Name: Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprende a rastrear circuitos neuronales en el cerebro embrionario de ratón mediante trazadores transinápticos genéticos. Este protocolo permite visualizar conectividad neuronal a resolución de célula única.

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Agradecemos a Michael Candlish por sus comentarios críticos sobre el manuscrito. Este proyecto fue apoyado por las subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft BO1743/6 y SFB/TRR 152 P11 y Z02 a Ulrich Boehm.

NOTA: Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal de la Universidad de Hamburgo y la Universidad de Saarland. 1. Preparación y fijación de tejido embrionario <ol><li> Organizar todos los equipos necesarios para diseccionar los embriones y preparar soluciones para la posterior fijación de los tejidos antes de sacrificar a los animales. NOTA: Siempre preparar una solución fresca 4% de paraformaldehído (PFA) (4% PFA en 0,1 M tampón fosfato salino (PBS), ajustar el pH a 7,4). </li><li> La eutanasia cronometrado ratón hembra embarazada con un procedimiento éticamente aprobado. </li><li> Transferir el ratón sobre una plataforma. Humedezca la cara ventral del abdomen con etanol al 70% y hacer una incisión vertical con unas tijeras afiladas para exponer la cavidad abdominal. </li><li> Identificar la cadena embrionario y tire de ella con cuidado aplicando fórceps romos y colocarlo en helado de PBS. </li><li> Retire los embriones individuales dela cadena de embriones utilizando finas tijeras y pinzas. Quitar el tejido extra alrededor de los embriones y lávelos con helado de PBS. </li><li> Tomar una pequeña biopsia de cola (antes de transferir el embrión en PFA) y se incuba en tampón de lisis de la cola para la identificación de género y genotipado alelo trazador PCR. </li><li> Iniciar en el embrión en el lado más lateral y transferir cada embrión por separado en un tubo que contiene helado 4% PFA en el hielo en una coctelera. </li><li> Remojar los embriones a la edad de E13.5 o menos durante 1,5 h en hielo con agitación constante. Remojar los embriones en E14.5 E15.5 edad y durante 2,5 horas en hielo con agitación constante. </li><li> Por E16.5 embriones edad o más, decapitar y quitar la piel exterior antes de remojar la cabeza en una solución de PFA. Jefes de embriones E16.5 pueden ser remojados durante 4,5 horas en hielo con agitación constante. </li><li> Después de la fijación apropiada, lavar los embriones tres veces con PBS enfriado con hielo. La transferencia de los embriones en 30% de sacarosa en solución de PBS a 4 ° C hasta que se hundena la parte inferior. </li></ol> 2. Congelación <ol><li> Organizar todos los materiales necesarios antes de iniciar el proceso de congelación: crio-moho, crio-guantes, pinzas entomología peso pluma, rotulador y compuestas temperatura óptima de corte (OCT) </li><li> Etiquetar el molde crio con un marcador permanente resistente al alcohol (mencionar la orientación del tejido, la fecha y genotipo). Preparar un granizado de hielo seco triturado y etanol al 100% en un cubo de hielo. Coloque un vaso de vidrio en el interior contiene isopentano. Espere 10 minutos para el isopentano se enfríe. </li><li> Mientras tanto eliminar el tejido de la solución de sacarosa, limpie el exceso de sacarosa en todo el tejido utilizando toallitas de laboratorio. Transferir el tejido en un crio-molde previamente etiquetado con suficiente octubre para cubrir el tejido. Evite las burbujas de aire en los PTU; especialmente alrededor del tejido. </li><li> Oriente el tejido en octubre utilizando pinzas entomología peso pluma para evitar daños en los tejidos. Iniciar la congelación mediante la transferencia de la crio-mold en el baño de isopentano enfriado previamente. No salpique isopentano en el octubre, ya que no se congele correctamente. Envuelva las muestras en papel de aluminio y guardar a -80 ° C. </li></ol> 3. cryosectioning <ol><li> Cortar 14 m de serie de secciones delgadas en serie de cinco usando un criostato y recoger en portaobjetos de vidrio SuperFrost® Plus para inmunofluorescencia análisis (SI). Guarde las diapositivas a -80 ° C hasta su utilización. </li></ol> 4. trazador visualización utilizando el protocolo (TSA) tiramida amplificación de señal <ol><li> Preparar los tampones y reactivos necesarios para la tinción. Siempre recién preparar el tampón Tris-NaCl-Tween (TNT) en el día de uso. <ol><li> Preparar tampón TNT utilizando 100 ml de M Tris-HCl 1 pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M y ddH 2 O hasta un volumen final de 1 L. Añadir 500 l de Tween 20 utilizando una pipeta de 1 ml. Añadir el Tween 