Name: La manipulación y In Vitro La maduración de Xenopus laevis Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprende a manipular ovocitos inmaduros de Xenopus laevis para estudiar el desarrollo embrionario mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite degradar proteínas maternas y sobreexpresar genes específicos.

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Estamos agradecidos a los miembros del laboratorio Gurdon por su útil discusión. K.M. es investigador en Wolfson College y cuenta con el apoyo de la beca postdoctoral Herchel Smith y la Fundación Sasakawa de Gran Bretaña. El laboratorio de Gurdon cuenta con el apoyo de subvenciones del Wellcome Trust (RG69899) y el MRC a J.B.G.

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<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li>
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<li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+%27autocatalytic%27+nature+of+the+maturation+promoting+factor+%28MPF%29+in+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li>
<li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).</li>
<li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+RNA%2FCas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nos detalle aquí un nuevo método para agotar factores maternos o para sobreexpresar factores exógenos antes de la fertilización. Este sistema requiere dos microinyecciones, pero en su lugar se salta de la cirugía de las ranas, utilizado en el método de transferencia de 7,17 host. Es óptimo para eliminar el paso de la cirugía rana en términos de cuidado de los animales. Por otra parte, no tenemos que tener en cuenta para la calidad de las ranas hembra de acogida para los experimentos de transferencia, lo que significa que podemos deshacernos de un factor biológico que afecta el éxito de los experimentos. Por lo tanto en este sistema la calidad de los ovocitos obtenidos de ranas cebados con PMSG es un factor biológico importante que es la clave para experimentos exitosos. La calidad de los ovocitos puede ser juzgado después de la recogida de ovario o después defolliculation. Si se observa alguna anomalía en estas etapas, es óptimo para recoger otro ovario de una nueva rana. Otro punto en el que se puede comprobar la calidad de los ovocitos es después de la maduración de ovocitos. Si es menos de 80% de progesteronaovocitos e tratados muestran signos de maduración, es posible que no pueda obtener el número suficiente de embriones para otros análisis. El uso de defolliculation enzimática en lugar de defolliculation manual es también otra ventaja de utilizar este sistema para reducir la mano de obra requerida para defolliculation. Sin embargo, todavía es posible que defolliculation manual puede dar un mejor desarrollo que el tratamiento enzimático. Como se muestra en la Figura 3, casi 10% de los ovocitos madurados in vitro se puede llegar a la etapa de natación renacuajo. Estos datos se recogen de 13 experimentos independientes, incluyendo los reportados en 8 y nuevos experimentos de inyección. Método de transferencia Host necesita 75-150 ovocitos en cada tratamiento para obtener datos significativos desde 30 a 60% de los ovocitos transferidos puede llegar a la etapa neurula 17. Nuestro método normalmente se inicia con 200 a 300 ovocitos en cada grupo experimental ya que aproximadamente el 40-60% de los embriones escindidos puede llegar a laetapa respuesta muscular. Estos datos sugieren que ambos métodos apoyan una tasa de desarrollo razonable. Hasta ahora hemos obtenido 10 ranas vivas de control de mRNA inyectado y control antisentido ovocitos oligo-inyectado utilizando esta técnica, lo que indica que este enfoque apoya el desarrollo a través de la metamorfosis. Nuestro método de manipulación-ICSI de ovocitos ofrece la oportunidad de probar el papel de los factores maternos durante el desarrollo embrionario temprano, poco después de la fertilización. Además, la sobreexpresión de factores de modificación de la cromatina antes de la fertilización puede hacer posible para remodelar la cromatina materna antes de la fertilización para la comprensión de los estados de la cromatina materna necesario para el desarrollo. Esta estrategia también puede trabajar bien con los sistemas de edición gen de actualidad como la transcripción del tipo activador de efector nucleasa (TALEN) 18,19 y CRISPR / CAS9 20,21 ya que éstos pueden expresarse incluso antes de la fertilización. Por lo tanto, nuestro nuevo enfoque tiene un potential que debe utilizarse para muchas aplicaciones en el futuro.

