Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón
22 de diciembre de 2014
Aprovechando una estrategia genética binaria, proporcionamos un protocolo detallado para el rastreo de circuitos neuronales en ratones que expresan trazadores transsinápticos complementarios después de la recombinación mediada por Cre. Debido a que la producción de trazadores específicos de células está codificada genéticamente, nuestro enfoque experimental es adecuado para estudiar la formación y maduración de circuitos neuronales durante el desarrollo del cerebro embrionario murino a una resolución de una sola célula.
El objetivo del siguiente experimento es visualizar el desarrollo de circuitos neuronales en el cerebro embrionario de ratón utilizando tres sistemas distintos de etiquetado celular mediante el uso de un trazador transsináptico que viaja bidireccionalmente, un segundo marcador que viaja solo de manera retrógrada y una tercera etiqueta que no viaja desde la célula objetivo. Es posible identificar la neurona objetivo, las neuronas ascendentes y las neuronas descendentes. Los resultados demuestran que este protocolo experimental se puede utilizar para analizar la formación de circuitos neuronales en el cerebro embrionario de ratón hembra con una resolución de una sola célula.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia del desarrollo, como cuándo se forman circuitos neuronales específicos y cómo se organizan durante el desarrollo embrionario. Este método también se puede utilizar para rastrear circuitos neuronales en ratones adultos. Específicamente, se puede utilizar para analizar la actividad sináptica entre neuronas identificadas genéticamente, y se puede usar para analizar cómo diferentes condiciones experimentales pueden modular un circuito neuronal a lo largo del tiempo.
Comience con una rata embarazada recién sacrificada. Limpie el lado ventral de su abdomen con etanol al 70% y luego haga una incisión vertical para exponer los embriones. Retire la cadena de embriones y transfiéralos a un plato de PBS helado en el plato.
Extraiga los embriones individuales con pinzas desafiladas. Separe los embriones individuales en solución con tijeras finas y pinzas, eliminando el tejido adicional en el proceso cuando los embriones estén completamente limpios. Tome una pequeña biopsia de cola de cada embrión y colóquela en un tubo de tampón de lisis para recolectar ADN para la identificación de género y el genotipado.
A continuación, transfiera el embrión a un 4% de PFA recién hecho con hielo. Después de procesar cada embrión, déjelos incubar en el PFA con agitación durante al menos 1,5 horas, dependiendo de su tamaño. Cuando se complete la incubación.
Lave los pañuelos fijos tres veces con PBS helado durante al menos cinco minutos por lavado. A continuación, transfiera los embriones a una solución de sacarosa al 30%, mantenida a cuatro grados centígrados. Cuando los tejidos estén completamente hundidos en la solución, proceda con la criosección.
Primero, comience etiquetando un molde criogénico con un marcador permanente resistente al alcohol. A continuación, prepare una suspensión de hielo seco picado en etanol al 100% en una cubitera utilizando la suspensión para enfriar un vaso de precipitados de vidrio de pentano isop durante unos 10 minutos. Mientras espera, retire los pañuelos de la solución de sacarosa y limpie el exceso de sacarosa con una toallita de laboratorio estándar.
A continuación, transfiera el tejido a un molde criogénico preetiquetado. Con suficiente OCT para cubrir el tejido. No forme burbujas de aire en la OCT, especialmente alrededor del tejido.
A continuación, oriente el tejido con pinzas de entomología de peso pluma para causar un daño mínimo. Congele los moldes criogénicos en el baño de iso pentano enfriado sin causar salpicaduras si es necesario. Los moldes congelados se pueden envolver y almacenar a menos 80 grados centígrados para seccionar los moldes.
Córtelos en secciones seriales de 14 micras de grosor en series de cinco. Recoja cada serie de cinco rebanadas en un portaobjetos de súper escarcha más vidrio. Al preparar la solución para este protocolo, asegúrese de agregar el tween 20 lentamente al tampón TNT, que debe prepararse fresco.
A continuación, enjuague la solución hacia arriba y hacia abajo lentamente para mezclar. Al preparar el tampón TNB, agregue el reactivo de bloqueo lentamente en pequeños incrementos mientras agita. Luego caliente la solución a 55 grados centígrados usando un baño de agua.
La solución se volverá lechosa. Ahora, para comenzar a trabajar en los tejidos, primero use un bisturí para eliminar el exceso de OCT que rodea las secciones de tejido. A continuación, marca los límites de cada sección con un bolígrafo de Papanicolaou.
Deje que los portaobjetos alcancen la temperatura ambiente. A continuación, lávelos a temperatura ambiente con un tampón XPBS, tres veces cada lavado debe durar cinco minutos. A continuación, apague la actividad de la peroxidasa endógena incubando los portaobjetos durante media hora en peróxido de hidrógeno al 0,3% en metanol helado.
Siga esto con tres lavados en PBS a temperatura ambiente durante cinco minutos por lavado. A continuación, incubar los portaobjetos durante 10 minutos en PBST para perme los tejidos. Esta vez, lava los portaobjetos tres veces con TNT.