20 lentamente y lave la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para asegurarse de que todo está en Tween 20solución. </li><li> Prepare Tris-NaCl-bloqueo (TNB) buffer usando 100 ml de M Tris-HCl 1 pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M y ddH 2 O hasta un volumen final de 1 L. Añadir 5 g de reactivo de bloqueo (proporcionado con el kit) lentamente en pequeños incrementos a la memoria intermedia mientras se agitaba. Calentar la solución gradualmente a 55 ° C con agitación continua para disolver completamente el reactivo de bloqueo (esto no debería llevar más de 30 a 60 min). Para conseguir un calentamiento homogéneo utilizar un baño de agua a 55 ° C. La solución aparecerá lechoso. Llevar la solución a temperatura ambiente antes de usar. Alícuota y almacenar a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo. </li><li> Reconstituir el reactivo tiramida biotina (suministrado con el kit) en Biología Molecular / grado HPLC DMSO. Dependiendo de qué kit se utiliza la cantidad apropiada de DMSO puede variar. La solución madre, a 4 ° C. NOTA: Las secciones de los animales heterocigotos para los alelos respectivos Cre y R26 pueden ser utilizados para el análisis de circuitos. Uso sreflexiones de los compañeros de camada que llevan uno Cre o un alelo R26, respectivamente, como controles negativos. Tratar portaobjetos controles negativos exactamente como diapositivas de animales dobles heterocigotos. Además, incluyen una corredera de control de un animal heterocigota doble, pero dejar de lado el reactivo TSA (control sin amplificar). </li></ol></li><li> Con un bisturí afilado fresco eliminar el exceso de octubre en torno a los cortes de tejido y marca la frontera alrededor de las secciones con un lápiz PAP. </li><li> Secar los portaobjetos durante 2-3 min a temperatura ambiente (RT). Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno. Incubar los portaobjetos a TA durante 30 min en 0,3% de H 2 O 2 solución en metanol enfriado con hielo para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. </li><li> Lavar 3x con PBS durante 5 min cada uno a TA. Incubar durante 10 min en 0,5% de Triton X-100 en PBS para la permeabilización del tejido. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno. </li><li> Bloquear con TNB (solución de bloqueo, 200-300 l por diapositiva) para 30min a RT en una cámara humidificada. Asegúrese de que todas las secciones están completamente cubiertas por TNB. No deje que los portaobjetos se sequen entre los pasos. </li><li> Escurrir el exceso de tampón de bloqueo y aplicar el antisuero primario reconocer el trazador (1: 1000 de cabra anti-WGA para BL, 1: 15.000 de conejo anti-GFP para GTT) diluido en TNB durante 2 horas a RT o durante la noche a 4 ° C. Asegúrese de utilizar un volumen suficiente para cubrir completamente la sección de tejido (200-300 l por diapositiva). NOTA: Las diluciones de antisueros primarios recomendados aquí pueden tener que ser ajustada. </li><li> Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno con agitación. </li><li> Se incuban las secciones con antisuero secundario biotinilado que reconocen el anfitrión de la primera antisuero (1: 500 caballo anti-IgG de cabra anti-WGA, 1: 5.000 de cabra anti-IgG de conejo anti-GFP en TNB durante 1 hora a temperatura ambiente). </li><li> Lavar 3 veces con TNT a TA durante 5 min cada uno con agitación. Incubar en 1: 100 de estreptavidina (SA) y conjugado con peroxidasa de rábano picante (SA-HRP, wi proporcionadoth el kit) en TNB durante 30 min a RT en una cámara humidificada. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno. Mientras tanto descongelar la TSA. </li><li> Diluir 1:50 en TSA TSA diluyente de amplificación (suministrado con el kit, que utilicen el kit TSA para la visualización de BL y el kit TSA + para GTT). Incubar las secciones de tejido en diluido TSA precisamente por 10 min a RT. Diluir TSA justo antes de su uso, idealmente durante la etapa de lavado anterior, no utilice ningún restante diluida reactivo TSA para futuros experimentos; prepare siempre fresco. </li><li> Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno con agitación. Incubar con 1: 500 Alexa Fluor® 546 de estreptavidina conjugada en TNB durante 30 min a RT. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno con agitación. </li><li> Incubar durante 10 min en solución bisbenzimide 5% en PBS a RT para la tinción nuclear. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno con agitación. Montar con Fluromount G y realizar epifluorescencia o microscopía confocal. <em&gt; Solución de problemas: La eficacia de la transferencia de trazador dependerá del nivel de expresión del locus ROSA26 en las células productoras (determinado por la línea de conductor Cre utilizado) y en el circuito neural analizado (por ejemplo, número de neuronas que producen el trazador, la convergencia etc.). Por lo tanto las diluciones de antisueros primarios recomendados aquí pueden tener que ajustarse para evitar que la señal baja o exceso. Antecedentes siempre debe ser analizado utilizando portaobjetos de control apropiados (véase más arriba). </li></ol> 5. τlacZ tinción de secciones embrionarias <ol><li> Preparar los tampones y reactivos necesarios para la tinción. Siempre recién preparar el tampón de LacZ C antes de su uso. <ol><li> Preparar 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-gal) solución madre (40 mg / ml) mediante la adición de 40 g de X-gal a 1 ml 70% de dimetilformamida (DMF). Cubra con papel aluminio y almacenar a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo. </li><li> Preparar nitro azul tetrazolio (NBT) stock solución (50 mg / ml) mediante la adición de 50 g de NBT a 1 ml 70% de DMF. Cubra con papel aluminio y almacenar a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo. </li><li> Prepare LacZ fijador utilizando 80 l de glutaraldehído al 25%, 5 ml de PFA al 4%, 20 l de 1 M de MgCl 2, 100 l de EGTA 500 ​​mM, 1 ml de 1 M de tampón fosfato pH 7,4 y ddH 2 O hasta una final volumen de 10 ml. </li><li> Prepare LacZ tampón A utilizando 1 ml de 1 M de MgCl 2, 5 ml de EGTA 500 ​​mM, 50 ml de 1 M tampón fosfato pH 7,4 y ddH 2 O hasta un volumen final de 500 ml. </li><li> Preparar tampón B LacZ usando 1 ml de 1 M de MgCl 2, 5 ml de EGTA 500 ​​mM, 5 ml de 1% de desoxicolato de sodio, 100 ml de 10% de NP-40, 50 ml de tampón de fosfato 1 M pH 7,4 y ddH 2 O hasta un volumen final de 500 ml. </li><li> Prepare el buffer de LacZ C mediante la adición de 10 l de solución de NBT y 12,5 l de X-gal solución madre a 1 ml de tampón LacZ B. Hacer fresco justo antes de su uso y cubrir con papel de aluminio. </li></ol&gt; </li><li> Seque las diapositivas a TA al menos durante 10-15 minutos (mientras tanto preparar las diapositivas con un lápiz PAP). </li><li> Fije la sección con LacZ fijador durante 2 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda en el interior una sustancia química del humo del capó. Lavar 3 veces con PBS suplementado con 2 mM MgCl2. </li><li> Enjuagar los portaobjetos con tampón LacZ A. Lave los portaobjetos con LacZ tampón A 3 veces durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. Lavar 2 veces con tampón LacZ B durante 5 minutos cada uno. Incubar los portaobjetos en tampón LacZ C a 30-37 ° C durante 6 horas o toda la noche en una cámara húmeda. NOTA: Añadir suficiente volumen de tampón LacZ C; diapositivas no debe secarse durante la incubación. </li><li> Después de la incubación adecuada lavan los portaobjetos con PBS suplementado con 2 mM MgCl2. Enjuague secciones brevemente con ddH 2 O. Cubreobjetos con glicina gelatina de Mayer. Adecuado para un microscopio de luz equipado con un contraste de interferencia diferencial (DIC) de formación de imágenes set-up. </li></ol> 6. Gender y trazador Genotipado <ol><li> Preparar la cola tampón de lisis usando 1 ml de M Tris-HCl pH 8,5 1, 100 l de EGTA 500 ​​mM, 200 l de 10% SDS, 400 l de NaCl 5 M y ddH 2 O para hacer un volumen final de 10 ml. </li><li> Añadir 500 l de tampón de lisis de la cola a cada tubo Eppendorf que contiene una biopsia de la cola. Añadir proteinasa K a una concentración final de 100 mg / ml. Incubar toda la noche en un agitador a 55 ° C. </li><li> Centrifugar las muestras a 17.000 xg durante 10 min a TA. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga. Añadir 500 l de isopropanol al sobrenadante. Mezclar durante al menos 5 min invirtiendo los tubos arriba y hacia abajo. </li><li> Girar en centrifugar a 17.000 xg durante 5 min a TA. Retirar el sobrenadante. Añadir 200 l de etanol al 70%. Agitar durante al menos 5 min. </li><li> Se centrifuga a 17.000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con una Pipetman (no vierta apagado). Secar el precipitado en una cámara caliente (37 ° C) durante 15-30 min. </li><li> Resuspender pellet en 100 lde bajo TE pH 8,0 o agua usando puntas de ancho de ánima se filtró. Ponga en 55 ° C durante 1 hora y a 37 ° C durante la noche para disolución adecuada. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Utilice 1 l de ADN para la reacción de PCR (mezcla de reacción 50 l que contiene 1 l de ADN de la cola, 2,5 l DMSO, 22:00 de cada cebador, 25 M de cada dNTP, y betaína 1M). Cebadores de PCR para genotipificación y la identificación de género se enumeran en la tabla de Materiales. </li></ol>

