Name: Pez cebra queratocitos explantes para estudiar la migración celular colectiva y reepitelización en Curación de Heridas cutáneas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprende a establecer cultivos de explantes de queratinocitos de pez cebra para estudiar la migración celular colectiva y la reepitelización en curación de heridas cutáneas. Este método primario reproduce propiedades in vivo.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de Midwestern University College de Ciencias de la Salud Investigación Facilitación subvención concedida a EEH y medio oeste de Oficina Universitario de Investigación y Programas Patrocinados Intramural subvención concedida a KJL.

Este protocolo se ajusta a los principios de bienestar AVMA animales para el cuidado y uso de animales de laboratorio y ha sido aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad del Medio Oeste. 1. Preparación de anestesia, equipos, y medios de comunicación <ol><li> Declorar aproximadamente 1,5 L de agua del grifo usando un agente comercial declorinadora (disponible en tiendas de mascotas) o dejando reposar el agua durante 24 horas. Obtener tres vasos de 1 L y rellenar cada una con 500 ml de agua sin cloro. Marque uno para la celebración de los peces antes de cualquier procedimiento y otro para la recuperación. Para el tercer vaso de precipitados, añadir 100 g / ml de metanosulfonato de tricaína; esto se convierte en el vaso de precipitados en el cual se anestesiaron pescado. </li><li> Llenar una bandeja poco profunda con hielo, calentar el medio de cultivo (RPMI 1640, 10% de FBS (suero fetal bovino), 50 mg / ml de gentamicina, 100 mg / ml de kanamicina, 25 mM HEPES) a RT, y reunir las pinzas de joyero limpio. Pinzas limpias por immercantar los consejos de etanol al 70% y pasar a través de un mechero Bunsen, permitiendo que el etanol se consuma. </li><li> Decidir si el procedimiento se realiza sin aumento, con un tablero iluminado lupa comercial con 2 - 10 aumentos, o microscopio de disección (depende por completo de la preferencia personal). </li></ol> 2. Establecer cultivos de explantes <ol><li> Coger el número deseado de pescado y colóquelo en un vaso de precipitados de retención. Transferencia de un solo pez en el vaso la anestesia; lo mejor es anestesiar pescado individualmente. </li><li> Monitorear los efectos de la anestesia mediante la observación de la natación y de enmalle movimiento de los peces. Como anestesia progresa, el movimiento de enmalle se ralentiza y los peces nadar de forma errática y con frecuencia al revés; considerar peces anestesiados tan pronto como el movimiento de enmalle cesa. No deje el pescado durante más tiempo en el baño de la anestesia, ya que esto puede resultar en la muerte de los peces. </li><li> Retire el pescado del vaso y la transferencia de la anestesiade hielo, colocar el pescado en posición horizontal con la cola hacia la mano que sostiene las pinzas. Si experimentado con la técnica y si varios peces se van a utilizar para hacer explantes, considerar la colocación de la siguiente peces en el vaso de precipitados de la anestesia en este momento. </li><li> Para eliminar escamas, pinzas posición paralela a los peces con punta en el borde de la escala. Presione lado plano de las pinzas ligeramente en el lado del pescado para causar la escala para elevar desde el cuerpo de los peces. Sujete escala con pinzas, desplume, y lugar (sin inversión) en placa de cultivo de tejidos. Repita el procedimiento, la eliminación de un máximo de 12 escalas de un adulto grande (6 de cada lado), evitando la región branquial, la línea lateral, y las aletas. </li><li> Coloque el pescado en el vaso de recuperación y seguimiento para asegurar que se recupera de los efectos de la anestesia. En este momento, los peces pueden ser transferidos a un tanque individual. Deje que el pescado para recuperar por lo menos durante 21 días para permitir la regeneración completa escala. </li><li> Dependiendo de ladiseño experimental, colocar hasta 20 escalas por plástico 35 mm placa de cultivo de tejidos tratados o 4 - 6 escalas por vaso plato de fondo. Permitir escalas a que se adhieran a la placa antes de añadir suavemente los medios de comunicación a fin de no separar escalas, desde el plato. NOTA: Con la experiencia, varios peces pueden ser procesados ​​antes de añadir medios de comunicación para el primer plato. </li><li> Añadir 1,2 ml de medio completo (ver 1.2) en cada placa de 35 mm. </li><li> Preferiblemente cultivos de explantes se incuban a 28 ° C en 5% de CO 2 durante el periodo de tiempo deseado con o sin tratamiento adicional. Alternativamente, se incuban las culturas en una platina del microscopio calentado o dentro de una cámara de cultivo de células vivas para la microscopía de vídeo. </li></ol> 3. Campo claro y microscopía de vídeo <ol><li> Platos de posición que contienen láminas de células en la platina del microscopio y se centran inicialmente utilizando la lente del objetivo 4X. NOTA: aumentos superiores, se pueden utilizar, dependiendo del experimento. Marcar la ubicación decada hoja y / o la orientación del plato en la etapa de célula facilitarán la toma de imágenes en el tiempo con las hojas en aproximadamente la misma orientación. </li><li> Sacar los recipientes de la incubadora y la fotografía en diversos puntos temporales, de acuerdo con cada protocolo experimental y colocar de nuevo en la incubadora si se necesitan sólo imágenes fijas sobre el marco de tiempo experimental. </li><li> Durante