La manipulación y In Vitro La maduración de Xenopus laevis Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario
9 de febrero de 2015
Describimos métodos de manipulación de ovocitos inmaduros de Xenopus laevis, maduración in vitro de ovocitos a óvulos e inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite la degradación de algunas proteínas maternas y la sobreexpresión de genes de interés en la fertilización, por lo que es valioso para estudiar el papel de factores específicos en el desarrollo embrionario temprano.
El objetivo del siguiente experimento es eliminar las proteínas maternas almacenadas en los ovocitos o sobreexpresar proteínas de interés en el punto de fertilización de los huevos de rana. Esto se logra inyectando oligonucleótidos antisentido o ARNm en ovocitos inmaduros desregulados enzimáticamente para degradar o sobreexpresar una proteína específica. Como segundo paso, los ovocitos se transfieren a un medio que contiene progesterona, lo que induce la maduración de los ovocitos a óvulos.
A continuación, los espermatozoides se inyectan en los óvulos madurados in vitro para observar el efecto de la knockdown o la sobreexpresión en el desarrollo embrionario. En última instancia, el desarrollo de ovocitos inyectados en oligonucleótidos en renacuajos nadadores es la prueba funcional de la eliminación o sobreexpresión de genes. La principal ventaja de esta técnica sobre los vasos existentes como el host a la transferencia, es que podemos saltarnos el proceso de cirugía de rana utilizando protocolos estándar.
Recoge una obra sobre SAC que contenga citos sanos en una placa de petro de nueve centímetros que contenga MBS más ps. Luego, separa el ovario en piezas cuadradas de uno a dos centímetros de ancho. Recoja unos cinco mililitros del ovario desgarrado con citos en un nuevo tubo de 50 mililitros.
A continuación, enjuague los pañuelos con MBS plus PS unas cuantas veces y recoja los huevos en 15 mililitros de MBS más ps fresco. Ahora, agregue siete unidades de enzima de defoliación a la suspensión e incube la suspensión con vegetación suave hasta que estén al menos parcialmente defoliadas. Esto tomará al menos una hora después de la incubación.
Llene el tubo con MBS más Ps para detener la reacción. Tire de la solución sobre la pared del tubo y no directamente sobre los citos. Deje que los pañuelos se asienten y deseche la sopa y el agente.
Los citos pequeños e inmaduros flotarán y también deben descartarse. Repita este paso de lavado un total de 10 veces después de los lavados. Transfiera los citos a un plato de nueve centímetros con MBS más ps.
Transfiera el plato a un microscopio de disección y, a partir de aquí, mantenga los citos a 16 a 18 grados centígrados tanto como sea posible. Seleccione los citos de la etapa seis de buena calidad utilizando la clasificación de Dumont con una pipeta de vidrio, recójalos en una nueva placa con MBS más ps. El cite de buena calidad debe tener una pigmentación uniforme en el hemisferio animal y mostrar una clara separación entre el hemisferio animal y el vegetal.
Además, todos deben ser aproximadamente del mismo tamaño, que tendría entre 1,2 y 1,4 milímetros de diámetro. Recoja entre dos y 300 citos para cada inyección, lo que supone unos 1000 citos por experimento. La calidad del sitio O es la clave del éxito.
Si el ósidero muestra alguna anormalidad durante la preparación, le recomiendo que corrija un ovario de un lote diferente y comience de nuevo. En preparación para la inyección del oligonucleótido antisentido, coloque el émbolo metálico de un microinyector en su posición más baja e inserte un capilar de vidrio lleno de aceite en el émbolo metálico. Bajo un microscopio de disección, corte la punta de la aguja con unas tijeras quirúrgicas pequeñas.
Haz una propina lo más pequeña posible. Siguiente láser. Una tira de paraforma en la platina del microscopio y sobre ella Dispense tres microlitros de solución de ácido nucleico a un microgramo por microlitro.
Con esto, llene la punta de la aguja. Si el aire está atrapado, la abertura debe hacerse más grande. Ahora haga una marca visible en la aguja de inyección aproximadamente a medio milímetro de la punta.
Luego proceda con la inyección de los citos para inyectar uno primero, busque un área libre de células foliculares donde la aguja pueda penetrar en esta área. Inserte la punta a lo largo del límite ecuatorial apuntando al punto central debajo de la vesícula germinal. Al mismo tiempo, estabilice el citel con pinzas en el lado opuesto.