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<li>Seibler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+copy+shRNA+configuration+for+ubiquitous+gene+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice.</a> Nucleic Acids Res. 33, e67(2005).</li>
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</ol>

No se declara ningún conflicto de intereses.

Expresando trazadores transsynaptic como transgenes para rastrear los circuitos neurales de poblaciones neuronales definidas genéticamente tiene varias ventajas en comparación con la inyección estereotáxica de trazadores o virus neurotopic. En primer lugar, el trazador se produce como una proteína endógena y por lo tanto no provoca ninguna respuesta inmune y una vía neural selectiva puede ser analizada en diferentes animales con alta reproducibilidad. En segundo lugar, porque este es un método no invasivo que se puede u...

Rastreo de ruta anatómica es una de las herramientas más comúnmente utilizadas para descifrar la relación entre el cerebro y el comportamiento 1. El avance en las tecnologías de circuitos neuronales rastreo ha otorgado neurocientíficos con la capacidad de rastrear los circuitos neuronales de poblaciones de neuronas identificadas genéticamente en ratones 2. A pesar de estos avances técnicos que sigue siendo un reto para desentrañar la formación de circuitos neuronales especialmente durante la maduración embrionaria. Esto es porque la mayoría de los métodos de rastreo desarrolladas hasta la fecha se basan en la inyección estereotáxica de trazadores transsynaptic o virus neurotróficos modificados genéticamente (Figura 1) 2,3. Si bien estas técnicas de lograr la resolución espacial y temporal de la conectividad, varias limitaciones inherentes, tales como inyecciones de trazadores técnicamente desafiantes en el cerebro en desarrollo, la reproducibilidad de la sitio de la inyección, inflamación potencial en el sitio de la inyección y lo más importante citotoxicidad causada por los virus neurotróficos limitar su uso 4. Un método alternativo consiste en expresar los trazadores transsynaptic como transgenes en ratones genéticamente alterados. Recientemente hemos modificado esta técnica y ha desarrollado un sistema de rastreo transsynaptic genética binaria para mapear los circuitos neurales de una población neuronal identificado genéticamente 5. Nuestra estrategia experimental se basa en dos nuevas cepas de ratón knock-in, que expresan ya sea la lectina de cebada trazador bidireccional (BL) 6 o el trazador retrógrado fragmento de la toxina tetánica C fusionado a GFP (GTT) 7 desde el locus ROSA 26 después mediada por Cre recombinación. Aquí hemos utilizado estas cepas de ratón para expresar selectivamente BL y GTT en las neuronas que producen kisspectina, un neuropéptido que está implicada en la regulación de la maduración del eje reproductivo 8,9. Se demuestra que esta técnica es adecuado para visualizar el desarrollo y maduración del besocircuitos neuronales peptina durante el desarrollo embrionario del cerebro del ratón hembra 5. Estrategia de cría El R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) y los R26-GFP-TTC (GTT) líneas trazadoras son ronda en cepas 5 que llevan alelos ROSA26 recombinantes. El R26-BIZ y los alelos R26-GTT son transcripcionalmente silencioso debido a la presencia de una fuerte señal de parada transcripcional, que está flanqueado por dos sitios loxP 5. Expresión del transgén BIZ GTT y se activa por la eliminación mediada por Cre de la señal de parada transcripcional. Los alelos R26 y R26-BIZ-GTT se pueden utilizar independientemente con sólo cruzar con una línea piloto Cre. Para los animales de análisis de heterocigotos para los alelos respectivos Cre y R26 pueden ser utilizados. Littermates que llevan uno Cre o un alelo R26, respectivamente, deben ser utilizados como controles. Alternativamente, también es posible generar tRiple ronda en animales portadores de los alelos Cre, R26 y R26-BIZ-GTT, sin embargo esto requerirá una cruz adicional.

