidad constante de 20 min por ° C; y se incuba a 4 ° C hasta que la muestra se puede sacar del ciclador térmico. </li><li> Preparar un 2% gel de agarosa nativo. <ol><li> Mida 2,4 g de agarosa en un vaso de precipitados de 600 ml. Añadir 120 ml de tampón TBE 0,5X (44,5 mM Tris-Borato, pH 8,3, EDTA 1 mM) y 30 ml de agua desionizada destilada al vaso de precipitados. </li><li> Microondas durante 3 minutos (o 40 - 60 seg más después de la ebullición). Reponer el agua perdida durante la evaporación mediante la adición de 30 ml de agua, lo que ayuda a mantener la concentración de agarosa en el gel a 2%. </li><li> Agitar el contenido del vaso de precipitados durante 1 min en un baño de agua fría. Añadir 1 ml de 1,2 M de MgCl2 (para hacer una concentración 2 mM MgCl 10 en el gel) y pre-manchan el ingenio de gelh 6 l de tinte SYBR Seguro (1: 20.000). </li><li> Vierta la solución de gel en una caja de gel seco e inserte un 1,5 mm de espesor 12 y peine de electroforesis en gel. Dejar solidificar el gel de 15 a 30 minutos sobre una plataforma aún. </li><li> Verter tampón de gel de rodadura (44,5 mM Tris-Borato, pH 8,3, EDTA 1 mM, y 10 mM de MgCl 2) en el cuadro de gel. Cargar 2-3 l de escalera de ADN de 1 kb en un pozo del gel de agarosa. Mezclar 4 l de 6X colorante azul de bromofenol (0,25% azul de bromofenol, 5 mM Tris, EDTA 1 mM, 10 mM de MgCl 2 y 30% de glicerol) con 20 l de la muestra de la tela molecular y cargar la solución en otro pozo de la gel de agarosa. </li></ol></li><li> Ejecute el nativo de agarosa al 2% durante 2 horas a 100 V en un baño de agua con hielo (azul de bromofenol, se muestra en azul, corre más rápido que hebras de componentes para que pueda servir como un indicador de que si el tiempo de 2 horas de funcionamiento es apropiado). </li><li> Image gel usando un escáner de gel con un filtro apropiado para la tinción de seguro SYBR (Figura 2B </strong&gt;). </li><li> En un transiluminador de luz azul, extirpar la banda dominante con movilidad similar a la banda de 1500 pares de bases de la escalera de ADN de 1 kb utilizando una hoja de afeitar limpia agudo. Coloque la pieza de gel deseada (s) en una columna de centrifugación y luego aplastar el gel en trozos finos utilizando un mortero microtubo. Centrifugar a 438 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Medir la concentración del ADN utilizando un espectrofotómetro de ultravioleta a 260 nm. <ol><li> Utilice 2 l de DNasa ultrapura / agua destilada RNasa libre como blanco para calibrar la máquina. </li><li> Use un volumen equivalente de la muestra obtenida de la columna de centrifugación para obtener una estimación de la concentración de ADN. El valor medido de concentración (&quot;a&quot; = ng / l) obtenido en una absorción UV de 260 nm ayudará a determinar el factor de dilución para AFM e imágenes TEM. </li><li> Convertir la concentración medida de &quot;a&quot; (ng / l) a &quot;b&quot; (nM) siguiendo b = a × 10 6 / (330 y# 215; número de nucleótidos). NOTA: El peso molecular de un nucleótido es 330 g / mol. El valor de la concentración molar calculada determinará el factor de dilución para el AFM y TEM de imágenes. Como para el caso de un 24H × 28T rectángulo, la medición común para la muestra purificada es de alrededor de 10 a 60 ng / l. Como el número de nucleótidos para una estructura de este tipo es 14.616 Da, la concentración molar es de aproximadamente de 2 - 12 nM. La concentración final se determina por el rendimiento de recogida (~ 20 - 50%) a partir de la centrifugación y el volumen de la banda de gel escindió a cabo (cuanto mayor sea el volumen, más diluir la muestra purificada). </li></ol></li></ol> 3. Microscopía de Fuerza Atómica Imaging <ol><li> Despegar mica unida a un disco