Xenopus laevis es un ampliamente utilizado, poderoso organismo modelo para estudiar el desarrollo 1. Esto es porque los huevos de Xenopus son inusualmente grande (aproximadamente 1.2 a 1.4 mm, en comparación con sus homólogos de mamíferos ser aproximadamente 0,1 mm) y abundante. Los huevos contienen maternalmente sintetizadas y almacenadas componentes, que son suficientes para impulsar el desarrollo embrionario hasta la transición a mediados de blástula (MBT, que se producen en la etapa de 8-8,5 con 4.000-8.000 células). MBT es acompañada por la activación del genoma cigóticos, que entonces produce productos de genes embrionarios que dirigen el desarrollo adicional. Numerosos estudios dirigidos a identificar los factores maternos importantes para el desarrollo. Muchos estudios se basan en la inyección de oligonucleótidos antisentido (oligos) incluyendo oligonucleótidos morfolino en embriones fertilizados, en los que la degradación caso de las proteínas maternas se puede observar en la etapa de gástrula 2-4. Alternativamente, los ARNm se inyectan a em fertilizadobryos que perturban las funciones de genes o para rastrear destinos de proteínas sobreexpresados. Sin embargo, la inyección en los embriones en estadio de una célula que normalmente no afecta a los niveles de expresión de proteínas materna en las primeras etapas embrionarias antes de MBT. Heasman y Wylie establecieron el método de transferencia de acogida para superar este problema 5. En su método, los ovocitos desfolicularon manualmente son inyectados con oligonucleótidos antisentido y se transfirieron a hembras de acogida 6. Las proteínas están regulados a la baja antes de la fertilización para que funciones de las proteínas downregulated en el desarrollo embrionario temprano pueden ser examinados. Este método agotamiento de la madre llevó a la identificación de varias funciones de desarrollo únicas de proteínas maternas, tal como fue revisado en 7. En este informe, detallamos nuestro método recientemente desarrollado, en el que se alcanza el agotamiento materno o sobreexpresión de ARNm antes de la fertilización sin defolliculation manual y transferencia de acogida8. Defolliculation manual requiere una gran cantidad de tiempo y de transferencia de acogida a menudo necesita técnicas de expertos y la licencia específica para la cirugía animal, lo que dificulta el uso frecuente de método de agotamiento de la madre. Defolliculation y transferencia de acogida son sustituidos por defolliculation enzimática 9,10 y la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) 11-13, respectivamente. ICSI a los huevos se utilizó originalmente para producir ranas transgénicos 12. Esperma y embriones de núcleos también fueron trasplantadas en in vitro de ovocitos de anfibios madurado 11,14,15. Aquí, mostramos nuestro método paso a paso para inyectar espermatozoides ovocitos madurados in vitro que fueron pre-inyectados con oligonucleótidos antisentido o ARNm.

<table><tbody><tr><td>Gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG)&nbsp;</td><td>MSD Animal Health</td><td>Vm 01708/4309</td><td>PMSG-Intervet 5000iu polvo y disolvente para solución inyectable</td></tr><tr><td>Sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Liberase TM Grado de investigación</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>Para la defoliculación de ovocitos. Almacene a -20&nbsp; &#176;C.</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-205/206</td> Para capilar de vidrio <td>por microinyección</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Laboratorios Alpha</td><td>7" Drummond #3-000-203-G/XL</td> para extractor de micropipetas de <td>microinyección</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Instrumento SUTTER Modelo</td><td>D-97</td><td>Para microinyección</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Para maduración <>em in vitro</td></tr> y tubo <tr><td>de centrífuga ultra claro ICSI 14 ml&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Reino Unido Ltd</td><td>344060</td><td>Para la purificación de esperma</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>Para la purificación de esperma</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Reactivo de permeabilización celular</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Hybaid&nbsp;</td><td>HB-SHK-1</td><td>Para la desfoliculación de ovocitos</td></tr><tr><td>Microscopio de disección (Microscopio estereoscópico con zoom)</td><td>ZEISS</td><td>Semi SV6</td><td>Para la recogida y microinyección de ovocitos</td></tr><tr><td>50 &mu; filtro de poros m</td><td>CellTrics</td><td>04-0042-2317</td><td>Para la purificación de esperma</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100XP</td><td>Para la purificación de esperma</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 ml</td><td>Cellstar Greiner Bio-One</td><td>227261 o 210261</td><td>Recolección de ovocitos y reacción de desfoliculación</td>tubo de</tr><tr><td>centrífuga de 15 ml</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td>Para la purificación de esperma</td></tr><tr><td>Petri de 90 mm plato&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>101VR20/C</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo celular de fácil agarre, 60&nbsp; x&nbsp; </td><td>Plato</td> de cultivo celular FALCON <td>353004</td><td></td></tr> de fácil agarre de 15 mm<tr><td>, 35&nbsp; x&nbsp; FALCON de 15 mm</td><td></td><td>351008</td><td></td></tr></tbody></table>

