Name: La determinación de la proteína de membrana de topología usando fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprende a determinar la topología de proteínas de membrana en células vivas mediante el ensayo de protección de proteasa con fluorescencia. Este método utiliza quimeras GFP para analizar la orientación de proteínas integrales de membrana.

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Deseamos agradecer al Centro Central de Imágenes de Calcio de CMS por su ayuda y orientación en la captura y análisis de imágenes. Este estudio fue respaldado por los Institutos Nacionales de la Salud (NIH, por sus siglas en inglés) de EE. UU. HL102208 a N.A.B. Este enfoque fue iniciado originalmente por Holger Lorenz y Jennifer Lippincott-Schwartz en los NIH.

1. Generación y Validación de quimeras de proteína fluorescente <ol><li> Anexar la proteína verde fluorescente (GFP) al extremo amino o carboxilo de la proteína de interés el uso de estrategias de DNA recombinante estándar 13. NOTA: Aunque hemos utilizado ampliamente GFP, otras variantes tales como la proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente amarilla (YFP), DsRed y mCherry se pueden emplear. Las mejoras en la eficiencia fluoróforo plegable, brillo y fotoestabilidad constantemente se están haciendo, y los investigadores deben hacer uso de las construcciones de última generación. <ol><li> Confirmar secuencia de ADN correcta y asegurar que el resto de GFP es en marco con la proteína de interés. Realizar secuenciación utilizando estrategias de ADN recombinante estándar 21. NOTA: Muchas instituciones cuentan con instalaciones de ADN del núcleo, lo que se recomienda al investigador en contacto para obtener información adicional. </li><li> Para las proteínas de membrana individuales o dobles pase, generarambas versiones de terminales amino y carboxilo de las proteínas de fusión 19. </li><li> Para las proteínas multi-GFP que abarca insertar dentro de bucles extramembrane putativo, así como los extremos. Tenga especial cuidado al generar quimeras transmembrana con la proteína de fusión fluorescente unido al extremo amino terminal de la proteína diana como las secuencias señal se escinden a menudo por proteolisis una vez que la proteína ha pasado a través de la translocon ER. </li><li> En el caso de secuencias de señal existentes, inserte el fluorescente proteína de fusión distal al sitio de escisión para generar una proteína madura que contiene una proteína fluorescente etiquetada amino-terminal intacto. Emplear estrategias estándar de ADN recombinante para la generación de quimeras 21. </li></ol></li><li> Determinar la presencia de la señal fluorescente debidamente localizado suficiente en la línea celular de interés. <ol><li> Observar las células bajo microscopio de epifluorescencia usando la fluorescencia intrínseca de GFP bajo appropricomió filtro establecer condiciones. Para los conjuntos de filtros de GFP que abarcan 510-560 nm, confirman que los filtros correctos se utilizan para el fluoróforo empleado. NOTA: Se consigue una señal suficiente cuando la evaluación por el ojo proporciona una señal suficientemente fuerte que la estructura celular en el que reside la señal se resuelve fácilmente por encima del fondo. Además, el patrón de tinción de la proteína GFP debe ser coherente con la de marcadores para el organelo apropiado, y preferiblemente idéntica a la de la proteína nativa sin etiquetar. </li></ol></li><li> Determinar si un enfoque de transfección estable o transitoria se utilizará basa en que se evalúa la proteína. NOTA: Los transfectantes estables generalmente ofrecen los niveles más bajos de expresión de los sistemas transitorios. Aunque la expresión transitoria proporciona la expresión de alto nivel de proteínas y la intensidad de aumento de la señal (~ 5-24 hr después de la transfección dependiendo de la proteína), también puede dar lugar a artefactos tales como la sobreexpresión de la proteína Aggrdele- o la saturación de las vías de la proteína diana, dando lugar a la localización subcelular errónea. </li></ol> 2. La transfección de células y cultivo celular NOTA: Una