metálico muestra usando cinta adhesiva para obtener una superficie plana y coloque la platina en el escenario de imágenes. </li><li> Añadir 40 l de tampón de hibridación 1X A seguido de 5 l (2 - 5 nM) de la muestra purificada de la 24H × 28Trectángulo a la superficie de mica recién escindida. Dejar que la mezcla se asiente durante aproximadamente 2 min. </li><li> Instalar AFM chip de voladizo de nitruro de silicio sobre un soporte en voladizo. Utilice una punta triangular C (frecuencia de resonancia, f 0 = 40 a 75 kHz; primavera constante, k = 0,24 Nm -1) para obtener imágenes. </li><li> Imagen de una muestra en el modo de líquidos penetrantes. Utilice los siguientes parámetros de imagen para el escaneado: escanear tamaño de 2 m, 1.024 líneas de resolución, y una velocidad de barrido de 0,5 - 1 Hz (Figura 2C). </li><li> Si es necesario, añadir 10 l mM o solución más de 10 NiCl 2 para aumentar la fuerza de unión a ADN 29-mica. </li></ol> 4. Preparación de muestras para Estreptovidina etiquetado <ol><li> Diseñar manualmente el 24H × rectángulo 28T tal que hebras de mango en lugares específicos se incorporan a ser complementarias a las hebras anti-mango con la modificación biotina, que a su vez son capaces de unirse a streptaviden concreto. <ol><li> Modificar el lienzo molecular uniendo un &quot;segmento de 17 nucleótidos 3 que consiste en una secuencia de dos nucleótidos (TT) como un espaciador y un mango 15-nucleótidos (GGAAGGGATGGAGGA) a los 14 azulejos en la fila superior y 14 azulejos en la parte inferior fila del rectángulo (Figura 3A) para etiquetar el límite. Esta secuencia es complementaria a una 3 &#39;biotina modificada hebra anti-mango (TCCTCCATCCCTTCC-biotina). </li></ol></li><li> Para el etiquetado interno, conecte el segmento 3 &#39;de nucleótidos 17 a 8 azulejos internos y 6 azulejos de contorno del rectángulo (Figura 4A). <ol><li> Mezclar las 28 hebras con asas (etiquetado límite) con el resto de las hebras de componentes de la 24H × rectángulo 28T (334 hebras) para hacer una solución madre de 200 nM. Mezclar las 14 hebras con asas de etiquetado (interna) con el resto de las hebras de componentes de la 24H × rectángulo 28T (348 hebras) para obtener una solución madre de 200 nM. </li></ol></li><li> Para boetiquetado undary, añadir 50 l de la solución madre de 200 nM de las hebras, 6 l de los 100 M biotina modificada anti-asa hebras, 10 l de la 10X recocido tampón A, y 34 l de agua desionizada destilada a un 0,1 a 0,2 tubo de ensayo ml PCR. La concentración final de la hebra componente es 100 nM y la concentración final de la hebra modificada anti-biotina mango es 6000 nM. Tenga en cuenta que 28 moléculas de la anti-biotina manejan modificado hebra se unen a un 24H × 28T rectángulo para la hebra anti-biotina manejar modificado es en exceso de 100% para hacer la unión favorable. </li><li> Para el etiquetado interno, añadir 50 l de la solución madre de 200 nM de los hilos, 3 l de la manija contra biotina cadena interna modificada en 100 M, 10 l de la memoria intermedia de recocido 10X A, 37 l de agua desionizada destilada a un 0,1 - tubo de ensayo de PCR de 0,2 ml. La concentración final de la hebra componente es 100 nM y la concentración final de la biotina anti-modifi mango<html> ed hebra es 3000 nM. Tenga en cuenta que 14 moléculas de la anti-biotina mango modificado hebra se unen a un 24H × 28T rectángulo de forma anti-biotina manejar hebra modificado es en exceso de 100% para hacer la unión favorable. </li><li> Recocer ambas muestras en un termociclador durante 17 horas siguiendo los pasos descritos en 2.3. </li><li> Preparar un 2% gel de agarosa nativo como se describe en los pasos 2.4. </li><li> Purificar ambas muestras como se describe en los pasos 