la manipulación y<em&gt; in vitro</em&gt; la maduración de<em&gt; xenopus laevis</em&gt; los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Los huevos de anfibios han sido ampliamente utilizados para estudiar el desarrollo embrionario. El desarrollo embrionario temprano es impulsado por factores almacenados por la madre acumulados durante la ovogénesis. Con el fin de estudiar el papel de estos factores maternos en el desarrollo embrionario temprano, es deseable manipular sus funciones desde el comienzo mismo del desarrollo embrionario. Las formas convencionales de interferencia génica se logran mediante la inyección de oligonucleótidos antisentido (oligos) o ARNm en óvulos fertilizados, lo que permite la subexpresión o sobreexpresión de proteínas específicas, respectivamente. Sin embargo, estos métodos normalmente requieren más de varias horas antes de que la expresión de la proteína se vea afectada y, por lo tanto, la interferencia de las funciones de los genes no es efectiva durante las primeras etapas embrionarias. Aquí, presentamos un sistema experimental en el que los niveles de expresión de proteínas maternas pueden ser alterados antes de la fertilización. Los ovocitos de Xenopus laevis obtenidos de los ovarios se defoliculan mediante incubación con enzimas. Los oligonucleótidos antisentido o ARNm se inyectan en ovocitos desfoliculados en la etapa de vesícula germinal (GV). Estos ovocitos maduran in vitro hasta convertirse en óvulos en la etapa de metafase II (MII), seguida de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). De esta manera, hasta el 10% de los embriones de ICSI pueden alcanzar la etapa de renacuajo nadador, lo que permite realizar pruebas funcionales de knockdown o sobreexpresión de genes específicos. Este enfoque puede ser una forma útil de estudiar el papel de los factores almacenados por la madre en el desarrollo embrionario temprano.

El desarrollo embrionario de embriones ICSI utilizando en ovocitos madurados in vitro fue examinado (Figura 3A). Tasas de maduración de ovocitos GV a la etapa MII son variables y dependen en gran medida de la calidad de los ovocitos. En los buenos experimentos, casi el 100% de los ovocitos GV responder a la progesterona y muestran signos de maduración de ovocitos, finalmente convertirse huevos en la etapa MII. Todos los ovocitos madurados fueron sometidos a ICSI y aproximadamente 25% de los huevos inyectados escindidos (Figura 3A, n = 13 para el control revueltos ovocitos oligo-inyectado y n = 7 para no ovocitos oligo-inyectada). Aproximadamente el 60% o 80% de los embriones escindidos, producidos a partir de ovocitos inyectados con oligo de control o de ovocitos no inyectada, respectivamente, alcanzaron la etapa de blástula / gástrula. Entre los embriones blástula / gástrula, aproximadamente la mitad de los embriones en las muestras de oligo-inyectado eran de buena calidad (casi no hay signos de división anormal y apoptosis), mientras que el 82% de los embriones blástula / gástrula eran de buena calidad nmuestras inyectadas en (Figura 3A). Finalmente, 41% y 11% de los embriones escindidos en muestras de oligo-inyectada llegaron a la respuesta muscular y las etapas de natación renacuajo, respectivamente, mientras que el 60% y el 29% de los embriones escindidos en muestras no inyectados hicieron (Figura 3A). Estos embriones ICSI son la mezcla de los embriones normales y anormales (Figura 3B). Algunos de ellos sufren metamorfosis y desarrollar a madurar ranas 8. Estos resultados sugieren que la inyección de oligonucleótidos antisentido en oocitos GV, seguido de IVM y ICSI, permite el desarrollo embrionario temprano eficiente. Aunque la inyección de sí mismo oligos antisentido disminuye el desarrollo embrionario, todavía somos capaces de obtener suficientes embriones para muchos propósitos experimentales como la comprobación de las tasas de desarrollo, RT-PCR, western blot y así sucesivamente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> Higo<html> Ure 1: Ejemplos típicos de Xenopus laevis ovocitos de buena calidad o mala calidad de los experimentos in vitro de maduración. (A) Un ejemplo de ovocitos de mala calidad. Por ejemplo, los ovocitos que muestran la pigmentación irregular no se utilizan para experimentos posteriores. Cada oocito de Xenopus laevis es de aproximadamente 1/2 a 1/4 mm de diámetro. (B) un ovocito parcialmente desfolicularon. La mitad derecha del ovocito está cubierto por las células del folículo, que se pueden discernir por la presencia de vasos sanguíneos. Una flecha muestra un área libre de células del folículo y en la que se inyecta la aguja de inyección. (C) Un ejemplo de ovocitos de buena calidad, que son de igual tamaño y muestran hemisferios animales uniformemente pigmentados con un claro contraste entre el hemisferio animal y el hemisferio vegetal. 2496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2:. Oocitos de Xenopus laevis antes y después de la maduración Después de la maduración de ovocitos, manchas blancas claros aparecen en la parte superior de los hemisferios animales y las células del folículo se pelan. Cada oocito de Xenopus laevis es de aproximadamente 1 mm de diámetro. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> Figura 3: Desarrollo de embriones ICSI, producidos a partir de ovocitos madurados in vitro. (A) Desarrollo de embriones ICSI a cada etapa se resume. Los oocitos fueron inyectados con control mezclado oligonucleótidos antisentido (oligo de inyección de control) o sin inyección (no inyección), seguido de IVM y ICSI. El número correspondiente de embriones en cada etapa se muestra por encima de las barras. Media ± SEM se muestra. N = 4-13 experimentos independientes / diferente females. (B) Ejemplos de sobrevivir embriones ICSI. Estos embriones tailbud etapa fueron producidos en un experimento, en el que se utilizaron aproximadamente 200 ovocitos como material de partida.