Ahora, usando el control del interruptor de pie, expulse la solución, expulse entre 4,6 y 9,2 nanogramos de oligonucleótidos antisentido o entre 250 picogramos y 13,8 nanogramos de ARN mensajero. Después de inyectar todos los citos, transfiéralos al medio de incubación y déjelos incubar unos días para que se produzcan los cambios. En el proteasoma.
Posteriormente, transfiera los citos con una cantidad mínima de medio a platos recubiertos de agros de seis centímetros que contengan de cinco a ocho mililitros de medio de maduración. A continuación, deje que los citos se desarrollen en este medio durante 16 horas antes de inyectarles espermatozoides. Para este protocolo, se debe preparar un stock de esperma congelado.
Consulte el protocolo de texto después de 16 horas de incubación para la maduración. Transfiera con mucho cuidado los citos a un plato recubierto de huevo de seis centímetros con MBS más PS para lavarlos. Si los citos se manipulan incorrectamente, pueden activarse espontáneamente antes del ixy.
Ahora, cuente los citos maduros y busque manchas blancas que indiquen que la vesícula germinal del cito se ha descompuesto. Si menos del 80% son buenos, colectivamente no están lo suficientemente sanos como para sobrevivir al procedimiento ixy. Para continuar.
Llene un plato nuevo con medio de inyección y transfiera delicadamente todos los citos al plato después de media hora. Proceda a inyectar los citos maduros con solución de esperma utilizando la misma preparación inyectora descrita para los oligonucleótidos. Lo ideal es que haya uno o dos espermatozoides por cada 4,6 nanolitros en la solución inyectable.
Para probar esta solución inyectable, haga gotas de solución de DPI a 0,3 microgramos de DPI por mililitro e inyecte 4,6 nanolitros en esas gotas. A continuación, cuente el número de espermatozoides en cada gota mediante microscopía de fluorescencia. Después de confirmar la concentración de espermatozoides, inyecte los citos con 4,6 nanolitros de la solución de espermatozoides.
Asegúrese de que el tiempo necesario para inyectar las soluciones sea constante e inyecte los ovocitos de forma constante con una pausa mínima entre inyecciones. Después de cada 100 inyecciones se intercambia, la solución de esperma. Después de que se hayan inyectado todos los ovocitos maduros, la placa debe incubarse durante cuatro o cinco horas y luego inspeccionarse.
En el caso de los embriones que han sufrido escisión, los surcos de escisión pueden no ser tan claros como los de los embriones fertilizados normales. Transfiera todos los embriones escindidos a los medios de incubación y los deje incubar durante la noche. Al día siguiente, los embriones supervivientes deben ser transferidos a 0,1 XMMR desarrollo embrionario de embriones ixy. El uso de ovocitos maduros in vitro fue examinado en buenos experimentos, casi el 100% de los ovocitos de vesícula germinal respondieron a la progesterona y mostraron signos de maduración.
Alrededor del 25% se sometió a la escisión, entre el 60 y el 80% de los embriones escindidos alcanzaron la etapa de blast gast, y alrededor de un tercio de ellos alcanzaron la etapa de renacuajo nadador. Los embriones ixy eran una mezcla de embriones normales y anormales, lo que demuestra que la inyección del sogo antisentido en los citos vecales germinales, seguida de IVM y Dixie, permitió un desarrollo embrionario temprano.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular las proteínas maternas antes de la factorización.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para manipular ovocitos inmaduros de Xenopus laevis, facilitando su maduración hasta convertirse en óvulos y permitiendo la inyección intracitoplasmática de espermatozoides. El método permite la degradación de proteínas maternas y la sobreexpresión de genes específicos en la fertilización, proporcionando información sobre el desarrollo embrionario temprano.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Biología reproductiva
Antecedentes
- Xenopus laevis es un organismo modelo para estudiar el desarrollo embrionario.
- La manipulación de ovocitos puede revelar los papeles de proteínas específicas en el desarrollo.
- La inyección intracitoplasmática de espermatozoides es una técnica utilizada para estudiar los procesos de fertilización.
- Comprender la dinámica de las proteínas maternas es fundamental para la biología del desarrollo.
Objetivo del estudio
- Para reducir proteínas maternas o sobreexpresar genes de interés en ovocitos.
- Para observar los efectos de estas manipulaciones en el desarrollo embrionario.
- Para mejorar los protocolos existentes para estudiar el desarrollo temprano en ranas.
Métodos Utilizados
- Inyección de oligonucleótidos antisentido o ARNm en ovocitos inmaduros.
- Inducción de la maduración ovocitaria mediante progesterona.