la realización de la microscopía de vídeo, preste atención a lo siguiente: <ol><li> Coloque la escala / lámina de células emergente dentro del campo de visión de tal manera que la lámina de células migrar permanece en el campo de vista de la duración del vídeo. NOTA: Esto puede tomar un poco de experiencia en la observación de cómo las células migran de debajo de la escala. Para vídeos cortos, esto es una preocupación menor que para vídeos más largos. </li><li> Para plazos más cortos, se incuba a RT. Para plazos más largos (18 + hr), utilice una etapa climatizada o una cámara de incubación para mantener la temperatura, el equilibrio del pH, y para minimizar la evaporación de la cultura medio. </li></ol></li></ol> 4. Fijación para microscopía de inmunofluorescencia <ol><li> Preparar y pre-caliente todas las soluciones a 28 ° C. Con el fin de ver los queratocitos bajo de fluorescencia, crecer cultivos de explantes como se ha descrito anteriormente usando 35 mm platos de cultivo de tejidos con fondo de vidrio. También puede utilizar la cámara de diapositivas de vidrio. </li><li> Añadir 0,8 ml de paraformaldehído al 4% en PBS 1,1x a cada plato. No retire el medio de cultivo primera. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min y aspirar para eliminar la solución. </li><li> Añadir 0,8 ml de paraformaldehído al 4% en PBS 1,1x a cada plato. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min y aspirar para eliminar la solución. </li><li> A menos que el uso de ligandos externos o epítopos externos, permeabilizar las células mediante la adición de 0,5 ml de 0,2% Triton X-100 en PBS 1X. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min y aspirar para eliminar la solución. </li><li> Añadir 0,5 ml de 1% de BSA en PBS 1x y se incuba durante 1 hr (a temperatura ambiente) o O / N (a 4 ° C). NOTA: Dependiendo de las condiciones experimentales, phalloidin se puede añadir en este paso. </li><li> Después de la incubación, aspirado para eliminar la solución y proceder con la tinción de anticuerpos. Alternativamente, almacenar las placas de cultivo mediante la adición de al menos 1 - 2 ml de 1% de BSA en PBS 1x por 3 - 4 semanas a 4 ° C. </li></ol> Protocolo 5. Inmunofluorescencia <ol><li> Preparar soluciones de anticuerpos primarios y secundarios de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. NOTA: Si las recomendaciones del fabricante no están disponibles, una buena dilución de partida de anticuerpos primarios (en 1% de BSA en PBS 1x) es de 1: 500 para policlonales y 1: 1000 de anticuerpos monoclonales; una buena dilución de partida para anticuerpos secundarios es 1: 1000. Ajuste estas diluciones de la población original obtenido del fabricante más alto si la señal es débil, inferior si la señal es fuerte y el fondo es un problema. </li><li> Aspirar el BSA 1% en solución 1x PBS. Añadir 0,5 ml de solución de anticuerpo primario y se incuba durante 1 hr (a temperatura ambiente) o O / N (a 4 ° C). </li&gt; <li> Eliminar la solución de anticuerpo primario, coloque en un lugar limpio y etiquetado 1,5 ml tubo de microcentrífuga, y congelar a -20 ° C. NOTA: Esto permite la reutilización de la primaria de anticuerpos, si es necesario. </li><li> Lavar el plato de 3 - 5 veces con PBS 1x, retirar y desechar el PBS después de cada lavado. </li><li> Añadir 0,5 ml de solución de anticuerpo secundario. Si lo desea, agregue phalloidin fluorescente marcada con (siguiendo concentración recomendada de cualquier fabricante) durante este paso. Incubar durante 1 h (a temperatura ambiente) o O / N (a 4 ° C). NOTA: El uso de phalloidin fluorescente marcado permite la visualización de los filamentos de actina; hemos encontrado que faloidina 488 marcado funciona mejor en nuestros queratocitos pez cebra, pero otros fluoróforos se pueden utilizar. </li><li> Retire y deseche la solución de anticuerpo secundario. </li><li> Lavar el plato de 3 - 5 veces con PBS 1x, retirar y desechar el PBS después de cada lavado. NOTA: El plato se puede almacenar, protegido de la luz, a 4 ° C si no puede competirw inmediatamente; asegúrese 1x PBS se añade en el plato antes de guardarla para asegurar que las células no se sequen, pero cálido a RT (20 - 30 min), luego retire la PBS justo antes de pasar al siguiente paso. </li><li> Cuando esté listo para observar, añadir 2-3 gotas de medio de montaje, con o sin DAPI, dependiendo de las necesidades experimentales, en el plato y dejar reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Utilizamos un medio de montaje disponible en el mercado, basado en glicerol con DAPI, pero otros medios de montaje se puede utilizar. Permitir 10 min para el medio de montaje para sentarse en el plato facilita la eliminación fácil de la cubreobjetos de vidrio desde el fondo del plato. </li><li> Después de la incubación, apretar suavemente en los lados del plato para aflojar y retirar el cubreobjetos. Añadir una caída adicional de los medios de montaje en un portaobjetos de vidrio y colocar el cubreobjetos, las células hacia abajo, sobre el portaobjetos. NOTA: Considere sellar el cubreobjetos al portaobjetos usando esmalte de uñas transparente si la diapositiva debe mantenerse durante más de 1-2 días. </li><li> Observe el portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia. NOTA: La mayoría de nuestras imágenes fueron tomadas usando un lente objetivo de 40X o 63X con aceite de inmersión, pero el lente objetivo específico utilizado dependerá del protocolo experimental. </li></ol>