Ahora, en una cámara humidificada, bloquee el tejido en suficiente TNB para cubrir cada portaobjetos. Deje reposar el bloque durante media hora a temperatura ambiente. No dejes que los portaobjetos se sequen.
Después de drenar el tampón de bloqueo, cubra completamente el portaobjetos con el anticuerpo primario en TNB para unirse al trazador. Incubar durante dos horas a RT o toda la noche a cuatro grados centígrados. Para eliminar el anticuerpo primario, lave el portaobjetos con TNT tres veces a temperatura ambiente durante cinco minutos por lavado.
Durante estos lavados, agite suavemente. A continuación, incube las secciones en la solución de anticuerpos secundarios durante una hora. Más tarde, a temperatura ambiente, use tres lavados de TNT para eliminar el anticuerpo secundario no unido.
Luego, en una cámara humidificada, incubar los tejidos en uno a 100 peroxidasa de rábano picante conjugada en TNB durante 30 minutos a temperatura ambiente mientras se lavan los portaobjetos en TNT. Después de la incubación, haga una nueva dilución de la solución de TSA. Ahora aplique la dilución de TSA recién hecha a los pañuelos durante exactamente 10 minutos a temperatura ambiente.
El momento preciso de la incubación de TSA es fundamental. Por lo tanto, no intentemos procesar demasiadas diapositivas a la vez en nuestra mano. Se pueden manejar hasta 10 portaobjetos en un solo paso.
Los portaobjetos adicionales pueden esperar en el tampón de lavado de TNT hasta que se procesen después de otra ronda de lavados. Incubar los tejidos con uno a 500 Alexa floor 5 46 stripped. Tenerlo en conjugado en TNB durante 30 minutos.
A temperatura ambiente, retire el conjugado de habitante despojado con tres baños de TNT más. Luego, para la tinción nuclear, aplique una solución de benza al 5% de BIS en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos, elimine la mancha de benzo BIS con tres lavados de TNT. A continuación, monte las correderas con el soporte de flúor G y proceda a su análisis.
Utilizando el protocolo descrito, se analizó la maduración de los circuitos neuronales que regulan el eje reproductivo en ratones portadores de los alelos R 26 BIZ y R 26 GTT. La expresión de los transgenes se activó por recombinación dependiente del credo en neuronas embrionarias de kisspeptina en el núcleo arqueado utilizando una línea conductora de credo específica de Kisspeptina de doble inmunofluorescencia para kisspeptina en verde y BL en rojo de un beso. IC R 26 BIZ.
El ratón muestra la activación de BL en el KISS IC R 26 GTT La doble inmunofluorescencia del ratón muestra KISSPEPTINA en verde y GTT activada por el controlador Cree en rojo. Estos y otros diagnósticos demostraron que los transgenes eran funcionales en embriones experimentales E 18.5. Sus neuronas de pepina en el núcleo arqueado ya se encontraban comunicándose con GNRH.
Las neuronas que carecen de Z se limitaron a las neuronas CRE que expresan kisspeptina, mientras que BL se transsináptica a las neuronas ascendentes y descendentes. Algunos, pero no todos. Las neuronas GNRH contenían bl.
Por lo tanto, solo un subconjunto de neuronas GNRH embrionarias está conectado sinápticamente a las neuronas kisspeptina del núcleo arqueado. Las neuronas GNRH no contenían el trazador retrógrado. GTT demostrando que estas neuronas están aguas abajo de las neuronas kisspeptina.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un día siguiendo este procedimiento. Se pueden utilizar otros métodos, como la inmunofluorescencia dual, para identificar la naturaleza bioquímica de las neuronas conectadas. Esta técnica debería allanar el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia y la biología del desarrollo exploren la conectividad neuronal con una resolución de una sola célula, tanto durante el desarrollo como en animales adultos.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar la formación y maduración de los circuitos neuronales en ratones.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para rastrear circuitos neuronales en el cerebro embrionario del ratón utilizando trazadores transsinápticos codificados genéticamente. El método permite la visualización del desarrollo de circuitos neuronales con resolución a nivel de célula individual.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Circuitos neuronales
Antecedentes
- Comprender la formación de circuitos neuronales es fundamental para la neurociencia del desarrollo.
- Los trazadores transsinápticos permiten el estudio de la conectividad neuronal.
- El cerebro de ratón embrionario sirve como modelo para estudiar el desarrollo neural.
- La producción específica de trazadores en células permite un análisis dirigido.
Objetivo del estudio
- Visualizar el desarrollo de circuitos neuronales en el cerebro embrionario de ratón.
- Analizar la organización de circuitos neuronales específicos durante el desarrollo.
- Proporcionar un protocolo aplicable tanto a ratones embrionarios como adultos.
Métodos Utilizados
- Uso de tres sistemas diferentes de marcado celular.
- Aplicación de un trazador transsináptico bidireccional.
- Uso de un trazador retrógrado y una etiqueta que no se desplaza.
- Análisis con resolución a nivel de célula individual de circuitos neuronales.