variedad de células son susceptibles de análisis FPP, incluyendo HEK293, HeLa, COS-7 y las células CHO 14. La siguiente descripción se basa en la expresión de proteínas de membrana en células HEK293. <ol><li> Cultivar células de riñón embrionario humano (Hek293) como monocapas adherentes en 6 ml de Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), 1% de piruvato de sodio y 250 g / ml de penicilina / estreptomicina a 37 ° C con 5% de CO 2. Realizar todos los trabajos con células en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar. Se cultivan las células en medio de cultivo hasta ~ 80% de confluencia en un matraz T-75. </li><li> Transfectar células utilizando cualquiera de alta eficiencia estándar, método de transfección de baja toxicidad, incluyendo lípidos, tecnologías viral- o basadas en la electroporación para generar transient o expresión estable. Normalmente 2 g de ADN plásmido por 1 x 10 6 células da buena expresión de la proteína reproducible. Mantener las células de 5-48 horas en medio de cultivo tisular apropiado a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos capaz CO 2. </li><li> Supervisar las células para la expresión de la proteína GFP-fusión mediante microscopía de epifluorescencia, utilizando la señal de fluorescencia intrínseca de GFP, usando conjuntos de filtros apropiados de acuerdo con el protocolo del fabricante. La señal de fluorescencia generalmente alcanza un máximo dentro de 24 a 72 horas después de la transfección. Utilice células cuando la señal de fluorescencia alcanza un nivel máximo. Monitorear los niveles de expresión de proteínas por el análisis de inmunoblot utilizando anticuerpos dirigidos contra la proteína de interés o el resto de GFP. </li><li> Para experimentales células de la placa de análisis sobre cubreobjetos recubiertos. Ver sea bajo una configuración de célula viva o después de la fijación y montaje en portaobjetos de microscopía. Células de la placa para alcanzar el 60% y el 80% de confluencia entre las 24-48 horas. <ol><li> Cubreobjetos capa con solución de poli-lisina (0,1 mg / ml), de modo que toda la superficie está cubierta. Incubar durante 30 min bajo una luz ultravioleta a temperatura ambiente, seguido de 60 min en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C. Retire el exceso de poli-lisina y enjuague los cubreobjetos en PBS 3 veces. </li><li> Alternativamente, la placa de las células en un cubreobjetos cámaras que consiste en placas de cultivo celular con un fondo de cristal óptico para permitir que la imagen directa con los objetivos de inmersión en aceite. La configuración real microscopía depende del equipo disponible para el investigador, pero debe ser capaz de cambios rápida solución. Dependiendo del tipo celular y celular de la forma, las células deben estar alrededor de 60-90% de confluencia en el momento del ensayo FPP. </li></ol></li></ol> 3. Configuración de microscopía de fluorescencia <ol><li> Utilice un alto objetivo de inmersión en aceite apertura numérica (NA) para la recogida de señal máxima y la resolución espacial, tal como un 60X, 1,42 NA objetivo de inmersión en aceite. Utilice ªe siguiente lasers para estimular los fluoróforos: de gas argón de 488 nm (GFP y YFP) y 561 de diodos (RFP, mCherry). </li><li> Determinar la tasa óptima exposición, la ganancia y la captura de imágenes para cada construcción. Ajusta la intensidad del láser y el tiempo de exposición para minimizar photobleaching (véase el paso 7.1.2). </li><li> Para los estudios que utilizan múltiples fluoróforos (por ejemplo, un marcador soluble para la permeabilización de la membrana en concierto con una proteína marcadora de membrana), elija filtro apropiado establece para minimizar la señal diafonía y maximizar la relación señal-ruido. </li></ol> 4. El establecimiento de condiciones óptimas para la membrana plasmática Permeabilización <ol><li> Retire el medio de cultivo celular a partir de células que expresan sólo las proteínas fluorescentes solubles (por ejemplo, EGFP, DsRed). Lavar las células 3 veces (1 min cada uno) en tampón de KHM (acetato de potasio 110 mM, 3 mM