- Inyección intracitoplasmática de espermatozoides en óvulos maduros.
- Observación de los resultados del desarrollo para evaluar los efectos de las manipulaciones.
Resultados principales
- Degradación exitosa de proteínas maternas y sobreexpresión de genes diana.
- Desarrollo de ovocitos inyectados hasta renacuajos nadadores como prueba funcional.
- Demostración de las ventajas de la técnica frente a los métodos tradicionales.
- Conocimientos sobre los roles de proteínas específicas durante las etapas embrionarias tempranas.
Conclusiones
- El protocolo proporciona una herramienta valiosa para estudiar el desarrollo embrionario en Xenopus laevis.
- La manipulación de proteínas maternas puede proporcionar información significativa sobre los procesos de desarrollo.
- Este método mejora la eficiencia del estudio de la función génica durante el desarrollo temprano.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la manipulación precisa de la expresión de proteínas maternas antes de la fertilización, ofreciendo un enfoque mecanicista para investigar la función génica en la embriogénesis temprana. Al permitir la reducción o sobreexpresión de proteínas diana en la etapa de ovocito, facilita la validación de dianas y el cribado fenotípico en la investigación de biología del desarrollo. El sistema proporciona un modelo relevante para enfermedades, útil para estudiar vías conservadas relacionadas con trastornos congénitos y toxicología reproductiva.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la función de proteínas maternas antes de la activación del genoma cigótico, aclarando los roles de los blancos en las vías de desarrollo temprano.
- Valor operativo: Proporciona un sistema escalable basado en ovocitos para la prueba funcional de la inhibición génica o sobreexpresión antes de la fecundación.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantificables del desarrollo (segmentación, formación de blástula, formación de renacuajo) para evaluar las consecuencias fenotípicas de la modulación de proteínas maternas.
- Valor operativo: El protocolo estandarizado de maduración y microinyección espermática intracitoplasmática (ICSI) permite condiciones de ensayo reproducibles para la criba de compuestos o perturbaciones genéticas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Xenopus laevis ofrece un modelo de vertebrado conservado para estudiar mecanismos de embriogénesis aplicables a la toxicología del desarrollo humano.
- Valor operativo: Permite la desaceleración en etapas tempranas de dianas implicadas en gametogénesis, fertilización o embriogénesis mediante la evaluación de resultados funcionales en un contexto de organismo completo.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en flujos de trabajo de descubrimiento temprano en los que es necesario aislar la contribución materna al fenotipo de los efectos cigóticos, lo que apoya la validación dirigida por hipótesis de dianas antes de pasar a modelos mamíferos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante la evaluación de si la perturbación de proteínas maternas altera la progresión embrionaria, lo que aporta confianza al blanco estudiado.
- Selección: Permite disponer de ovocitos listos para ensayos con un estado de maduración definido, garantizando una entrega constante de perturbaciones genéticas.
- Análisis: Ofrece lecturas embrionarias específicas por etapa (segmentación, blastocisto, renacuajo) como puntos finales cuantitativos para evaluar el impacto funcional.
- Investigación Traslacional: Relaciona la función génica materna con la viabilidad embrionaria, aportando información sobre vías del desarrollo que podrían tener relevancia en la fertilidad humana o en la teratogenicidad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudios de genes con efecto materno en múltiples blancos, sin necesidad de cirugía en animales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al permitir la intervención a nivel de proteínas antes de la fertilización, mejorando la certeza en la validación del blanco.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de recolección quirúrgica de ovocitos, estandarizando la preparación del tejido y aumentando el rendimiento.
- Valor estratégico: Acelera las decisiones de avance o interrupción en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar datos funcionales sobre blancos maternos antes de invertir en modelos mamíferos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de blancos implicados en la ovogénesis, la fertilización o la embriogénesis temprana.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía, manipulación de ovocitos y micromanipulación para los pasos de defoliculación, inyección y maduración.
- Depende de agentes enzimáticos para la defoliculación, medios de maduración con progesterona e instrumentación para ICSI para la inyección de espermatozoides.
- Necesita una evaluación estandarizada de la calidad del ovocito (tamaño, pigmentación, integridad del núcleo en estadio de vesícula germinal) para garantizar la competencia de maduración.
- La adaptación a otras especies puede requerir la optimización de enzimas para la defoliculación, hormonas de maduración y condiciones de cultivo.
- Está limitado por la eficiencia del 10 % en la formación de renacuajos derivados de ICSI, lo cual puede afectar el poder estadístico en aplicaciones de cribado.