Resultados principales
- El protocolo identifica con éxito neuronas ascendentes y descendentes.
- Los resultados demuestran la formación de circuitos neuronales en el cerebro embrionario de la hembra de ratón.
- El método puede analizar la actividad sináptica en neuronas genéticamente identificadas.
- Permite examinar cómo las condiciones experimentales afectan los circuitos neuronales a lo largo del tiempo.
Conclusiones
- Este protocolo experimental es eficaz para estudiar el desarrollo de circuitos neuronales.
- Proporciona información sobre el momento y la organización de los circuitos neuronales.
- El método es versátil para el análisis de circuitos neuronales tanto en embriones como en adultos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la formación de circuitos neuronales durante el desarrollo embrionario proporciona información mecanicista sobre los trastornos del neurodesarrollo y apoya la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos para el sistema nervioso central. Este enfoque de rastreo transsináptico codificado genéticamente permite la cartografía dependiente de la actividad de las conexiones sinápticas con resolución a nivel de célula individual, ofreciendo un sistema reproducible para reducir los riesgos asociados a hipótesis terapéuticas relacionadas con la conectividad neuronal. Al eliminar la necesidad de inyección estereotáxica, el método mejora la estandarización y escalabilidad a través de diferentes puntos temporales del desarrollo y fondos genéticos, favoreciendo una preparación consistente de ensayos para estudios de interacción con la diana.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización de la conectividad sináptica entre poblaciones neuronales definidas genéticamente durante ventanas críticas del desarrollo.
- Valor operativo: Proporciona un sistema codificado genéticamente y libre de inyecciones que garantiza una expresión constante del trazador y reduce la variabilidad en experimentos de mapeo de circuitos.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de señales transsinápticas dependientes de la actividad que reflejan la comunicación sinápt游戏副本ica funcional entre neuronas ascendentes y descendentes.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante la expresión específica de locus dependiente de Cre desde el locus ROSA26, lo que permite la preparación reproducible de tejido neural para análisis posteriores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la eliminación de riesgos mecanicistas al permitir a los investigadores rastrear cómo las perturbaciones genéticas o farmacológicas afectan la formación de circuitos neuronales a lo largo del tiempo en modelos embrionarios relevantes para la enfermedad.
- Valor operativo: Ofrece un flujo de trabajo compatible con plataformas que puede integrarse con inmunofluorescencia, genotipificación y tuberías de imágenes para la validación multiparamétrica del compromiso del blanco.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método respalda los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la cartografía de circuitos guiada por hipótesis antes de la identificación del compuesto inicial, cuyos resultados informan sobre la confianza en el blanco y la preparación para el cribado fenotípico en programas de desarrollo neurológico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la desactivación biológica de riesgos mediante la visualización de la formación y maduración de circuitos neuronales específicos, como aquellos que regulan el eje reproductivo, con resolución a nivel celular única.
- Selección: Permite la preparación de sistemas neuronales estandarizados y genéticamente rastreables, adecuados para evaluar los efectos de compuestos sobre la conectividad sináptica en cerebros embrionarios o adultos.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas basadas en fluorescencia (por ejemplo, transferencia de señal BL, GTT) que permiten comparar la actividad sináptica entre diferentes condiciones, genotipos o etapas de desarrollo.
- Investigación Translacional: Relaciona la formación de circuitos embrionarios con la función posnatal al permitir un análisis longitudinal de cómo las perturbaciones tempranas del desarrollo influyen en la conectividad neuronal adulta.
- Reutilización Empresarial: Las cepas de inserción dual en ROSA26 representan una plataforma genética reutilizable aplicable a múltiples dianas del SNC y modelos de enfermedad, sin necesidad de intervenciones quirúrgicas repetidas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos al proporcionar evidencia directa, dependiente de la actividad, de la conectividad sináptica entre poblaciones de neuronas definidas genéticamente.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad y reduce la variabilidad técnica mediante la expresión dependiente de Cre y controlada por locus, eliminando las inconsistencias asociadas a inyecciones.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o descarte en la selección de objetivos del SNC al permitir la visualización temprana de los efectos a nivel de circuito provocados por la modulación genética o farmacológica.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo al generar datos mecanicistas sobre la formación de circuitos neuronales que orientan la priorización de objetivos en indicaciones neurodesarrollistas y psiquiátricas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en embriología de ratón, genotipado y microscopía de fluorescencia para el manejo adecuado de embriones, seccionado y detección de señales.
- Depende de la disponibilidad de líneas conductoras de Cre y sistemas reporteros fluorescentes para la marcación celular específica y la validación multimodal.
- Necesita protocolos estandarizados de fijación, seccionado por criomicrotomía e inmunohistoquímica para preservar la señal del trazador y garantizar una calidad de corte reproducible.
- La adaptación en diferentes sistemas modelo depende de la conservación de la funcionalidad del trazador transsináptico y de la especificidad del promotor en especies no murinas.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dependencia de la actividad sináptica para la transferencia del trazador, lo cual podría afectar la sensibilidad en circuitos con baja actividad o inmaduros.
