Pez cebra queratocitos explantes para estudiar la migración celular colectiva y reepitelización en Curación de Heridas cutáneas

El objetivo general de este procedimiento es establecer cultivos explanados de queratocitos de pez cebra para su uso en estudios de migración celular colectiva y cicatrización de heridas epiteliales. Esto se logra primero retirando las escamas con tejido epitelial adherido del pez cebra adulto anestesiado. Las escamas con tejido adherido se colocan en una placa de cultivo para permitir que las células se adhieran.

A continuación, se añade el medio de cultivo junto con los tratamientos indicados por el diseño experimental. Finalmente, las células se incuban y se observan mediante videomicroscopía durante el período de tiempo deseado. En última instancia, se puede utilizar una variedad de ensayos para demostrar cambios en la migración o la morfología celular, así como la expresión de proteínas u otros marcadores a lo largo del tiempo.

La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente, como el método de cultivo celular transformado, es que el cultivo de explantes es primario, que se reensambla estrechamente a las propiedades de la célula in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cicatrización de heridas epiteliales, como el papel de la migración colectiva y la transición epitelial a mesenquimatosa. Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades porque es posible que las escamas no se adhieran a la superficie de crecimiento o que no crezcan en una placa de cultivo determinada.

Para demostrar este procedimiento estarán José Rap, estudiante de medicina de PanIN, Chana TI y Agnes Pasquale, ambos investigadores asociados senior en mi laboratorio. Para prepararse para este experimento, declore aproximadamente 1,5 litros de agua del grifo usando un agente de decloración comercial o dejando reposar el agua durante 24 horas, luego use 500 mililitros para llenar cada uno de los tres vasos de precipitados de un litro. Etiquete un vaso de precipitados para sujetar los peces antes de cualquier procedimiento, y un segundo para la recuperación del tercer vaso de precipitados.

Agrega 100 microgramos por mililitro de trica. Para anestesiar a los peces, llene una bandeja poco profunda con hielo. Caliente el medio de cultivo a temperatura ambiente y recoja pinzas de joyero limpias.

Limpie las pinzas sumergiendo las puntas en etanol al 70% y pasándolas por un mechero bunsen, permitiendo que el etanol se queme. Atrape el número deseado de peces y colóquelo en un vaso de precipitados. Transfiera un solo pez al vaso de anestesia.

Después de anestesiar el pez de acuerdo con el protocolo de texto, transfiéralo a hielo y colóquelo horizontalmente con la cola hacia la mano que sostiene las pinzas. Para quitar las escamas, coloque las pinzas paralelas al pescado. Con la punta en el borde de una escamas, presione el lado plano de las pinzas ligeramente en el costado del pez para hacer que la escama se eleve del cuerpo del pez.

Use las pinzas para agarrar la escala, luego sáquela y, sin invertirla, colóquela en la placa de cultivo de tejidos. Repita el procedimiento, quitando un máximo de 12 escamas de un adulto grande, evitando la región branquial, la línea lateral y las aletas. Coloque el pez en el vaso de recuperación y vigile para asegurarse de que se recupera de los efectos de la anestesia.

Luego, transfiera los peces a un tanque individual y permita que los peces se recuperen durante 21 días para permitir la regeneración completa de las escamas. Dependiendo del experimento, coloque hasta 20 escamas por plástico. Plato tratado con cultivo de tejidos de 35 milímetros, o de cuatro a seis escamas por vaso.

Plato inferior, deje que las escamas se adhieran al plato antes de agregar suavemente 1,2 mililitros de medio completo a cada plato de cultivo. Incubar los cultivos X explan a 28 grados centígrados durante el período de tiempo deseado con o sin tratamiento para realizar microscopía. Después de retirar una placa que contiene láminas de células de la incubadora, colóquela en la etapa del microscopio.

Utilice un objetivo de cuatro veces para enfocarse inicialmente y facilitar la toma de imágenes a lo largo del tiempo. Marque la ubicación de cada hoja de celda y/o la orientación del plato en el escenario. Fotografíe las hojas de células en varios puntos de tiempo de acuerdo con el protocolo experimental, y si solo se necesitan imágenes fijas para el experimento, colóquelas nuevamente en la incubadora.

Para fijar muestras para microscopía de inmunofluorescencia, prepare y precaliente las soluciones a temperatura ambiente. Para ver los sitios OSE bajo fluorescencia, use placas de cultivo de placas de 35 milímetros con fondo de vidrio para cultivar berenjenas como se describe anteriormente en este video, sin quitar el medio de cultivo, agregue 0.8 mililitros de paraldehído al 4% en 1.1 XPBS a cada placa. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.

A continuación, aspire la solución. Agregue 0,8 mililitros adicionales de fijador a cada plato y, después de una segunda incubación de cinco minutos, aspire la solución. A menos que se utilicen ligandos o epítopos externos, perme las células añadiendo 0,5 mililitros de 0,2%TRITTON X 100 en una incubación XPBS durante cinco minutos.

Antes de retirar la solución, añadir 0,5 mililitros de BSA al 1% en un XPBS, e incubar a temperatura ambiente durante una hora o a cuatro grados centígrados durante la noche después de la incubación, aspirar la solución y proceder a la tinción de anticuerpos. Alternativamente, agregue uno o dos mililitros de 1% BSA en un XPBS y almacene a cuatro grados centígrados durante tres o cuatro semanas. Realizar inmunofluorescencia.

De acuerdo con el protocolo de texto que se ilustra aquí, se puede observar que las láminas de queratocitos migran desde debajo de la escala a las pocas horas de establecer el cultivo EXPLAN. Ocasionalmente, se puede observar un queratinocito migratorio individual, que se ha desprendido de la lámina migratoria colectiva. La tasa inicial de avance de la hoja es extremadamente rápida, pero esta tasa se ralentiza rápidamente a medida que las células se propagan durante las primeras 48 horas de cultivo.

El rápido aumento no se asocia con la proliferación celular, ya que después de marcar durante 24 horas con la EDU fluorescente, aproximadamente el 10% de las células muestran evidencia de división celular, una tasa mucho más baja que la observada en las líneas celulares transformadas. Cuando se añade el tratamiento en el momento en que se establecen X explan, algunos compuestos alteran la migración celular colectiva. Por ejemplo, como se muestra aquí, algunos inhibidores de MMP disminuyen el área de la lámina celular después de 24 horas.

En el cultivo, cuando se añade al medio de cultivo un péptido soluble que contiene RGD para interrumpir la formación de adhesión, la capa débil en el borde delantero de la lámina se contrae rápidamente y, posteriormente, el borde delantero de la lámina se desprende y se retrae y en menos de dos minutos para evaluar la localización de las proteínas dentro de la lámina o dentro de las células litro y seguidoras, Toda la hoja se puede fijar y teñir como se muestra en esta figura. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 10 a 15 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar agregar medios de cultivo precalentados solo después de dejar tiempo para que los cites se adhieran a la placa de cultivo Siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como la QPCR para responder a cualquier pregunta adicional, como los cambios en la expresión génica en relación con el tiempo o las condiciones del tratamiento. Después de ver este procedimiento, debería tener una idea mucho mejor de cómo establecer culturas explan de IDE para su uso en una variedad de procedimientos.