MgCl2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Realizar experimentos con células y todos los reactivos a temperatura ambiente. </li><li> Coloque las células on cubreobjetos (véase el paso 2.4) en tampón de KHM en una platina del microscopio de fluorescencia y recoger la primera imagen, que representa el control de fase &#39;no permeabilizadas&#39;. </li><li> Para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática, añadir digitonina (30 mM) en tampón de KHM a las células. Perfundir células con tampón (tampón de digitonina +) a una velocidad de 5 ml / min durante 10-60 seg. </li><li> Determinar la concentración óptima de digitonina aumentando gradualmente la concentración de digitonina. La concentración de digitonina óptima se logra cuando hay una pérdida completa de señal de fluorescencia de EGFP soluble dentro de 10-60 seg de aplicación digitonina. Para muchas células aplicación de 10-50 mu M de digitonina es suficiente para permeabilizar la membrana celular. <ol><li> Para todas las aplicaciones utilizan la concentración más baja posible de digitonina. Recoge imágenes después digitonin permeabilización de la señal de fondo permeabilizada. </li></ol></li><li> Confirme que la quimera de la proteína GFP de interés es la membrana entegrated mediante la confirmación de retención celular de la señal de fluorescencia después de la permeabilización de digitonina de la membrana plasmática 16. <ol><li> Expresar una proteína fluorescente orgánulo específico 23. Las proteínas mitocondriales funcionan bien en este sentido 16, por ejemplo, pDsRed2-Mito vector. Determinar las condiciones óptimas de expresión tal como se describe en el paso 2.1. </li><li> Confirmar que la concentración de digitonina es apropiado para el tipo de célula empleada por asegurar que la morfología de los orgánulos intracelulares permanece constante a lo largo prolongado (hasta 60 min) la exposición a la digitonina. NOTA: Use protocolos de microscopía de inmunofluorescencia estándar utilizando anticuerpos contra diversos compartimentos celulares, tales como los lisosomas (por ejemplo, LÁMPARA1), de Golgi (por ejemplo, TGN38), retículo endoplásmico (por ejemplo, calnexina), endosomas (por ejemplo, Rab5), mitocondrias (por ejemplo, el citocromo c). Si orgánulos intracelulares cambios morfología / integridad dramáticamente over 60 min, es probable que la concentración de digitonina era demasiado alto, y requiere una reducción en la concentración de digitonina y / o tiempo de exposición. NOTA: Digitonina es tóxico por inhalación y por contacto con la piel. Llevar equipo de protección personal (EPP) apropiado. </li></ol></li></ol> 5. Proteasa Tratamiento de proteínas fluorescentes <ol><li> Lavar las células en tampón de KHM y luego añadir la proteasa (proteinasa K; 50 mg / ml en tampón KHM) directamente sobre las células. Perfundir células a una velocidad de flujo de 5 ml / min usando un sistema de perfusión por gravedad a Bath continuamente la preparación. <ol><li> Soluciones de las tiendas en 50 ml jeringas y tubos de polietileno conectados reservorios independientes a un colector con una sola salida en el baño (tasa de flujo de 5 ml / min). Coloque una pipeta de succión para mantener una (0,5 ml) volumen de baño constante y lograr el intercambio de solución al cambiar manualmente entre reservorios de perfusión. </li></ol></li><li> Recoger las imágenes para determinar si el fluorseñal escent persiste o se degrada. Una pérdida de&gt; 90% de la intensidad de la señal inicial de más de 30-60 segundos es consistente con la degradación proteolítica de la quimera de la proteína GFP (ver resultados representativos). </li><li> Si no hay degradación de la señal se observa con proteinasa K, cuando se prevé dicha pérdida, reemplace la solución de proteinasa K con tripsina (4-8 mM) en tampón KHM. Si es necesario, utilizar una mezcla de proteinasa K y tripsina. No hay necesidad de apagar la actividad de la proteasa. </li></ol> 6. Enfoque alternativo para la Membrana Plasmática Proteínas con dominios externos <ol><li> Para las proteínas de la membrana plasmática, lleve a cabo el ensayo de proteínas fluorescentes externos quimeras