2.5. </li><li> Medir las concentraciones de las estructuras de ADN deseadas como se describe en los pasos 2.6. </li></ol> 5. Microscopía de Fuerza Atómica para el etiquetado de estreptavidina <ol><li> Image cada muestra utilizando un AFM como se describe en el paso 3 (Figuras 3B y 4B). </li><li> Después de la primera ronda de formación de imágenes, añadir 40 l de tampón de hibridación 1X A seguido de 1 l de estreptavidina a 10 mg / ml a la muestra. Dejar que la mezcla se asiente durante aproximadamente 2 minutos antes de volver a generar imágenes (Figuras 3C y 4C). </li></ol>_title &quot;&gt; 6. La conversión de un rectángulo en un tubo <ol><li> Con el fin de diseñar un tubo basado en el rectángulo, mantenga todas las TSM componentes en lugar excepto las filas superior e inferior. Introducir una nueva fila cuya TSM están diseñados mediante la concatenación de los superiores e inferiores medias tejas de sus respectivas columnas para ciclar el rectángulo original en una conformación de tubo (Figura 5A). </li><li> Mezclar la nueva fila de hilos (14 hebras) con las hebras de componentes de la 24H x 28T rectángulo con exclusión de las filas superior e inferior (336 hebras) para obtener una solución madre de 200 nM. </li><li> Siga la purificación de gel pasos 2.2 a 2.7 (Figura 5B). </li></ol> 7. Microscopio Electrónico de Transmisión de Imágenes <ol><li> Pesar 0,06 g de formiato de uranilo en 3 ml de agua destilada para preparar una solución de formiato de mancha de uranilo acuoso al 2%. Filtrar la solución mancha formato de uranilo acuoso al 2% utilizando un filtro de 0,2 micras unida a una jeringa. <ol><li> Añadir 5 l de5 N NaOH a las 1 ml de solución de tinción se filtró. En resumen vórtice la solución y se centrifuga a 20.000 x g. </li></ol></li><li> Glow descargue las rejillas revestidas de carbono (frente a lado recubierto hacia arriba) con los siguientes valores: 25 mA, 45 s, 0,1 mbar, y negativo polaridad de alta tensión. </li><li> Utilice unas pinzas de cierre automático para tomar una rejilla tratado descargador resplandor del borde. </li><li> Pipetear 3,5 l de muestra sobre la rejilla durante 4 min. Use un pedazo de papel de filtro para absorber de la muestra por lo que el papel de filtro en contacto con la rejilla desde el lado. </li><li> Inmediatamente añadir 3,5 l de la solución de tinción sobre la rejilla durante 1 min. </li><li> Wick fuera de la mancha como en 7.4 y mantenga el papel de filtro contra la rejilla de 1 - 2 min. </li><li> La transferencia de la cuadrícula a un portamuestras TEM y la imagen utilizando un JEOL JEM-1400 operado a 80 kV con aumento que oscila entre 10 K y 80 K (Figura 5C). </li></ol> 8. La construcción de formas arbitrarias Uso del Molecular Lienzo <ol><li> Identificar una forma y seleccionar las hebras que corresponden a la forma en el lienzo molecular. Para una forma de triángulo por ejemplo, seleccione 206 out 362 hebras de la tela molecular. </li><li> Reemplazar el dominio expuesta (es decir, a lo largo de la hipotenusa del triángulo) con un segmento de poli-T 10 - 11 nucleótidos de largo (diseño 1 en la Figura 6A), o añadir un protector de borde que es complementaria a la de dominio expuesto y terminar con 10 - segmento de larga poli-T 11 nucleótidos (diseño 2 en la Figura 6A) para evitar la agregación. NOTA: Simplemente recocer las SST que corresponden a los píxeles del triángulo (sin utilizar hebras protector) dará lugar a la agregación y sin formación de banda de producto distinto en un gel. Utilice el diseño de protector de borde de diversas formas, ya que es más eficiente de los recursos; se requiere sólo cuatro conjuntos adicionales de hebras (Figura 6C) en comparación con 14 conjuntos adicionales en el diseño de