Describimos métodos de manipulación de ovocitos inmaduros de Xenopus laevis, maduración in vitro de ovocitos a óvulos e inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite la degradación de algunas proteínas maternas y la sobreexpresión de genes de interés en la fertilización, por lo que es valioso para estudiar el papel de factores específicos en el desarrollo embrionario temprano.

La manipulación y<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

El objetivo del siguiente experimento es silenciar proteínas maternas almacenadas en ovocitos o sobreexpresar proteínas de interés en el momento de la fertilización de los huevos de rana. Esto se logra mediante la inyección de oligonucleótidos antisentido o ARNm en ovocitos inmaduros desregulados enzimáticamente, con el fin de degradar o sobreexpresar una proteína específica. Como segundo paso, los ovocitos se transfieren a un medio que contiene progesterona, lo que induce la maduración de los ovocitos a huevos.A continuación, se inyecta espermatozoides en los óvulos madurados in vitro para observar el efecto del silenciamiento o sobreexpresión en el desarrollo embrionario. En última instancia, el desarrollo de ovocitos inyectados con oligonucleótidos hasta renacuajos nadadores constituye la prueba funcional del silenciamiento o sobreexpresión génica. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el trasplante a hospedadores, es que podemos omitir el proceso quirúrgico en ranas utilizando protocolos estándar.Recolecte un opus sobre SAC que contenga citos sanos en una placa de Petri de nueve centímetros que contenga MBS más ps. Luego, separe el ovario en trozos cuadrados de uno a dos centímetros de ancho. Recolecte aproximadamente cinco mililitros del ovario desmenuzado con citos en un nuevo tubo de 50 mililitros.Luego, enjuague los tejidos con MBS más PS varias veces y recoja los huevos en 15 mililitros de MBS fresco más ps. Ahora, agregue siete unidades de enzima de defoliación a la suspensión e incube la suspensión con agitación suave hasta que estén al menos parcialmente defoliados. Esto tomará al menos una hora después de la incubación.Llene el tubo con MBS más Ps para detener la reacción. Deposite la solución sobre la pared del tubo y no directamente sobre los citos. Deje que los tejidos sedimenten y deseche la solución y el agente.Las c&eacute;lulas peque&ntilde;as e inmaduras flotar&aacute;n y tambi&eacute;n deben descartarse. Repita este paso de lavado un total de 10 veces despu&eacute;s de los lavados. Transfiera las c&eacute;lulas a un plato de nueve cent&iacute;metros con MBS m&aacute;s ps.Transfiera el plato a un microscopio estereoscópico y, a partir de aquí, mantenga los citos entre 16 y 18 grados Celsius tanto como sea posible. Seleccione citos de buena calidad en la etapa seis utilizando la clasificación de Dumont, con una pipeta de vidrio, y reúnalos en un nuevo plato con MBS más ps. Un cito de buena calidad debe tener una pigmentación uniforme en el hemisferio animal y mostrar una separación clara entre el hemisferio animal y el vegetal.También deberían tener todos aproximadamente el mismo tamaño, que sería entre 1,2 y 1,4 milímetros de diámetro. Recolecte de dos a 300 cítos por cada inyección, lo que equivale a unas 1000 cítos por experimento. La calidad del sitio O es clave para el éxito.Si el oviducto presenta alguna anomalía durante la preparación, recomiendo que corrija un ovario de otro grupo y comience de nuevo. En preparación para la inyección del oligonucleótido antisentido, coloque el émbolo metálico de una microinyección en su posición más baja e inserte una capilar de vidrio llena de aceite en el émbolo metálico. Bajo un microscopio de disección, corte la punta de la aguja utilizando tijeras quirúrgicas pequeñas.Prepare una punta lo más pequeña posible. A continuación, láser. Una tira de paraformo sobre la platina del microscopio y sobre ella, agregue tres microlitros de solución de ácido nucleico a una concentración de un microgramo por microlitro.Con esto, llene la punta de la