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<li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li>
<li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellula.%2C+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li>
<li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El paso más crítico para el éxito del cultivo de explantes de queratocitos está permitiendo que la escala se adhiera a la placa de cultivo durante aproximadamente 2 - 3 minutos antes de la adición del medio de cultivo. Aproximadamente el 75% de las escalas se adherirá y crecer hojas (necesitará el número de cultivos establecidos para cada experimento que ajustarse en consecuencia). Hojas de queratocitos no forman alrededor de cada escala extraerán de los peces y se colocan en cultivo durante varias razones. En primer lu...

<html> Estudios de la motilidad celular se han centrado tradicionalmente en la migración de las células de forma individual. Queratocitos cultivados de pescado y explantes de anfibios han demostrado ser un poderoso sistema modelo para estudiar los mecanismos de la motilidad celular utilizando modelos experimentales y matemáticos enfoques 1-6. El trabajo experimental en células que migran de forma individual es ayudado por el movimiento de deslizamiento rápida, suave de las células, mientras que mantiene una forma uniforme, la velocidad y dirección. Sin embargo, in vivo, las células se mueven frecuentemente colectivamente manteniendo al mismo tiempo las uniones célula-célula, en particular durante la embriogénesis, la cicatrización de heridas, y la metástasis. Por lo tanto, la migración celular colectiva es un área en crecimiento y cada vez más importante de la investigación en el campo de la migración celular. La migración colectiva de estas células ha sido recientemente descrito 7 y tiene muchas características únicas que lo hacen un potente sistema para estudiar la migración celular colectiva en un modelo de cicatrización de la herida. ove_content &quot;&gt; Cuando escalas son arrancadas de un pez cebra adultos anestesiados, algo de tejido epitelial permanece unido a la parte inferior de la escala. Cuando se añade medio de cultivo celular, estas células epiteliales, o queratocitos, migran rápidamente como una unidad colectiva de la escala. La cultivo de explantes puede ser visto como un modelo de curación de heridas epiteliales, en la que las células migran desde el explante como lo harían a través de la matriz provisional de un lecho de la herida para restablecer un epitelio intacto. Los datos recientes sugieren que este cultivo ex vivo imita muchas características de in vivo la cicatrización de heridas en adultos de pez cebra. tasas de cierre de la herida 8 se traducen a una velocidad de migración similar a la observada en el sistema ex vivo 7. Además, en una herida in vivo modelo de curación, el tratamiento con warfarina sugiere que la hemostasia no tiene ningún efecto sobre la tasa de de la curación, mientras que el tratamiento con hidrocortisona para reducir la respuesta inmune no retrasa reepitelización 8 </sup&gt;. A medida que el pez cebra no sangra cuando se retira la escala del animal, la hemostasis no es un jugador importante. Aunque hemos encontrado células inmunes en explantes, no hemos estudiado los efectos que puedan tener sobre la migración celular colectiva. El protocolo presentado aquí describe cómo establecer cultivos de explantes de queratocitos de pez cebra que garanticen la coherencia y reproducibilidad para su uso en muchos ensayos biológicos. Estos cultivos de explantes son particularmente convincente un modelo in vitro para la migración celular colectiva por varias razones. En primer lugar, los queratocitos de pez cebra son células primarias usadas dentro de los horarios de establecer cultivos de explantes. Por lo tanto, estas células no se han sometido a los cambios morfológicos y de expresión de genes asociados con el paso de las células primarias 9-13. En segundo lugar, este sistema representa un modelo para el estudio de la reepitelización en respuesta a heridas y 14, como parte de la respuesta a heridas, una epitelial a mesenquimal trproceso ansition (EMT) se inicia como se evidencia por los cambios en la expresión génica y reordenamientos del citoesqueleto 14,15. Por lo tanto, los cambios de fondo en la expresión génica y la motilidad que se