reemplazo (Figure 6B). </li><li> Crear una biblioteca de cadena para el lienzo molecular 310 píxeles, que incluye el conjunto básico (el lienzo 362 SST), Set 1 * (protectores de bordes que se unen al dominio 1 de un SST), Set 2 * (protectores de bordes que se unen al dominio 2 de un SST), Set 3 * (protectores de bordes que se unen al dominio 3 de un SST) y Set 4 * (protectores de bordes que se unen al dominio 4 de un SST) para dar un total de 1.344 protectores de bordes. </li><li> Centrifugar las placas de 96 pocillos para los diferentes conjuntos de aproximadamente 10 s. Pipetear a cabo las hebras deseadas a partir de las placas con el fin de hacer una solución de stock para una cierta forma. <ol><li> Por la forma de un triángulo con protectores de bordes, pipeta 1 l de 206 hilos de la colección básica, 0 de conjunto 1 *, 0 de conjunto 2 *, 0 del conjunto 3 * y 24 hebras de conjunto 4 * en una centrífuga de 2 ml tubo. Añadir 20 l de agua desionizada destilada al tubo para hacer una solución de 400 nM de las hebras de ADN. </li></ol></li><li> Añadir 50 l de la solución 400 nM balance de stra ADN<html> nds, 10 l de la 10X tampón de reasociación B (50 mM Tris, pH 7,9, EDTA 10 mM, 125 mM de MgCl 2) stock solución y 40 l destilada desionizada H 2 O a un tubo de PCR de 0,2 ml. Esto hace que una muestra de 100 l del triángulo en 1X tampón de reasociación B (5 mM Tris, pH 7,9, EDTA 1 mM, 12,5 mM de MgCl 2) con los filamentos a una concentración de aproximadamente 200 nM por filamento. </li><li> Recocer la mezcla en un termociclador durante 17 horas como se describe en el paso 2.3. </li><li> Preparar un 2% en gel de agarosa nativa como se describe en el paso 2.4. </li><li> Se purifica la muestra como se describe en el paso 2.5. </li><li> Medir la concentración del ADN como se describe en el paso 2.6. </li><li> Image la muestra bajo AFM como se describe en el paso 3 (Figura 7C y 7D). </li><li> Recogida y mezclar hilos de diferentes formas utilizando la misma biblioteca hebra. Recocer las diferentes soluciones y combinar muestras purificadas de diferentes formas para ahorrar tiempo durante la exploración AFM. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 9 Opcional:. Robot Automatización de diseño de la forma y la mezcla líquida <ol><li> Utilice un programa de MATLAB personalizado para ayudar al diseño de formas complejas. </li><li> Utilice el software para entregar instrucciones en la forma de una secuencia de pipeteado a un robot manipulador de líquidos. Utilice el controlador de líquido robot para seleccionar y mezclar las hebras que constituyen la forma de destino. NOTA: diseño de la forma y el capítulo de mezcla fue automatizado para reducir los errores humanos y hacer uso intensivo de la construcción menos mano de obra. </li></ol> 10. Los rectángulos y Tubos través de diferentes escalas <ol><li> Construir diferentes rectángulos de tamaño (Figura 10), simplemente alterando el número de hélices paralelas (H) y el número de vueltas helicoidales (t). </li><li> Siga el paso 3 para un rectángulo de tamaño específico. </li><li> Siga el paso 6 para un tubo de tamaño específico. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran intereses financieros contrapuestos.

En la etapa de formación de la estructura, es importante mantener una concentración apropiada de cationes de magnesio (por ejemplo., 15 mM) en la mezcla de cadena de ADN a nanoestructuras de ADN se auto-ensamblan. Del mismo modo, en la etapa de caracterización del gel de agarosa / purificación, es importante para mantener una concentración de catión magnesio apropiado (por ejemplo., 10 mM) en el gel y el tampón de gel de funcionamiento para retener las nanoestructuras de ADN durante la electroforesis. ...