antes de digitonin permeabilización. Lavar las células sobre cubreobjetos en tampón KHM (5 ml / min x 3 min), y tomar una imagen para el tratamiento pre-proteasa y cuantificar la señal de fluorescencia pre-proteasa que en el paso 7. </li><li> Exponer las células de la proteasa (proteinasa K; 50 mg / ml o tripsina 4-8 mM en tampón KHM) en tque ausencia de digitonina por perfusión de las células con KHM medios que contienen proteasa (velocidad de flujo 5 ml / min). Recoge imágenes de la proteína fluorescente, para determinar la rapidez con la señal desaparece o cuánto tiempo la señal persiste. </li><li> Antes de permeabilización digitonina, apagar toda la actividad de la proteasa, por lavado de las células tres veces (1 min cada uno) en medios de cultivo celular que contiene 10% de suero (FBS). </li><li> Lavar las células por perfusión con tampón de KHM (velocidad de flujo de 5 ml / min) durante 2 min. Adquirir una imagen pre-permeabilización. Permeabilizar la membrana celular como se describe en el paso 4. </li><li> Recoge imágenes después de la adición de la proteasa como se describe en el Paso 5. </li></ol> Análisis 7. Imagen <ol><li> Utilice un microscopio invertido capaz de &quot;células vivas&quot; de grabación, en el que la pérdida de la señal de fluorescencia se puede monitorizar en tiempo real. Para el monitoreo continuo, emplear parámetros idénticos (tiempo de exposición, la ganancia, la intensidad del láser, etc.). <ol><li> Determinar experparámetros imental mediante la observación de la señal de fluorescencia de la proteína GFP de interés en condiciones de control (es decir, KBH tampón solo). Ajuste los ajustes de tiempo de ganancia, la intensidad del láser y la exposición en el microscopio dirigido por ordenador para asegurar que no hay pérdida apreciable de intensidad de la señal durante un período de 10-20 min. NOTA: La intensidad de la señal no es un valor absoluto, sino que se basa en el sistema de microscopio y los ajustes disponibles para cada IP. Monitorear cambios en la intensidad de fluorescencia relativa. </li></ol></li><li> Por otra parte, el tratamiento de las células en el conjunto de los puntos de tiempo en digitonin seguido de proteasa, y fijar las células antes de montar en cubreobjetos para imágenes. Determinar empíricamente puntos de tiempo después de procedimientos en los pasos 4 y 5. Para la investigación inicial, comienzan en 0, 30, 60, 120 y 300 de post seg adición de digitonin o proteasa. <ol><li> Fijar las células (20 min a temperatura ambiente) utilizando una cantidad suficiente de fijador (3,7% de paraformaldehído en PBS) para sumergir completamente ésimocélulas e. </li><li> Se inactiva paraformaldehído residual mediante lavado las células con PBS que contenía glicina 20 mM (3 x 5 min). </li><li> Mount cubreobjetos de eliminar el exceso de líquido de la cubreobjetos e invirtiendo el cubreobjetos sobre soporte de montaje 50 l en un portas para la imagen. Deje que se sequen durante la noche antes de exponer. </li></ol></li><li> Recoger imágenes de microscopía de fluorescencia (bajo los filtros apropiados establece compatible con el fluoróforo se utiliza) mediante el uso de la función de captura de imagen de vídeo en un microscopio de fluorescencia controlado por ordenador. </li><li> Cuantificar las intensidades de señal fluorescente como una función de la condición de incubación. Obtener la intensidad media de píxeles dentro de una región de interés (ROI) que encierra una celda individual. </li></ol>

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Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

La orientación correcta y la topología de proteínas de membrana es esencial para su correcto funcionamiento. A pesar de la importancia de comprender la topología de proteínas de membrana, hay muchas proteínas para los que dichos datos se carece por completo. FPP proporciona una manera fácil y eficiente de la determinación de la topología de proteínas de membrana, y uno que puede ser realizado por la mayoría de los laboratorios. El enfoque FPP ofrece ventajas significativas sobre los métodos anteriores para la determinac...

