Name: Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprende a evaluar la invasión bacteriana de células cardíacas en cultivo y la colonización cardíaca en ratones infectados con Listeria monocytogenes mediante modelos in vitro e in vivo.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Servicio de Salud Pública AI41816 y AI099339 (N.E.F.) y por F31AI094886-01 (P.D.M.) del NIAID. Los contenidos son responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente los puntos de vista oficiales de las fuentes de financiación.

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<li>Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+extravillous+trophoblasts+restrict+intracellular+growth+and+spread+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes.</a> PLoS Pathog. 7, e1002005(2011).</li>
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<li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+Listeria+monocytogenes+07PF0776%2C+a+cardiotropic+serovar+4b+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain.</a> J Bacteriol. 194, 3552(2012).</li>
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Los autores no reportan intereses financieros en competencia.

L. monocytogenes es un patógeno humano extendido y bien caracterizado, capaz de causar una serie de manifestaciones diferentes de la enfermedad15. La bacteria se ha descrito previamente por su capacidad de translocar a través de barreras, como la barrera hematoencefálica y las barreras placentario-fetales, con el fin de alcanzar y colonizar el sistema nervioso central y el feto en desarrollo, respectivamente. La capacidad in vivo del organismo para colonizar estos tejidos a menudo se compleme...

Listeria monocytogenes es un patógeno intracelular Gram-positivo capaz de causar enfermedades graves en poblaciones susceptibles, incluyendo ancianos, mujeres embarazadas, personas con VIH/SIDA y personas que reciben quimioterapia1. La infección en estas poblaciones es frecuentemente el resultado de la ingestión de productos alimenticios contaminados, y la mayoría de las infecciones están asociadas con brotes alimentarios a gran escala2,3. En humanos y otros mamíferos, L. monocytogenes es capaz de translocar a través de la frontera epitelial del intestino delgado, siendo posteriormente transportado al hígado4,5. Los modelos animales sugieren que las bacterias ingeridas se repliquen dentro de las vellosidades intestinales y transiten al hígado a través de la vena porta o se propaguen a través de los ganglios linfáticos mesentéricos hacia el torrente sanguíneo, lo que lleva a la diseminación hematógena al hígado y al bazo6,7. En el hígado y el bazo, la bacteria es capaz de mediar en fagocitos profesionales, así como en las células parenquimatosas residentes, y establece rápidamente infecciones dentro de estos órganos. A medida que aumenta la carga bacteriana, numerosas bacterias se dispersan de nuevo en la sangre, donde son capaces de colonizar aún más los tejidos susceptibles, incluyendo el sistema nervioso central y la placenta (donde esté presente). La colonización de estos sitios excluye las manifestaciones más comunes de listeriosis en humanos, incluyendo meningitis, encefalitis y aborto fetal2.
Recientemente se ha demostrado que determinadas subpoblaciones de L. monocytogenes tienen una mayor capacidad de invadir y replicarse dentro del tejido cardíaco8. Las manifestaciones de afectación cardíaca son variadas, y van desde la endocarditis y la pericarditis, hasta la miocarditis fulminante completa con anomalías de conducción9-13. El número total de casos cardiacos de los monocytogenes del L. por año es bajo pero puede debajo estimado pues esta faceta de la infección no se reconoce generalmente bien. La colonización del corazón por patógenos a menudo requiere predisposiciones del huésped, como daño valvular preexistente o válvulas cardíacas artificiales. Existen, sin embargo, aislados de L. monocytogenes que han sido identificados que son notables por su capacidad de colonizar los corazones de animales infectados en ausencia de cualquier daño cardíaco y/o anormalidades8.
Adjunto se describen in vitro e in vivo los métodos para evaluar la colonización bacteriana del tejido cardiaco dentro de animales infectados usando análisis de la invasión en cultura del tejido así como infecciones animales vivas. Estos métodos han demostrado ser útiles no sólo para identificar cepas con el potencial de colonizar el tejido cardíaco en animales infectados, sino que también deben ser útiles para la identificación de productos de genes bacterianos que sirven para mejorar la invasión de células cardíacas y / o dar lugar a cambios en la patología del corazón. Estos métodos facilitan la comparación del cardiotropismo entre múltiples cepas. Para los métodos descritos aquí, L. monocytogenes 10403S se utiliza como un representante bien estudiado de una cepa no cardiotrópica y el aislado clínico 07PF0776 se utiliza como un ejemplo representativo de una cepa cardiotrópica. Estas dos cepas se eligieron para proporcionar una comparación para la invasión bacteriana de células cardíacas in vitro y la colonización de corazones de ratones infectados in vivo. El aislado 07PF0776 es un aislado clínico recuperado de un absceso interventricular que causó una arritmia fatal en un paciente VIH+8. Los aislados de L. monocytogenes pueden variar en su potencial de virulencia, y dada la propensión de Listeria a infectar a personas con inmunosupresión y mujeres embarazadas, las personas dentro de estas poblaciones deben tener cuidado al evaluar diferentes aislados clínicos.