Ácido nucleico anterior trabajo de auto-ensamblaje 1-25 ha llevado a la construcción exitosa de una variedad de estructuras complejas, incluyendo el ADN 2 - 5,8,10 - 13,17,23 o ARN 7,22 3,4,7 periódica, 22 y algorítmica 5 bidimensionales enrejados, cintas 10,12 y tubos 4,12,13, cristales 3D 17, 11 y poliedros finitos, 2D shapes 7,8. Un método particularmente eficaz es andamiaje origami de ADN, por lo que una sola hebra andamio se pliega por muchas hebras cortas discontinuas auxiliares para formar una forma compleja 9,14 - 16,18 - 21,25. Recientemente hemos informado de un método para construir nanoestructuras discretos con formas 2D prescritos utilizando baldosas de cadena sencilla (SST), y demostramos estructuras con una complejidad comparable al origami de ADN 26. Esta article es una adaptación de nuestro trabajo anterior 26 y describe los protocolos detallados para la organización de TSM direccionables individualmente en sofisticadas formas 2D finitos con dimensiones precisamente prescritos (anchos y largos) y morfologías. Una ventaja clave del método de SST es su modularidad. Cada componente SST de una estructura sirve como unidad de construcción modular en la asamblea, y diferentes subconjuntos de estos TSM producir formas distintas. Por lo tanto, hemos establecido una plataforma general para la construcción de nanoestructuras con tamaños y formas prescritas de cortos, hebras de ADN sintético. TSM contienen cuatro dominios, cada 10 o 11 nucleótidos de largo (Figura 1A). Las TSM se unen de tal manera que sus hélices paralelas crean un entramado de ADN se mantienen unidos por enlaces cruzados. Cada cruce es el fosfato entre los dominios 2 y 3. El fosfato se estira artificialmente en los diagramas para mayor claridad visual. Las cruces están espaciados dos vueltas helicoidales (21 bases) aparte (&lt;strong&gt; Figura 1B). Los rectángulos compuestos se denominan por sus dimensiones en el número de hélices y vueltas helicoidales. Por ejemplo, un rectángulo que es de seis hélices de ancho y ocho helicoidal convierte tiempo es el referenciado como un 6H × 8T rectángulo. TSM se pueden dejar fuera, añadió, o de lo contrario reorganizado para crear estructuras de formas y tamaños (Figura 1C) arbitrarias. Por ejemplo, un diseño rectangular puede ser enrollado en un tubo con una longitud y radio deseado (Figura 1D). Alternativamente, el enrejado rectangular SST puede ser visto como un lienzo molecular compuestos de SST pixeles, cada 3 nm por 7 nm. En este estudio, utilizamos un lienzo molecular de 310 TSM internos de larga duración, 24 TSM de larga duración que constituyen los límites izquierdo y derecho, y 28 TSM medio de longitud que forman los límites superior e inferior. La lona tiene 24 hélices dobles enlaces por cruces y cada hélice contiene 28 vueltas helicoidales (294 bases) y por lo tanto se conoce comoun 24H × lienzo rectangular 28T. El 24H × lona 28T tiene un peso molecular similar a la de una estructura de origami de ADN creado a partir de un fago M13 andamio.