Las membranas de plasma, así como las numerosas membranas intracelulares, sirven como barreras que separan dos compartimentos acuosos. En el caso de la membrana plasmática, la separación es entre el exterior y el interior de la célula; para orgánulos intracelulares es entre el citoplasma y el lumen de orgánulos. Por ejemplo, la membrana del retículo endoplasmático (ER) separa un ambiente oxidante dentro del lumen del ER a partir de un ambiente reductor 1 citosólica. Las proteínas de membrana son sintetizadas en los ribosomas ER-asociados, y lograr su topología final dentro de la membrana del RE 2. La adquisición de la orientación de la membrana apropiado y la topología de proteínas es crítica para su función normal. Topología correcta permite dominios correspondientes de proteínas de membrana para interactuar con sus parejas de unión, permite modificaciones post-traduccionales críticos que se produzcan, y en el caso de proteínas de membrana de plasma, permite a la célula para interactuar con y responder to su entorno. Para apreciar completamente la función de una proteína de la membrana, es claramente imprescindible saber que la proteína está orientado con respecto a la membrana dentro de la cual reside, es decir, su topología de la membrana. Además de la adquisición de conocimiento científico básico, la comprensión de la topología de una proteína de la membrana y qué aspectos de una proteína de superficie están expuestos a diferentes ambientes ha marcado implicaciones clínicas ya que las proteínas de membrana constituyen la mayoría de dianas farmacológicas 3. Hasta hace poco, los enfoques para la determinación de la topología de la proteína de membrana han requerido una inversión considerable en tiempo y dinero o han requerido reactivos que son difíciles de conseguir. Ambos enfoques experimentales y en silico se han empleado para determinar la topología de la membrana de las proteínas que residen dentro de la membrana plasmática. Desde las primeras predicciones de dominios de membrana que abarca basadas en la hidrofobicidad evaluado de indiviaminoácidos dobles 3, numerosos algoritmos predictivos ya están disponibles en el Internet, y simplemente requieren el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, los supuestos son a menudo el centro de este tipo de programas de modelado, los supuestos que pueden conducir a las asignaciones incorrectas de topología 4,5. Además, aunque estas predicciones basadas en la informática pueden asignar provisionalmente regiones que abarcan la membrana, que no siempre determinan si el amino o carboxi de las proteínas están en el citoplasma, orgánulos o lumen exterior de la célula. Incluso con el aumento de potencia de cálculo, y el uso de algoritmos de aprendizaje 6, esos datos sigue siendo un modelo, y debe ser validado a partir de datos experimentales adquiridos. Determinación experimental directa de topología de la membrana se ha realizado usando paneles de anticuerpos monoclonales con epítopos conocidos distribuidas a lo largo de la proteína, donde se ha hecho la evaluación de su inmunorreactividad antes y después de la permeabilización celular. Esteenfoque requiere un conjunto de anticuerpos, que pueden no estar disponibles para la proteína de interés. Una estrategia alternativa es diseñar epítopo etiquetas tales como myc o hemaglutinina (HA) en distintos lugares de la proteína, de nuevo seguido por la determinación de la inmunorreactividad antes y después de permeabilización de la membrana. Además de las etiquetas inmunogénicas, etiquetas enzimáticas (incluyendo la fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, o β-lactamasa) y modificaciones químicas como el escaneo cisteína han sido empleados para determinar la proteína de membrana topología 7,8. Un método adicional empleado para el mapeo topológica de proteínas de membrana de plasma se basa en un enfoque ligeramente diferente a etiquetas de epítopo. En este método, la secuencia de etiqueta es la secuencia consenso de glicosilación ligada a N NXS / T. Puesto que la glicosilación sólo se produce cuando tal secuencia está presente en el lumen de la vía de biosíntesis, la presencia de la etiqueta en un luminal frenteun compartimento citosólico se observa fácilmente como un cambio masivo en geles de SDS-PAGE. Este enfoque ha sido aplicado al canal CFTR 9 ion multispanning. Aunque se han utilizado todos estos enfoques, es claro que todos ellos requieren inversiones considerables en la biología molecular y la secuencia para generar los constructos múltiples. Para determinar la información topológica con respecto a las proteínas transmembrana localizados dentro de los orgánulos intracelulares ha demostrado ser más difícil. La aplicación de tecnologías basadas en fluorescencia sin embargo, ha hecho que la determinación de la topología de la membrana mucho más simple. La técnica de la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) se basa en la interacción entre dos fragmentos no fluorescentes de una proteína fluorescente, la restauración de las propiedades fluorescentes de que la proteína de 10. Aunque se ha descrito inicialmente para la determinación de las interacciones proteína-proteína in vivo 10, este enfoque también se ha utilizadopara determinar la topología de la proteína de membrana en células de plantas 11. Sin embargo, este enfoque también es intensiva en tiempo, ya que requiere la generación no sólo de proteínas de fusión con la proteína de interés, sino también una variedad de proteínas de fusión dirigidas al