producen en las células no tratadas se han caracterizado y proporcionar un contexto para interpretar los cambios con el tratamiento. Además, la queratocitos pescado y el queratinocito humano son funcionalmente equivalentes; ambas son las células epiteliales primarias de sus respectivos especies y juegan un papel clave en la cicatrización de la herida epitelial. En tercer lugar, el pez cebra adultos están ganando reconocimiento como un sistema modelo para una variedad de enfermedades humanas 16-18 incluyendo el melanoma y otros cánceres 19-21, la curación de heridas cutáneas 8,14 y el tejido de regeneración 22-24. Las ventajas técnicas de este modelo de sistema son igualmente convincente. Un creciente número de líneas mutantes y transgénicos están disponibles sin fines de lucro, instalaciones centralizadas. En concreto, el Proyecto Mutación pez cebra (ZMP) En el Wellcome Trust Sanger Institute tiene como objetivo crear un alelo nocaut en cada proteína del gen de codificación en el genoma del pez cebra. Actualmente, se han mutado 11.892 genes, aproximadamente el 45% del genoma, con 24.088 alelos caracterizados. Además, ZMP acepta propuestas y generará de forma gratuita knock-outs. Métodos recientes en caída gen en larvas y adultos de pez cebra 25-28 proporcionan flexibilidad para estudiar la función de genes de desarrollo importantes para las que los enfoques transgénicos son problemáticos o poco práctico. Debido a sus muy rápidas tasas de la motilidad de ~ 145 micras / hr poco después de establecimiento de cultivos 29, los ensayos se pueden completar rápidamente (normalmente en 24 horas o menos). Como experimentos se pueden completar rápidamente y culturas crecen bien a TA, varios de los obstáculos técnicos asociados con la que se evitan los ensayos de migración de células de mamíferos que implican la microscopía de video. Además, en la edad de apriete presupuestos de investigación, zebrafish se mantienen fácilmente ya bajo costo. La estructura y el comportamiento del explante es compleja. Como los peces no sangran cuando se retira la escala, es poco probable que mucho más que las capas epidérmicas superficiales se eliminan con la escala. Queratocitos parecen ser el tipo celular predominante en el explante, cuando las escalas se eliminan inicialmente a partir de los peces como la gran mayoría de las células parece teñir con un anticuerpo anti-E-cadherina 14. Además, no hay evidencia de fibroblastos en el cultivo inicial a juzgar por la ausencia de tinción por inmunofluorescencia 14 vimentina. Sin embargo, con extracción repetida escala, parece que hay numerosos neutrófilos en el explante (ver video 1). Hemos identificado estas células como los neutrófilos basadas en las observaciones morfológicas de su tamaño, rápidamente la motilidad, y su migración fuera de la lámina de células cuando se exponen a LPS (datos no mostrados). Además, estas células se tiñen ingenio brillantesh un anticuerpo para el factor citosólico de neutrófilos, así como con una variedad de anticuerpos IgG secundarias, lo que indica que tienen abundantes FcRs en su superficie (datos no mostrados). Múltiples capas de células están presentes en el explante. La microscopía confocal revela la presencia de una sola capa cerca del borde que conduce a más de dos capas de queratocitos cerca de la escala con neutrófilos visibles por encima, por debajo y entre las hojas de queratocitos celular. En los puntos de tiempo tempranos, las células en el borde del explante polarize multi-capa, iniciando la migración colectiva de los queratocitos del explante a tasas iniciales de ~ 145 micras / hr. El área cubierta por el explante aumenta rápidamente, dando lugar a la propagación de células, la tensión dentro de la lámina, y una disminución de la tasa de avance del borde de ataque. Interconversiones rápidos entre las células líder y seguidora se observan en el borde de ataque durante la formación y el cierre de los agujeros formados espontáneamente dentro de la hoja 7. Como elEMT proceso iniciado con el explante continúa, los fragmentos de hoja y los queratocitos pierden su motilidad rápida especializada. La expresión de genes y cambios morfológicos consistentes con EMT, cicatrización de heridas y las respuestas inflamatorias se producen dentro de los 7 días de cultivo con explantes se consideran viables durante aproximadamente 10 días 14.