<table><tbody><tr><td>Hebras de ADN&nbsp;</td>Tecnología <td></td><td>de ADN integrada</td><td>Sección 3.1</td></tr><tr><td>SYBR Tinción de gel de ADN segura</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Sección 3.4.2</td></tr><tr><td>Freeze'N Squeeze Columnas de centrifugado de extracción de gel de ADN</td><td>BIO-RAD</td><td>731-6166</td><td>Sección 3.6</td></tr><tr><td>Sondas de palanca de nitruro afilado de Bruker</td><td>Sondas Bruker AFM</td><td>SNL10</td><td>Sección 4.3</td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Transiluminador de luz azul</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td>Sección 3.6</td></tr><tr><td>Centrífuga 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428 000.414</td><td>Sección 3.6</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión&nbsp;</td><td>Jeol</td><td>Jem 1400</td><td>Sección 7.4</td></tr><tr><td>Multimodo 8</td><td>Veeco</td><td></td><td>Sección 4</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9000 Escáner láser</td><td>GE Heathcare Life Sciences</td><td>28-9558-08</td><td>Sección 3.5</td></tr><tr><td>Agua destilada ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td>Sección 3.7.1</td></tr><tr><td>Disco de mica</td><td>Suministros SPI</td><td>12001-26-2</td><td>Sección 4.1</td></tr><tr><td>Disco de montaje de acero</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16218</td><td>Sección 4.1</td></tr><tr><td>Rejilla de cobre recubierta de carbono para TEM</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>FCF400-Cu</td><td>Sección 7.2</td></tr><tr><td>pinzas</td><td>Dumont</td><td>0203-N5AC-PO</td><td>Sección 7.31</td></tr><tr><td>Sistema de descarga incandescente</td><td>Quorum Technologies</td><td>K100X</td><td>Sección 7.2</td></tr><tr><td>Motor de ADN Tetrad 2 Termociclador Peltier</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC&ndash; 0240G</td><td>Sección 3.3</td></tr><tr><td>Owl Easycast B2 Mini Sistemas de electroforesis en gel</td><td>ThermoScientific</td><td>B2</td><td>Sección 3.4.3</td></tr><tr><td>Seekam LE Agarose 500G</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td>Sección 3.4.1</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Plus Escalera de ADN, lista para usar 75-20000bp</td><td>ThermoScientific</td><td>SM1333</td><td>Sección 3.4.4</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-vis Nanodrop 2000c</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td>Sección 3.7</td></tr><tr><td>Filtro de 0,2 mmm</td><td>Corning Inc.</td><td>431219</td><td>Sección 7.1.2</td></tr></tbody></table>

autoensamblaje de formas bidimensionales complejas de una sola hebra de adn azulejos

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Los métodos actuales en nanoarquitectura de ADN han diseñado con éxito una variedad de estructuras 2D y 3D utilizando principios de autoensamblaje. En este artículo, describimos protocolos detallados sobre cómo fabricar formas 2D sofisticadas a través del autoensamblaje de mosaicos de ADN monocatenario direccionables de manera única que actúan como píxeles moleculares en un lienzo molecular. Cada mosaico monocatenario (SST) es una hebra de ADN de 42 nucleótidos compuesta por cuatro dominios modulares concatenados que se unen a cuatro vecinos durante el autoensamblaje. El lienzo molecular es una estructura rectangular autoensamblada a partir de SST. Se forma una forma 2D compleja prescrita seleccionando los píxeles moleculares constituyentes (SST) de un lienzo molecular de 310 píxeles y luego sometiendo las hebras correspondientes a un recocido en un solo recipiente. Debido a la naturaleza modular del enfoque SST, demostramos la escalabilidad, versatilidad y robustez de este método. En comparación con los métodos alternativos, el método SST permite una selección más amplia de polímeros y secuencias de información mediante el uso de hebras cortas de ADN diseñadas y sintetizadas de novo.

El autoensamblaje de TSM (Figura 1) dará lugar a una 24H × 28T rectángulo, como se ilustra en la Figura 2. Secuencias de ADN para los diferentes TSM pueden ser modificados / optimizado para permitir el etiquetado de estreptavidina (Figura 3 y 4), la transformación de una rectángulo en un tubo (Figura 5), el autoensamblaje programable de TSM para formar tubos y rectángulos de diferentes tamaños (Figura 10), y la construc...

mosaico de ADN es un enfoque eficaz para crear nanoestructuras programables. Describimos los protocolos para construir formas bidimensionales complejas mediante el autoensamblaje de mosaicos de ADN monocatenario.