<table><tbody><tr><td>Bisbenzimida (tinte Hoechst 33258)</td><td>Sigma</td><td>14530-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Molde criogénico (Peel-a-way)</td><td>Polyscience Inc.</td><td>18646A-1</td><td>22 x 22 x 20 mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Formamida (DMF)</td><td>VWR Chemicals</td><td>23470,293</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma</td><td>34988-7</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano (2-butano metilo)</td><td>Sigma</td><td>M32631-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de glicina de Kaiser</td><td>Merck</td><td>1092420100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>494437-1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ROTH</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Sigma</td><td>298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 sustituto</td><td>Fluka</td><td>743.85</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Pluma Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>PAP</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Parafarmaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Correderas Superfrost</td><td>Thermo Scientific</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>Kit TSA</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL700</td><td></td></tr><tr><td>TSA plus</td><td>Kit PerkinElmer</td><td>NEL749A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>ROTH</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ROTH</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>ROTH</td><td>2315.1</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico equipado con imágenes DIC</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 equipado con el software</td><td></td>Axio Vision</tr><tr><td>Microscopio de fluroscencia</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 equipado con el software</td><td></td>Axio Vision</tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-WGA (reconoce BL)</td><td>Vector Laboatories</td><td>AS-2024</td><td></td></tr><tr><td>Vector IgG anti-cabra de caballo biotinilado</td><td>Laboatories</td><td>BA-9500</td><td></td></tr><tr>Vector de<td>IgG anti-conejo de cabra biotinilado</td><td>Laboatories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-GFP (reconoce GTT)</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-GnRH</td><td>Afinidad Bio Reactivo</td><td>PA1-121</td><td></td></tr><tr><td>Dylight488-burro anti-conejo IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10038</td><td></td></tr><tr><td>SA-Alexa Fluor 546</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primers</td></tr><tr><td>BL Fwd (para el genotipado BIZ)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC</td></tr><tr><td>BL Rev (para el genotipado BIZ)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCCCTCGCCGCAGAACTC</td></tr><tr><td>Cre Fwd (para el genotipado de Cre)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG</td></tr><tr><td>Cre Rev (para el genotipado de Cre)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCAGGCTAAGTGCCTTCTACACCTGC</td></tr><tr><td>TTC Fwd (para el genotipado GTT)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCAAGGGCGAGGAGGTGTT</td></tr><tr><td>TTC Rev (para el genotipado</td> GTT)<td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCTTGTAGGTGCCGTCGTCCTTGAA</td></tr><tr><td>XY Fwd (para el genotipado de género)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>TGAAGCTTTTGGCTTTGA</td></tr><tr><td>XY Rev (para el genotipado de género)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCGCTGCCAAATTCTTTG</td></tr><tr><td>ROSA26 Fwd</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr><tr><td>ROSA26 Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GCAGATGGAGCGGGAGAAAT</td></tr><tr><td>SA Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr></tbody></table>