<table><tbody><tr><td>Placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm (recubiertas de lisina Poly-D)</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td> El <td>grosor de 1,5 mm es el mejor para la eliminación de cubreobjetos. El diámetro de 14 mm proporciona más área de cultivo.</td></tr><tr><td>Pinzas Swiss Jewelers Style, Integra, Miltex 17-303</td><td>VWR</td><td>21909-460</td><td>Descubrimos que las pinzas estrechas y finas son las mejores para la eliminación de incrustaciones.</td></tr></tbody></table>

pez cebra queratocitos explantes para estudiar la migración celular colectiva y reepitelización en curación de heridas cutáneas

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Debido a sus propiedades únicas móviles, queratocitos de pescado disociarse de largo se han utilizado cultivos de explantes para estudiar los mecanismos de la migración de células individuales. Sin embargo, cuando se establecen los explantes, estas células también se mueven en conjunto, manteniendo muchas de las características que hacen individuo queratocitos un modelo atractivo para estudiar la migración: las tasas rápidas de la motilidad, extensa laminillas actina-ricos con un cable de actina perpendicular y velocidad relativamente constante y dirección de la migración. En los primeros explantes, la rápida interconversión de células que migran de forma individual con aquellos que migran colectivamente permite el estudio del papel de las adherencias célula-célula en la determinación del modo de la migración, y hace hincapié en los enlaces moleculares entre los dos modos de migración. Las células en explantes posteriores pierden su capacidad de migrar rápidamente y colectivamente como un epitelial a mesenquimal se produce y genes asociados con la curación de heridas y la inflamación se expresan diferencialmente. Por lo tanto, los explantes de queratocitos pueden servir como un modelo in vitro para la reepitelización que se produce durante la curación de heridas cutáneas y puede representar un sistema único para estudiar los mecanismos de la migración celular colectiva en el contexto de un programa definido de cambios de expresión génica. Una variedad de líneas de pez cebra mutantes y transgénicos están disponibles, lo que permite explantes que se establecerán a partir de peces con diferentes antecedentes genéticos. Esto permite que el papel de las diferentes proteínas dentro de estos procesos que debe abordarse de forma única. Los protocolos descritos aquí describen un método fácil y eficaz para el establecimiento de estos cultivos de explantes para su uso en una variedad de ensayos relacionados con la migración celular colectiva.

