Evaluación experimental de ratón sociabilidad Utilizando un enfoque de procesamiento de imágenes automatizado

El objetivo general de estos experimentos conductuales, junto con el análisis automático, es cuantificar la sociabilidad de los ratones de una manera eficiente en el tiempo. Este método puede ayudar con la detección rápida de medicamentos para aumentar la sociabilidad en modelos de ratón validados de trastornos del espectro autista. La principal ventaja de introducir el análisis automatizado es que acelera el proceso y hace que el cribado sea más eficiente.

La necesidad de un método automatizado para evaluar el comportamiento social de los ratones surgió porque el cribado visual en tiempo real de una sola dosis de un compuesto candidato tarda más de 50 horas. Más adelante en el video, mi estudiante de posgrado Frency Varghese demostrará el análisis automatizado. Comience configurando la jaula de paredes negras de tres compartimentos.

Para la primera sesión, coloque una copa de alambre invertida vacía en cada compartimento de los extremos de la jaula. Ahora prepare la cámara de video para ver la jaula desde arriba. Los tres compartimentos deben verse con una resolución de al menos 720 por 480 píxeles.

A continuación, ilumine la jaula con iluminación incandescente indirecta para que el interior de la jaula, medido desde el suelo, no tenga más de 3,5 Lux. También proporciona luz infrarroja para iluminar la jaula a un nivel que la cámara pueda detectar. Tome una imagen de un solo fotograma de la jaula vacía como referencia.

Para la primera sesión, coloque el ratón de prueba en la jaula. Luego, para poner en cola el análisis automatizado de la onda de video, una mano sobre la jaula solo una vez. Deje que el ratón explore la jaula de prueba durante 10 minutos.

Luego devuélvelo a su jaula de origen. Para la segunda sesión, coloque el ratón estímulo debajo de una de las dos tazas invertidas. Seleccione qué taza en forma de contrapeso.

En el software indica bajo qué taza se colocó el ratón de estímulo. Para las convenciones de nomenclatura, la copa que contiene el ratón encerrado es la copa social, mientras que la otra copa es la copa no social. Los compartimentos se nombran de manera similar.

Ponga en cola el comienzo de la segunda sesión con un gesto de la mano como en la primera sesión. Al final de la segunda sesión retira las copas invertidas para soltar el segundo ratón. Use otro movimiento de mano para indicar el comienzo de la tercera sesión y deje que los dos ratones interactúen en la jaula de prueba durante 10 minutos.

Después de 10 minutos, regrese ambos ratones a sus jaulas domésticas. En esta sección se explica cómo procesar las películas mediante la interfaz de usuario. Sin embargo, también es posible un análisis rápido en modo por lotes sin la intervención del usuario.

Comience cargando la película con el botón Cargar. A continuación, seleccione la configuración de la jaula. El programa de análisis localiza los límites de la jaula, los compartimentos y las tazas.

Seleccione una de las cuatro configuraciones preestablecidas o ajuste manualmente las coordenadas. Ahora, para cada fotograma de la película, ejecute los siguientes pasos de procesamiento. Primero convierte los fotogramas a escala de grises.

En segundo lugar, reste el marco de referencia en escala de grises realizado durante los preparativos, poniendo a cero los valores de píxel en todas partes, excepto en la posición del ratón. En tercer lugar, binarice los fotogramas estableciendo todos los píxeles por encima de un umbral de brillo en blanco y haciendo que todos los demás sean negros. Ajuste esta configuración para que coincida con las condiciones de iluminación.

Ahora elimine la cola de las imágenes utilizando la función Erosionar/Diluir. Primero erosione la imagen binarizada tres veces. A continuación, dilate el marco seis veces.

A continuación, erosiona los marcos tres veces más. Esto puede requerir un ajuste si se utiliza una resolución de píxeles diferente. Las ondas de la mano se identifican fácilmente como grandes saltos en el volumen de los píxeles blancos.

Esto permite la detección automática de los inicios de sesión y el orden de la sesión. Dentro de cada sesión, detecte el componente más grande de píxeles blancos mediante el comando L/Comp. Esto elimina los píxeles que no pertenecen al mouse.

A continuación, utilice la función Buscar extremos para determinar los dos píxeles más distantes dentro del componente más grande de píxeles blancos. Estos son la nariz y la cola. El software determina el centro de gravedad o COG para el objeto de píxel blanco y calcula su dirección de movimiento de fotograma a fotograma.

Para las sesiones con dos ratones, se debe realizar un seguimiento de dos objetos. Seleccione y oriente los dos objetos de píxeles blancos más grandes con el mismo conjunto de comandos. El software comprueba automáticamente los COG de fotograma a fotograma.

Si un objeto cambia de tamaño en más de un 20% o un COG se mueve más lejos de lo posible para un ratón, el umbral de binarización se incrementa automáticamente hasta que se cumplan estos criterios. El software comprueba automáticamente los centros de gravedad de un fotograma a otro. Si alguno de los objetos cambia de tamaño en más de un 20% o un centro de gravedad se mueve más de lo posible para un ratón, el umbral de binarización se ajusta automáticamente hasta que se cumplan estos criterios.

Las interacciones se detectan automáticamente cuando los objetos están a menos de dos centímetros. Estos segmentos se reproducen para que el usuario los introduzca. Para cada segmento, etiquete la perspectiva del ratón de prueba como Evitación social, Enfoque social o Ninguno.

Para verificar el análisis automático, cargue la película con el botón Cargar. A continuación, haga clic en Iniciar sesión 1 para mostrar el primer fotograma de esa sesión. Utilice el comando Reproducir/Detener para controlar la reproducción.

Las películas procesadas muestran cada ratón con un círculo de color diferente en la cara y la cola. Además, las medidas de sociabilidad se muestran en pantalla y se actualizan durante la reproducción. Corrija los errores encontrados en el análisis automatizado.

El error más común es un volteo de cabeza a cola que se puede solucionar con una herramienta en la interfaz. Esto ocurre en aproximadamente el 20% de los videos. En el raro caso de un error más complicado, generalmente se pueden resolver indicando manualmente la ubicación de la nariz del mouse en una cierta serie de cuadros de video.

Una vez verificados, exporte los datos de sociabilidad en formato de hoja de cálculo utilizando la función Exportar. Para exportar datos de varias películas como una sola hoja de cálculo, las películas deben agruparse en una carpeta y la función Compilar datos realiza la operación. En la primera sesión, se realizó un seguimiento de un ratón de prueba BALB/c de cuatro semanas de antigüedad, moviéndose entre compartimentos 59 veces durante 10 minutos.

El tiempo que se pasa en cada compartimento se considera una línea de base para la preferencia de compartimento sin estímulo social. En la segunda sesión, se presentó una taza social y no social con un ratón ICR oculto de cuatro semanas de edad. Había un claro sesgo hacia pasar tiempo en el compartimento social.

Específicamente, el ratón pasó más tiempo con la taza social que con la taza no social. En la tercera sesión, se levantaron las tazas y se permitió que los ratones interactuaran. En total se realizaron 35 acercamientos sociales a lo largo de 10 minutos.

Después de su desarrollo, esta técnica facilita una detección más rápida de medicamentos prometedores para mejorar el dominio de síntomas centrales de la sociabilidad alterada en modelos de ratón validados de trastornos del espectro autista. El procesamiento automatizado se puede adaptar a diferentes diseños de jaulas y especies. Cualquier comportamiento de interés puede ser evaluado siempre y cuando se pueda desarrollar un algoritmo para detectarlo de manera confiable.