Autoensamblaje de formas bidimensionales complejas de una sola hebra de ADN Azulejos

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

El objetivo general del siguiente experimento es formar nanoestructuras de ADN complejas mediante baldosas de cadena sencilla. Esto se logra mezclando hebras sintéticas de ADN cuidadosamente diseñadas en una solución tampón adecuada para formar la nanoestructura de ADN deseada como un segundo paso. La muestra se incuba durante el cual tiene lugar el autoensamblaje de la estructura.A continuación, se realiza una electroforesis en gel de agarosa nativa y se obtienen imágenes mediante microscopía de fuerza atómica para verificar la formación exitosa de las nanoestructuras. Los resultados muestran que las nanoestructuras de ADN se autoensamblaron según lo confirmado por electroforesis en gel de agarosa nativa e imágenes de microscopía de fuerza atómica. Generalmente, las personas nuevas en este método experimentarán dificultades porque la preparación de muestras de este tipo de autoensamblaje parece complicada. Antes de iniciar este procedimiento, obtenga las cadenas de componentes de ADN con secuencias especificadas disueltas en agua libre de ARN de un fabricante de oligonucleótidos en placas Vbo de 96 pocillos; pipetee un microlitro de cada uno de los 362 pocillos para las 24 hélices por 28 vueltas.Añada 100 micromolar por cadena en un tubo de ensayo de dos mililitros. Luego, añada 138 microlitros de agua destilada desionizada al tubo de ensayo para obtener una solución stock. A una concentración de 200 nanomolar por cadena.Agregue 50 microlitros de la solución madre de 200 anos molar. 10 microlitros de tampón de hibridación 10 x A y 40 microlitros de agua destilada desionizada a un tubo de PCR de 0,2 mililitros. A continuación, incube una muestra durante 17 horas en un termociclador con enfriamiento de 90 a 25 grados Celsius.Después de preparar un gel nativo de agarosa al 2 % preteñido con SYBR Safe, eléctroforesíselo durante dos horas a 100 voltios en un baño de hielo y agua. Una vez finalizada la electroforesis, visualice el gel utilizando un escáner de geles con un filtro adecuado para la tinción con SYBR Safe en un transiluminador de luz azul, y corte la banda dominante con movilidad similar a la banda de 1 500 pares de bases de la escalera de ADN de un kilobase utilizando una cuchilla limpia y afilada. Coloque los fragmentos de gel deseados en una columna giratoria y luego tritúrelos en trozos finos usando un Pele de microtubo; a continuación, centrifugue a 438 ×g durante tres minutos a cuatro grados Celsius.Tras la centrifugación, mida la concentración del ADN utilizando un espectrofotómetro ultravioleta a 260 nanómetros. En este punto, retire la MICA adherida a un disco metálico de muestra usando cinta adhesiva para obtener una superficie plana y coloque el disco de muestra sobre la platina de imagen del microscopio.Añada 40 microlitros de un tampón X y buffer A seguido de cinco microlitros de la muestra purificada de los 24 HELOCs mediante 28 vueltas rectangulares a la superficie frescamente escindida de Micah. Deje que la mezcla repose durante aproximadamente dos minutos. Instale un chip de palanca en cantiléver de nitruro de silicio de A FM en un soporte de palanca e imagine la muestra en modo de tanteo en fluido utilizando un tamaño de escaneo de dos micrómetros con 1024 líneas para la resolución.Y una velocidad de barrido de 0,5 a un hercio para la marcación interna unida a un segmento interno de 17 nucleótidos a ocho baldosas internas y seis baldosas de borde del rectángulo. Mezcle los 28 filamentos con manijas con el resto de los filamentos componentes de los 24 HELOCs mediante un rectángulo de 28 giros para obtener una solución stock de 200 nanomolares para la marcación de borde. Mezcle los 14 filamentos con manijas con el resto de los filamentos componentes de los 24 HELOCs mediante un rectángulo de 28 giros para obtener una solución stock de 200 nanomolares para la marcación interna.Para la etiquetado del borde, agregue 50 microlitros de la solución stock de 200 nanomolar, 60 microlitros de las cadenas modificadas con biotina de 100 micromolar, 10 microlitros de tampón de hibridación 10 x A y 34 microlitros de agua destilada desionizada a un tubo de PCR.Para la marcación interna, agregue 50 microlitros de la solución stock de 200 nanomoles. Tres microlitros de la cadena modificada con biotina anti-handle interna a 100 micromoles. 