Como se ilustra en la Figura 1, hojas de queratocitos se pueden observar la migración hacia fuera de debajo de la escala dentro de hora de establecer el cultivo de explantes. De vez en cuando, un queratocitos migración individual que se ha desprendido de la hoja colectivamente migración se puede observar. Además, como el explante se estableció a partir de un pescado que habían sido hechas anteriormente, existen abundantes neutrófilos que migran a través de la hoja. En períodos de cultivo más largas, los...

Queratocitos de pez cebra migran en láminas de células a partir de explantes y proporcionan un modelo in vitro para el estudio de los mecanismos de migración celular colectiva en el contexto de la cicatrización de la herida epitelial. Estos protocolos detalle una forma efectiva para establecer cultivos de explantes primarios para su uso en ensayos de migración celular colectivos.

Pez cebra queratocitos explantes para estudiar la migración celular colectiva y reepitelización en Curación de Heridas cutáneas

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer cultivos de explantes de queratocitos de pez cebra para su uso en estudios de migración celular colectiva y cicatrización de heridas epiteliales. Esto se logra primero retirando las escamas con el tejido epitelial adherido del pez cebra adulto anestesiado. Las escamas con el tejido adherido se colocan en una placa de cultivo para permitir que las células se adhieran.Luego se añade el medio de cultivo junto con cualquier tratamiento indicado por el diseño experimental. Finalmente, las células se incuban y se observan mediante microscopía de video durante el período de tiempo deseado. En última instancia, se puede utilizar una variedad de ensayos para demostrar cambios en la migración o en la morfología celular, así como en la expresión de proteínas u otros marcadores a lo largo del tiempo.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el método de cultivo celular por transformación, es que los cultivos de explantes son primarios y se asemejan estrechamente a las propiedades de las células in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cicatrización epitelial de heridas, como el papel de la migración colectiva y la transición epitelial a mesenquimal. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las escamas pueden no adherirse a la superficie de crecimiento o pueden no desarrollarse en un plato de cultivo determinado.Este procedimiento será demostrado por Jose Rap PanIN, estudiante de medicina, y Chana TI y Agnes Pasquale, ambos asociados principales de investigación en mi laboratorio. Para prepararse para este experimento, desclorine aproximadamente 1,5 litros de agua del grifo utilizando un agente desclorinante comercial o dejando el agua reposar durante 24 horas, y luego use 500 mililitros para llenar cada uno de tres vasos de precipitados de un litro. Etiquete un vaso para mantener los peces antes de cualquier procedimiento, un segundo vaso para la recuperación y el tercer vaso.Añada 100 microgramos por mililitro de trica. Para anestesiar los peces, llene una bandeja poco profunda con hielo. Caliente el medio de cultivo a temperatura ambiente y prepare pinzas de joyero limpias.Limpie las pinzas sumergiendo las puntas en etanol al 70 % y páselas a través de un mechero Bunsen, permitiendo que el etanol se queme. Capture el número deseado de peces y colóquelos en un vaso de precipitados de contención. Transfiera un solo pez al vaso de precipitados con anestesia.Después de anestesiar el pez según el protocolo descrito, transfiéralo al hielo y colóquelo en posición horizontal con la cola orientada hacia la mano que sostiene la pinza. Para retirar las escamas, coloque la pinza paralela al pez. Con la punta en el borde de una escama, presione ligeramente el lado plano de la pinza contra el costado del pez para hacer que la escama se levante del cuerpo del animal.Utilice las pinzas para sujetar la escama, luego extráigala y, sin darle la vuelta, colóquela en la placa de cultivo de tejidos. Repita el procedimiento, retirando un máximo de 12 escamas de un adulto grande, evitando la región branquial, la línea lateral y las aletas. Coloque el pez en el vaso de recuperación y monitoree para asegurar que se recupere de los efectos de la anestesia.Luego, transfiera el pez a un tanque individual y permita que se recupere durante 21 días para permitir la regeneración completa de las escamas. Dependiendo del experimento, coloque hasta 20 escamas por placa de plástico de 35 milímetros