condicional transsynaptic genética seguimiento en el cerebro de embriones de ratón

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

El trazado de rutas anatómicas es de vital importancia para descifrar la relación entre el cerebro y el comportamiento. Sin embargo, desentrañar la formación de circuitos neuronales durante la maduración embrionaria del cerebro es técnicamente desafiante porque la mayoría de los métodos de rastreo transsináptico desarrollados hasta la fecha dependen de la inyección de trazadores estereotáxicos. Para superar este problema, desarrollamos una estrategia genética binaria para el rastreo transsináptico genético condicional en el cerebro de ratón. Con este fin, generamos dos cepas complementarias de ratones knock-in para expresar selectivamente el trazador transsináptico bidireccional de cebada lectina (BL) y el trazador transsináptico retrógrado de la toxina tetánica fragmento C del locus ROSA26 después de la recombinación mediada por Cre. La producción de trazadores específicos de células en estos ratones está codificada genéticamente y no depende de la inyección mecánica de trazadores. Por lo tanto, nuestro enfoque experimental es adecuado para estudiar la formación de circuitos neuronales en el cerebro murino embrionario. Además, debido a que la transferencia de trazadores a través de las sinapsis depende de la actividad sináptica, estas cepas de ratón se pueden usar para analizar la comunicación entre poblaciones neuronales definidas genéticamente durante el desarrollo del cerebro con una resolución de una sola célula. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para el rastreo transsináptico en embriones de ratón utilizando los nuevos alelos recombinantes ROSA26. Hemos utilizado esta técnica experimental con el fin de delinear los circuitos neuronales que subyacen a la maduración del eje reproductivo en el cerebro de ratón hembra en desarrollo.

Esta sección muestra los resultados representativos que se pueden obtener a trabajar con el R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) y la R26-GTT (G FP-TT C) alelos. Aquí se utiliza el R26-BIZ y los alelos R26-GTT para analizar la maduración de los circuitos neuronales que regulan el eje reproductivo. La reproducción en los vertebrados está controlado por un pequeño grupo de neuronas en el hipotálamo, que secretan la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). Kisspeptina, un p...

Aprovechando una estrategia genética binaria, proporcionamos un protocolo detallado para el rastreo de circuitos neuronales en ratones que expresan trazadores transsinápticos complementarios después de la recombinación mediada por Cre. Debido a que la producción de trazadores específicos de células está codificada genéticamente, nuestro enfoque experimental es adecuado para estudiar la formación y maduración de circuitos neuronales durante el desarrollo del cerebro embrionario murino a una resolución de una sola célula.

Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

El objetivo del siguiente experimento es visualizar el desarrollo de los circuitos neuronales en el cerebro embrionario del ratón utilizando tres sistemas distintos de marcado celular mediante un trazador transsináptico que viaja en ambas direcciones, un segundo trazador que viaja únicamente de forma retrógrada y una tercera etiqueta que no se desplaza desde la célula diana. Es posible identificar la neurona diana, las neuronas ascendentes y las neuronas descendentes. Los resultados demuestran que este protocolo experimental puede utilizarse para analizar la formación de circuitos neuronales en el cerebro embrionario de la hembra de ratón con resolución a nivel de célula individual.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia del desarrollo, como cuándo se forman circuitos neuronales específicos y cómo se organizan durante el desarrollo embrionario. Este método también puede utilizarse para rastrear circuitos neuronales en ratones adultos. Específicamente, puede emplearse para analizar la actividad sináptica entre neuronas genéticamente identificadas, y puede usarse para analizar cómo diferentes condiciones experimentales pueden modular un circuito neuronal a lo largo del tiempo.Comience con un ratón preñado recién sacrificado. Limpie el lado ventral de su abdomen con etanol al 70 %, y luego realice una incisión vertical para exponer los embriones. Retire la cadena de embriones y transfiéralos a una placa con PBS frío con hielo en la placa.Retire los embriones individuales utilizando pinzas romas. Separe los embriones individuales en la solución utilizando tijeras finas y pinzas, eliminando el tejido adicional durante el proceso, hasta que los embriones queden completamente limpios. Tome una pequeña biopsia de la cola de cada embrión y colóquela en un tubo con tampón de lisis para recolectar ADN destinado a la identificación del sexo y genotipificación.Luego, transfiera el embrión a una solución recién preparada y fría con hielo de PFA al 4 % sobre hielo. Después de procesar cada embrión, déjelos incubar en el PFA con agitación durante al menos 1,5 horas, dependiendo de su tamaño. Cuando finalice la incubación.Lave los tejidos fijados tres veces con PBS frío con hielo durante al menos cinco minutos por lavado. A continuación, transfiera los embriones a una solución de sacarosa al 30 %, mantenida a cuatro grados Celsius. Cuando los tejidos se hundan completamente en la solución, continúe con la criosección.Primero, comience por etiquetar un molde criogénico utilizando un marcador permanente resistente al alcohol. A continuación, prepare una suspensión de hielo seco triturado en etanol al 100 % dentro de un recipiente para hielo, utilizando esta suspensión para enfriar un vaso de precipitados de vidrio con isopentano durante aproximadamente 10 minutos. Mientras espera, retire los tejidos de la solución de sacarosa y elimine el exceso de sacarosa con una toallita de laboratorio estándar.Luego, transfiera el tejido a un molde criogénico previamente etiquetado. Con suficiente OCT para cubrir el tejido. No forme burbujas de aire en el OCT, especialmente alrededor del tejido.A continuación, oriente el tejido utilizando pinzas entomológicas de peso ligero para causar el mínimo daño posible. Congele los moldes criogénicos en el baño de isopentano enfriado sin provocar salpicaduras, si es necesario. Los moldes congelados pueden envolverse y almacenarse a menos 80 grados celsius para seccionarlos posteriormente.Córtelos en secciones seriadas de 14 micrones de grosor en series de cinco. Recopile cada serie de cinco cortes en un portaobjetos de vidrio super frost plus. Al preparar la solución para este protocolo, asegúrese de agregar el tween 20 lentamente al tampón TNT, que debe prepararse fresco.Luego, pase la solución hacia arriba y hacia abajo lentamente para mezclarla. Al preparar el tampón TNB, agregue lentamente el reactivo bloqueante en pequeños incrementos mientras agita. A continuación, caliente la solución a 55 grados Celsius utilizando un baño de agua.La solución se volverá lechosa. Ahora, para comenzar a trabajar con los tejidos, primero use un escalpelo para eliminar el OCT en exceso que rodea las secciones de tejido. Luego marque los límites de cada sección utilizando un lápiz de papel.Deje que los portaobjetos alcancen la temperatura ambiente. Luego, lávelos con tampón XPBS al temperatura ambiente, tres lavados de cinco minutos cada uno. A continuación, bloquee la actividad de peroxidasa endógena incubando los portaobjetos durante media hora en peróxido de hidrógeno al 0,3 % en