<table><tbody><tr><td>Difco</td><td>BHI Caldo Base</td><td>237200</td><td>2 kg de Infusión Cerebro-Corazón en polvo (sin agar)</td></tr><tr><td>Difco</td><td>Agar</td><td>214510</td><td>2 kg de Agar Granulado</td></tr><tr><td>Difco</td><td>BHI Agar</td><td>241810</td><td>2 kg de Infusión Cerebro-Corazón en Polvo con 7,5% de Agar</td></tr><tr><td>en vitrógeno</td><td>Base de Caldo LB</td><td>12975-084</td><td>2 kg de Base de Caldo Luria en Polvo (sin agar)</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Glass Cubreobjetos</td><td>12-545-80</td><td>12 mm cubreobjetos de vidrio</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>35-3047</td><td>24 pocillos, tratada con plasma Placa de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>14mL Tubo de poliestireno</td><td>352051</td><td>14 ml Tubos de poliestireno Falcon</td></tr><tr><td></td><td>Placa inferior en U de 96 pocillos</td><td>35-3077</td><td>Placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Corning</td><td>0,05% Tripsina, 0,53 mM EDTA (1X)</td><td>25-052-CI</td><td>Solución madre de tripsina EDTA para el cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Corning</td><td>DMEM (alto contenido de glucosa, alto contenido de piruvato)</td><td>15-013-CU</td><td>Medios DMEM sin FBS, glutamina ni antibióticos</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Pen/Strep/Glut Solution</td><td>30-009-CI</td><td>Mezcla madre de penicilina, estreptomicina y L-glutamina para cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Gentamicin</td><td>30-005-CR</td><td>50 mg/ml Solución madre de gentamicina para cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Cellgro (Corning)</td><td>L-glutamina</td><td>25005197</td><td>Stock Solución de L-glutamina sin antibióticos</td></tr><tr><td>Matraz Denville</td><td>75cm^2</td><td>T1225</td> Matraz de <td>75 cm2 matraz tratado para cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga Denville de 1,5 ml</td><td>2013004</td><td>tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td></td></tr><tr><td>ATCC</td><td>H9c2 Cardiacos Mioblastos</td><td>CRL-1446</td><td>Mioblastos cardíacos de rata</td></tr><tr><td>Hyclone</td><td>Suero fetal bovino</td><td>SH30070.63</td><td>Suero fetal bovino</td></tr></tbody></table>

evaluación de la invasión bacteriana de las células cardíacas en cultivo y colonización del corazón en ratones infectados usando listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Los monocytogenes de la listeriería son un patógeno intracelular facultativo Gram-positivo que es capaz de causar infecciones invasores serias en pacientes immunocompromised, los ancianos, y las mujeres embarazadas. Las manifestaciones mas comunes de la listeriosis en seres humanos incluyen meningitis, encefalitis, y aborto fetal. Una secuela significativa pero mucho menos documentada de la infección invasor de los monocytogenes del L. implica el corazón. La tasa de mortalidad por enfermedad cardíaca puede ser de hasta el 35% a pesar del tratamiento, sin embargo se sabe muy poco sobre la colonización de L. monocytogenes del tejido cardíaco y sus patologías resultantes. Además, recientemente se ha hecho evidente que las subpoblaciones de L. monocytogenes tienen una mayor capacidad para invadir y crecer dentro del tejido cardíaco. Este protocolo describe detalladamente los métodos ines vitro e in vivo que se pueden utilizar para determinar cardiotropism de los aislantes de los monocytogenes del L. Los métodos se presentan para la infección de los mioblastos cardiacos de la rata H9c2 en cultura del tejido así como para la determinación de la colonización bacteriana de los corazones de ratones infectados. Estos métodos son útiles no sólo para identificar tensiones con el potencial de colonizar el tejido cardiaco en animales infectados, pero pueden también facilitar la identificación de los productos bacterianos del gen que sirven para aumentar la invasión de la célula cardiaca y/o para conducir cambios en patología del corazón. Estos métodos también proporcionan la comparación directa del cardiotropismo entre múltiples cepas de L. monocytogenes.

Los aislantes seleccionados de los monocytogenes del L. exhiben la invasión aumentada de células cardiacas en cultivo celular y en modelos del ratón de la infección. La Figura 1 muestra un ejemplo de cómo pueden aparecer colonias bacterianas después del revestimiento puntual de suspensiones en medios de agar. Este método permite una evaluación precisa de las UFC dentro de una muestra sin utilizar un gran número de placas de medios de agar. La Figura 2 muestra un ejemplo de un en...

Listeria monocytogenes causa infecciones fetales en mujeres embarazadas y meningitis en poblaciones susceptibles. Las subpoblaciones de bacterias pueden colonizar el tejido cardíaco, causando miocarditis en pacientes y animales de laboratorio. Aquí presentamos un protocolo que describe cómo evaluar la invasión de células cardíacas de L. monocytogenes in vitro y la colonización cardíaca en animales infectados.

Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar métodos eficientes para evaluar la infección microbiana de células cardíacas mediante modelos in vivo e in vitro de colonización del corazón y de invasión de células cardíacas. Esto se logra primero cultivando cultivos bacterianos y recolectando, lavando y resuspendiendo las células bacterianas en solución salina tamponada con fosfato. A continuación, monocapas de células cardíacas crecidas sobre cubreobjetos de vidrio se infectan con una suspensión bacteriana, o bien la suspensión bacteriana se inocula en ratones mediante inyecciones en la vena caudal.Luego, las células cardíacas se incuban en presencia de gentamicina para eliminar las bacterias extracelulares, seguido de la lisis celular para recuperarlas. Los animales infectados o las bacterias se monitorean para evaluar su bienestar dos o tres días después de la infección, y luego se sacrifican para el aislamiento de los órganos diana. Finalmente, las suspensiones celulares y de órganos se diluyen y siembran utilizando un método de siembra por puntos para determinar el número de bacterias viables asociadas con las células o los órganos diana.Finalmente, se cuentan las co

assessing-bacterial-invasion-cardiac-cells-culture-heart-colonization

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Listeria monocytogenes es un organismo modelo para estudiar la respuesta inmune y la susceptibilidad genética a las bacterias intracelulares en ratones. Este método permite medir la carga bacteriana y generar una sola célula suspensiones de hígado y el bazo de los ratones para el análisis de FACS para determinar los cambios en las células inmunes, debido a la infección por Listeria.

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes</em

Fuente: McMullen, P. D., Freitag, N. E. Evaluación de la invasión bacteriana de células cardíacas en cultivo y colonización cardíaca en ratones infectados usando Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo muestra la inyección de Listeria monocytogenes en la vena caudal de un ratón para establecer una infección sistémica. Muestra la circulación bacteriana, la colonización de órganos y la cuantificación de la carga bacteriana en el corazón mediante la homogeneización del tejido, la...

Cuantificación de la carga bacteriana en el corazón del ratón tras la inyección en la vena caudal de Listeria monocytogenes

Este video muestra un método para establecer un modelo de infección en tejidos placentarios para estudiar la propagación de la infección. Un cultivo de órganos placentarios ex vivo está infectado con Listeria monocytogenes, un parásito intracelular facultativo. Las bacterias invaden los trofoblastos extravellosos (EVT) para entrar en el tejido placentario y luego se propagan a otras células a través de la propagación de célula a célula.

Una técnica para establecer un modelo de infección bacteriana en un cultivo de órganos ex vivo

Este video muestra la cuantificación de la carga bacteriana infecciosa del cerebro de ratón perfundido infectado con Listeria monocytogenes.

Evaluación de la colonización bacteriana en el cerebro de un ratón después de una infección por Listeria monocytogenes

Este documento describe un nuevo método para la infección oral de ratones...

La transmisión oral de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En ratones a través de la ingestión de alimentos contaminados

Listeria monocytogenes es un patógeno bacteriano Gram positiva utilizado frecuentemente como un modelo importante para el estudio de parasitismo intracelular. Imágenes tardías L. monocytogenes etapas de infección en el contexto de los pequeños ARN de interferencia pantallas permite el estudio global de las vías celulares requeridos para la infección bacteriana de las células huésped diana.

Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Streptococcus pneumoniae forma lesiones microscópicas discretas no purulentas en el corazón. Se describe el protocolo para un modelo murino de formación de microlesiones cardíacas. Se proporciona instrucción sobre la visualización de microlesiones mediante microscopía, la discriminación entre microlesiones tempranas y tardías, y los métodos para detectar la remodelación cardíaca en el corazón de los animales convalecientes.

Visualización de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro cardíacos microlesiones y la remodelación cardiaca posterior

Este protocolo describe cómo inocular ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) y para medir el interferón-γ (IFN-γ) las respuestas de las células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), y adaptativa linfocitos T después de la infección. Este protocolo también describe cómo llevar a cabo estudios de supervivencia en ratones después de la infección con una dosis DL50 modificada del patógeno.

La infección experimental con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma

Se presenta un protocolo detallado de un modelo de ratón para enterohemorrágica e. coli (EHEC) colonización utilizando bacterias etiquetado bioluminiscencia. La detección de estas bacterias bioluminiscentes por un no-invasivo en vivo sistema de animales vivos de imagen puede avanzar nuestra comprensión actual de la colonización de EHEC.

Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

Durante la infección, la Listeria monocytogenes es capaz de atravesar la barrera hemato - encefálica para colonizar el cerebro. En este protocolo, se demuestra cómo evaluar la colonización bacteriana de los órganos después de la infección de ratones. Se proporciona un procedimiento para realizar la perfusión de órganos enteros para determinación específica de números bacterianos en la parenquimia del cerebro.

Listeria monocytogenes Infección del cerebro

Se describen dos ensayos de infección in vitro e in vivo que pueden utilizarse para analizar las actividades de codificación de host factores.

Usando un patógeno bacteriano a punta de prueba para las respuestas celular y organísmica nivel Host

Aprende a evaluar la invasión bacteriana de células cardíacas en cultivo y la colonización cardíaca en ratones infectados con Listeria monocytogenes mediante modelos in vitro e in vivo.

Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes (Video) | JoVE Journal

Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

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