tratada para cultivo de tejidos, o cuatro a seis escamas por placa de vidrio.Plato inferior, permita que las escamas se adhieran al plato antes de agregar suavemente 1.2 mililitros de medio completo a cada placa de cultivo. Incube las culturas de X explante a 28 grados Celsius durante el período deseado, con o sin tratamiento, para realizar microscopía. Después de retirar una placa que contenga láminas celulares del incubador, colóquela en la platina del microscopio.Utilice un objetivo de 4x para enfocar inicialmente y facilitar la toma de imágenes a lo largo del tiempo. Marque la ubicación de cada lámina celular y/o la orientación del recipiente sobre la platina. Fotografíe las láminas celulares en diversos puntos temporales según el protocolo experimental, y si solo se necesitan imágenes fijas para el experimento, colóquelas nuevamente en el incubador.Para fijar muestras para microscopía de inmunofluorescencia, prepare y caliente previamente las soluciones a temperatura ambiente. Para observar los sitios OSE mediante fluorescencia, utilice placas de cultivo de 35 milímetros con fondo de vidrio para cultivar berenjenas como se describió anteriormente en este video; sin eliminar el medio de cultivo, agregue 0,8 mililitros de paraformaldehído al 4 % en 1,1 XPBS a cada placa. Incube a temperatura ambiente durante cinco minutos.Luego aspire la solución. Añada un volumen adicional de 0,8 mililitros de fijador a cada placa y, tras una segunda incubación de cinco minutos, aspire la solución. A menos que se utilicen ligandos o epítopes externos, permeabilice las células añadiendo 0,5 mililitros de TRITON X-100 al 0,2 % en PBS 1X e incube durante cinco minutos.Antes de eliminar la solución, añada 0,5 mililitros de BSA al 1 % en un XPBS e incube a temperatura ambiente durante una hora o a cuatro grados Celsius durante la noche. Después de la incubación, aspire la solución y continúe con la tinción de anticuerpos. Alternativamente, añada uno a dos mililitros de BSA al 1 % en un XPBS y almacene a cuatro grados Celsius durante tres a cuatro semanas. Realice la inmunofluorescencia.Según el protocolo descrito en el texto y que se ilustra aquí, se pueden observar láminas de queratocitos migrando desde debajo de la escama en cuestión de horas tras establecer el cultivo EXPLAN. Ocasionalmente, puede observarse un queratinocito migrando individualmente, que se ha separado de la lámina que migra colectivamente. La velocidad inicial del avance de la lámina es extremadamente rápida, pero esta velocidad disminuye rápidamente a medida que las células se expanden durante las primeras 48 horas de cultivo.El aumento rápido no está asociado con la proliferación celular, ya que tras la marcación durante 24 horas con EDU fluorescente, aproximadamente el 10 % de las células muestra evidencia de división celular, una tasa mucho más baja que la observada en líneas celulares transformadas. Cuando se añade un tratamiento en el momento en que se establecen las X explan, algunos compuestos alteran la migración colectiva de las células. Por ejemplo, como se muestra aquí, algunos inhibidores de las MMP reducen el área de la lámina celular tras 24 horas.En cultivo, cuando se añade al medio de cultivo un péptido que contiene RGD soluble para interrumpir la formación de adhesiones, las láminas en el borde delantero de la lámina se reducen rápidamente y posteriormente el borde delantero de la lámina se desprende y retrae en menos de dos minutos. Para evaluar la localización de proteínas dentro de la lámina o dentro de las células líderes y seguidoras, se puede fijar y teñir toda la lámina como se muestra en esta figura. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 10 a 15 minutos si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar añadir el medio de cultivo precalentado solo después de permitir tiempo suficiente para que las células se adhieran al recipiente de cultivo siguiendo este procedimiento.Se puede realizar otro método como la PCR cuantitativa para responder cualquier pregunta adicional, como los cambios en la expresión génica en relación con el tiempo y/o la condición de tratamiento. Después de observar este procedimiento, debería tener una idea mucho más clara de cómo establecer cultivos de IDE para su uso en una variedad de procedimientos.

zebrafish-keratocyte-explants-to-study-collective-cell-migration

Research

Investigación

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Developmental Biology

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