aguja. Si se atrapa aire, la abertura debe hacerse más grande. Ahora haga una marca visible en la aguja de inyección a aproximadamente medio milímetro de la punta.Luego, proceda con la inyección de los cítos para inyectar primero uno, buscando un área libre de células foliculares donde la aguja pueda penetrar. Introduzca la punta a lo largo del límite ecuatorial apuntando al punto central bajo la vesícula germinal. Al mismo tiempo, sostenga firmemente el cito con pinzas en el lado opuesto.Ahora, utilizando el control con interruptor de pedal, expulse la solución, eyectando entre 4,6 y 9,2 nanogramos de oligonucleótidos antisentido o entre 250 picogramos y 13,8 nanogramos de ARN mensajero. Después de inyectar todas las células, transfiéralas a medio de incubación y déjelas incubar unos días para que puedan producirse los cambios. En el proteasoma.Posteriormente, transfiera los citoes con una cantidad mínima de medio a placas de seis centímetros recubiertas con agros que contengan entre cinco y ocho mililitros de medio de maduración. Luego, deje que los citoes se desarrollen en este medio durante 16 horas antes de inyectarles espermatozoides. Para este protocolo, debe prepararse un stock de espermatozoides congelado.Consulte el protocolo escrito tras 16 horas de incubación para la maduración. Transfiera con mucho cuidado los citos a un recipiente de seis centímetros recubierto con extracto de huevo en MBS más PS para lavarlos. Si los citos se manipulan incorrectamente, podrían activarse espontáneamente antes de la ixy.Ahora, cuente los ovocitos maduros y busque manchas blancas que indiquen que la vesícula germinal del ovocito se ha roto. Si menos del 80 % son buenos, colectivamente no son lo suficientemente sanos como para sobrevivir al procedimiento de ixy. Para continuar.Llene un nuevo recipiente con medio de inyección y transfiera delicadamente todos los citoes al recipiente después de media hora. Proceda con la inyección de los citoes maduros con solución de espermatozoides utilizando la misma preparación del inyector descrita para los oligos. Idealmente, debería haber uno o dos espermatozoides por cada 4,6 nanolitros en la solución de inyección.Para probar esta solución de inyección, prepare gotas de la solución de DPI a 0,3 microgramos de DPI por mililitro e inyecte 4,6 nanolitros en dichas gotas. Luego cuente el número de espermatozoides en cada gota mediante microscopía de fluorescencia. Tras confirmar la concentración de espermatozoides, inyecte los citos con 4,6 nanolitros de la solución de espermatozoides.Asegúrese de que el tiempo necesario para inyectar las soluciones permanezca constante e inyecte los ovocitos de forma constante, con pausas mínimas entre inyecciones. Tras cada 100 inyecciones, cambie la solución de espermatozoides. Una vez que se hayan inyectado todos los ovocitos maduros, la placa debe incubarse durante cuatro a cinco horas y luego inspeccionarse.Para embriones que han sufrido escisión, las surcos de escisión pueden no ser tan nítidos como los de embriones fecundados normales; transfiera todos los embriones escindidos al medio de incubación y déjelos incubar durante la noche. Al día siguiente, los embriones sobrevivientes deben transferirse al medio de desarrollo embrionario 0,1 XMMR de embriones ixy. El uso de óocitos madurados in vitro se examinó en buenos experimentos, casi el 100 % de los óocitos con vesícula germinativa respondieron a la progesterona y mostraron signos de maduración.Aproximadamente el 25 % sufrió escisión. Del 60 al 80 % de los embriones escindidos alcanzaron la etapa de blástula, y cerca de un tercio de ellos llegaron a la etapa de renacuajo nadador. Los embriones ixy eran una mezcla de embriones normales y anormales, lo que demuestra que la inyección de antisentido sogo en células germinales vecales, seguida de MVI y Dixie, permitió el desarrollo embrionario temprano.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular las proteínas maternas antes de la factorización.

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