citosol u orgánulo lumen, y requiere el conocimiento de que intracelular membranas de la proteína de interés reside en . Un enfoque alternativo más sencillo para determinar la topología de proteínas de membrana se ha descrito 12. El ensayo, la fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP) requiere la generación de una proteína de fusión entre GFP y el gen de interés. El enfoque se basa en la accesibilidad relativa de las proteasas no específicas a la fracción GFP; dependiendo de si GFP está protegido de proteólisis por residente en el lumen de los orgánulos intracelulares o se expone a la proteolisis por estar presente en el citosol. Por lo tanto, si el resto GFP en la proteína de interés se enfrenta el citoplasma, que estará expuesto aactividad de la proteasa y la señal de fluorescencia pierden. Por el contrario, si el resto GFP en la proteína de interés se enfrenta a un entorno &quot;protegido&quot; de la proteasa (como el lumen de Golgi), entonces persistirá la señal de fluorescencia. Para permitir proteasas para entrar en la célula, pero no entrar en compartimentos intracelulares de membrana se utiliza el digitonina drogas unión colesterol. El colesterol es el esterol dominante en los vertebrados, y se enriqueció específicamente en la membrana plasmática con respecto a los compartimentos intracelulares. La toxina glicósido, digitonina, se extrae de la Digitalis purpurea planta. Digitonina tiene una afinidad por las membranas ricas de colesterol, donde se lleva a membrana selectiva permeabiliztion 14,16 (Figura 1). Además de permitir la salida de pequeños componentes citosólicos, digitonina permeabilización también permite la entrada de moléculas exógenas, tales como proteinasa K o tripsina. El protocolo FPP se aprovecha de la fact que la membrana plasmática contiene hasta 80% de colesterol celular 17, mientras que otros orgánulos, tales como ER, Golgi, endosomas, las mitocondrias, que tienen muy bajo contenido de colesterol, 14 permanecen intactos. La incorporación selectiva de colesterol en la membrana plasmática se ha observado en muchas células eucariotas, permitiendo el uso de la membrana plasmática de permeabilización digitonina-dependiente en diversas especies eucariotas tales como S. cerevisiae a humano 14,18. El ensayo FPP proporciona un medio simple, rápido y bastante robustas de determinar (a) si una proteína es unida a la membrana / asociado o libremente difusible en el citosol y (b) qué dominio de una proteína de membrana se enfrenta el citosol o de orgánulos lumen. En caso de una proteína de membrana tienen múltiples orientaciones, la señal será surgir de la forma dominante y formas menores no será detectado. Si bien puede haber cierta preocupación de que la adición de un resto de GFP a la proteína de interés puede afectar a su función y/ O localización subcelular, esto es en realidad más teórico que real. De hecho, muchos estudios han demostrado claramente que la etiqueta de las buenas prácticas agrarias no altera las propiedades de la proteína 19,20.

<table><tbody><tr><td>Digitonina</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>proteinasa K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>tripsina</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Cav1-GFP</td><td>Addgene</td><td>44433</td><td></td></tr><tr><td>pAcGFP-1 Golgi</td><td>Clontech</td><td>632464</td><td></td></tr><tr><td>polilisina</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje</td><td>Dako</td><td>cS704</td><td></td></tr></tbody></table>

la determinación de la proteína de membrana de topología usando fluorescencia de protección de la proteasa (fpp)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

La topología y orientación correctas de las proteínas integrales de membrana son esenciales para su correcto funcionamiento, sin embargo, dicha información no se ha establecido para muchas proteínas de membrana. Se presenta una técnica sencilla llamada protección de la proteasa de fluorescencia (FPP), que permite determinar la topología de las proteínas de membrana en células vivas. Esta técnica tiene numerosas ventajas sobre otros métodos para determinar la topología de proteínas, ya que no requiere la disponibilidad de múltiples anticuerpos contra varios dominios de la proteína de membrana, no requiere grandes cantidades de proteína y se puede realizar en células vivas. El método FPP emplea las acciones espacialmente confinadas de las proteasas en la degradación de proteínas de membrana marcadas con proteína verde fluorescente (GFP) para determinar su topología y orientación de membrana. Este enfoque simple es aplicable a una amplia variedad de tipos de células y se puede utilizar para determinar la orientación de las proteínas de membrana en varios orgánulos subcelulares, como las mitocondrias, Golgi, el retículo endoplásmico y los componentes del sistema endosómico/de reciclaje. Las proteínas de membrana, marcadas en el extremo N o en el extremo C con una fusión de GFP, se expresan en una célula de interés, que se somete a una permeabilización selectiva utilizando el detergente digitonina. La digitonina tiene la capacidad de permeabilizar la membrana plasmática, dejando intactos los orgánulos intracelulares. Las fracciones de GFP expuestas al citosol pueden degradarse selectivamente mediante la aplicación de proteasa, mientras que las partes de GFP presentes en la luz de los orgánulos están protegidas de la proteasa y permanecen intactas. El ensayo FPP es sencillo y los resultados se pueden obtener rápidamente.