metanol, frío con hielo.A continuación, realice tres lavados en PBS a temperatura ambiente durante cinco minutos por lavado. Luego, incube las laminillas durante 10 minutos en PBST para permeabilizar los tejidos. En esta ocasión, lave las laminillas tres veces con TNT.Ahora, en una cámara humedecida, bloquee el tejido con suficiente TNB para cubrir cada portaobjetos. Deje que la incubación dure media hora a temperatura ambiente. No permita que los portaobjetos se sequen.Después de drenar completamente el tampón de bloqueo, cubra totalmente la laminilla con el anticuerpo primario en TNB para unir el marcador. Incube durante dos horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius. Para eliminar el anticuerpo primario, lave la laminilla con TNT tres veces a temperatura ambiente, cinco minutos por lavado.Durante estos lavados, utilice una agitación suave. A continuación, incube las secciones en la solución de anticuerpo secundario durante una hora. Posteriormente, a temperatura ambiente, realice tres lavados con TNT para eliminar el anticuerpo secundario no unido.Luego, en una cámara humidificada, incubar los tejidos en una solución de peroxidasa de rábano picante conjugada con heveína, diluida entre 1:100 en TNB, durante 30 minutos a temperatura ambiente, mientras se lavan las laminillas en TNT. Tras la incubación, preparar una dilución fresca de la solución TSA. A continuación, aplicar la dilución recién preparada de TSA a los tejidos exactamente durante 10 minutos a temperatura ambiente.El momento preciso de la incubación con TSA es crítico. Por lo tanto, no intente procesar demasiadas láminas a la vez en su mano. Hasta 10 láminas pueden manejarse en un solo paso.Las diapositivas adicionales pueden permanecer en el tampón de lavado TNT hasta que se procesen tras otra ronda de lavados. Incube los tejidos con uno a 500 de Alexa floor 5 46 desprovisto, agregue el conjugado en TNB durante 30 minutos.A temperatura ambiente, elimine el conjugado del habitante despojado con tres baños más de TNT. Luego, para la tinción nuclear, aplique una solución de benza al 5 % BIS en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos, y elimine la tinción de benza BIS con tres lavados de TNT. A continuación, monte los portaobjetos con Fluoro Mount G y proceda con su análisis.Utilizando el protocolo descrito, se analizó la maduración de los circuitos neuronales que regulan el eje reproductivo en ratones portadores de los alelos R 26 BIZ y R 26 GTT. La expresión de los transgenes se activó mediante recombinación dependiente de la enzima Cre en neuronas embrionarias de kisspeptina del núcleo arcuato, empleando una línea transgénica específica para kisspeptina que expresa Cre. Doble inmunofluorescencia para kisspeptina en verde y BL en rojo a partir de un kiss. IC R 26 BIZ.El ratón muestra activación de BL en el ratón KISS IC R 26 GTT. La doble inmunofluorescencia muestra KISSPEPTINA en verde y GTT activada por el conductor Cree en rojo. Estos y otros diagnósticos demostraron que los transgenes eran funcionales en embriones experimentales E 18.5. Se encontró que las neuronas pepin en el núcleo arcuato ya estaban comunicándose con GNRH.Las neuronas carecían de Z, que se limitó a las neuronas de kisspeptina que expresan CRE, mientras que BL se transfirió transsinápticamente a neuronas ascendentes y descendentes. Algunas, pero no todas, las neuronas GNRH contenían bl.Por lo tanto, solo un subconjunto de neuronas GNRH embrionarias está conectado sinápticamente a las neuronas de kisspeptina del núcleo arcuato. Las neuronas GNRH no contenían el trazador retrógrado. GTT que demuestra que estas neuronas se encuentran aguas abajo de las neuronas de kisspeptina.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un día siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la inmunofluorescencia dual, pueden utilizarse para identificar la naturaleza bioquímica de las neuronas conectadas. Esta técnica debería allanar el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia y la biología del desarrollo exploren la conectividad neuronal con resolución a nivel de una sola célula, tanto durante el desarrollo como en animales adultos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar la formación y maduración de circuitos neuronales en ratones.

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Investigación

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Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

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Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón

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