10 microlitros de tampón de hibridación 10 x A y 37 microlitros de agua destilada desionizada a un tubo de PCR.A continuación, pese 0,06 gramos de formiato de uranilo en tres mililitros de agua destilada. Para preparar una solución acuosa de tinción al 2% de formiato de uranilo, filtre la solución de tinción utilizando un filtro de 0,2 microlitros acoplado a la jeringa. Añada cinco microlitros de hidróxido de sodio 5 N a un mililitro de la solución de tinción filtrada.Después de agitar brevemente la solución, centrifugar a 20.000 G. Descargue las rejillas recubiertas de carbono con el lado recubierto hacia arriba utilizando los siguientes parámetros. Cuando finalice, pipetee 3,5 microlitros de muestra sobre la rejilla tratada con descarga de resplandor. Después de cuatro minutos, use un trozo de papel de filtro para eliminar la muestra por capilaridad, poniendo en contacto el papel de filtro con la rejilla desde un lado.A continuación, agregue inmediatamente 3,5 microlitros de la solución de tinción sobre la rejilla. Después de un minuto, retire la tinción mediante una punta de papel de filtro y mantenga el papel contra la rejilla durante uno o dos minutos. Transfiera la rejilla a un portamuestras para TEM.Una imagen utilizando A-J-E-O-L GM 1400, operado a 80 kilovoltios con un aumento que varía de 10 K a 80 K. Una vez identificada la forma, seleccione los filamentos que correspondan a la forma en el lienzo molecular. Reemplace el dominio expuesto con un segmento de poli T, de 10 a 11 nucleótidos de longitud, o agregue un protector de borde complementario al dominio expuesto y termínelo con un segmento de poli T de 10 a 11 nucleótidos de longitud. Para prevenir la agregación, cree una biblioteca de filamentos para el lienzo molecular de 310 píxeles, que incluya el corsé.Establezca un conjunto estrella, dos conjuntos estrella, tres conjuntos estrella y cuatro conjuntos estrella para obtener un total de 1.344 protectores de borde. Después de centrifugar las placas de 96 pocillos para los diferentes conjuntos, pipetee un microlitro de 206 cadenas del conjunto principal, cero del conjunto uno estrella, cero del conjunto dos estrella, cero del conjunto tres estrella y 24 cadenas del conjunto cuatro estrella en un tubo centrífugo de dos mililitros. Añada 20 microlitros de agua destilada desionizada al tubo para obtener una solución madre de 400 nanomolar de las cadenas de ADN.A continuación, agregue 50 microlitros de la solución stock de 400 nanomoles. 10 microlitros de tampón de hibridación 10 x B y 40 microlitros de agua destilada desionizada a un tubo de PCR de 0,2 mililitros y mezcle en el ciclador térmico durante 17 horas según se describió previamente. Después de purificar la muestra y medir la concentración de ADN, image la muestra utilizando un microscopio de fuerza en la misma forma que antes, y finalmente construya rectángulos de diferentes tamaños modificando simplemente el número de hebras paralelas y el número de giros helicoidales.La autoensamblaje de baldosas de cadena simple producirá un rectángulo de 24 HELOCs por 28 vueltas. Las secuencias de ADN para las diferentes baldosas de cadena simple pueden modificarse y optimizarse para permitir la división estreptavidina y la marcación, así como la transformación de un rectángulo en un tubo. La autoensamblaje programable de baldosas de cadena simple para formar tubos y rectángulos de tamaños variables, y la construcción de formas arbitrarias bidimensionales utilizando el lienzo molecular, se evaluaron mediante el diseño por sustitución de dominios y el diseño de protectores de bordes como soluciones a la agregación en dominios expuestos de formas arbitrarias. Ambos diseños presentan rendimiento en gel e integridad estructural comparables, pero el diseño de protectores de bordes es más económico, ya que requiere menos especies auxiliares.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo elaborar nanoestructuras de ADN complejas basadas en baldosas de cadena sencilla.

self-assembly-complex-two-dimensional-shapes-from-single-stranded-dna

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Investigación

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