Membrana plasmática Permeabilización Efficient permeabilización de la membrana de plasma se determina por el uso de proteínas fluorescentes solubles (por ejemplo, GFP, DsRed) (paso 4). Estas proteínas, cuando se expresa en las células, son libres para difundir en el citosol, y se pierden cuando la membrana plasmática se permeabilizan utilizando digitonina (Figura 2). Una desaparición completa de la señal fluorescente debe ocurrir dentro de 10 a 60 segundos ...

Aquí, presentamos un protocolo para determinar la orientación y topología de las proteínas integrales de membrana en células vivas. Este sencillo protocolo se basa en la sensibilidad selectiva de las quimeras a la proteasa entre la proteína de interés y la GFP.

La determinación de la proteína de membrana de topología usando fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la topología de las proteínas integrales de membrana. Esto se logra mediante la expresión de efusión de la proteína entre la proteína verde fluorescente o GFP y los extremos amino o carboxilo de la proteína de membrana. Con fines de control, en las células se puede expresar proteínas fluorescentes solubles, como RFP.A continuación, la membrana plasmática se somete a permeación selectiva. Mediante el uso del detergente dig, las proteínas fluorescentes solubles saldrán de la célula, mientras que las proteínas fluorescentes unidas a la membrana se retendrán dentro de la célula. El paso final consiste en la aplicación de una proteasa a las células permeabilizadas y la determinación de la retención o pérdida de la señal fluorescente.En última instancia, los cambios en la intensidad de fluorescencia observados mediante imágenes de microscopía de fluorescencia se utilizan para mostrar la topología y orientación de las proteínas integrales de membrana. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el mapeo de epítopos, es que el procedimiento no requiere mucho equipo especializado ni diversos reactivos que podrían ser difíciles de obtener. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología de proteínas de membrana, tales como qué dominios de una proteína integral de membrana podrían localizarse dentro del citosol frente a qué dominios podrían estar ubicados dentro del lumen de orgánulos como el retículo endoplásmico gold G o los endosomas.Comience este procedimiento con la generación y validación de la proteína fluorescente KY, como se describe en el protocolo escrito. Luego, transfecte la proteína fluorescente KY en células de riñón embrionario humano o células HEK 293 utilizando cualquier método de transfección estándar de alta eficiencia y baja toxicidad, incluyendo tecnologías basadas en lípidos, virales o electroforesis, para lograr expresión transitoria o estable. A continuación, siembre las células sobre cubreobjetos recubiertos con polilisina. Mantenga las células entre cinco y 48 horas en medio de cultivo de tejidos adecuado, a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo de tejidos con capacidad de dióxido de carbono.Observe las células para detectar la expresión de la proteína de fusión GFP mediante microscopía de fluorescencia epiescopia, y la señal fluorescente intrínseca de GFP generalmente alcanza un máximo entre 24 y 72 horas tras la transfección. Utilice las células cuando la señal fluorescente alcance el nivel máximo. La expresión proteica también puede monitorizarse mediante análisis de inmunotransferencia usando anticuerpos dirigidos contra la proteína de interés o contra la porción GFP.Para comenzar, configure el sistema de perfusión por gravedad para tratar las células. Prepare jeringas de 50 mililitros para las soluciones con tubos de polietileno conectados a reservorios independientes y a un colector con una salida única en el baño. Coloque una pipeta de succión para mantener un volumen constante en el baño y logre el intercambio de solución cambiando manualmente entre los reservorios de perfusión para la permeación de la membrana plasmática.Primero, retire el medio de cultivo celular de las células. Lave las células tres veces durante un minuto cada vez. En tampón KHM, coloque las laminillas sobre la platina de un microscopio de fluorescencia y recolecte la primera imagen, que representa la imagen de control no permeable para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática.Añada ditionina en tampón KHM a las células, perfunda las células con tampón más ditionina a una velocidad de cinco mililitros por minuto durante 10 a 60 segundos. La confirmación de que la membrana plasmática está adecuadamente permeabilizada se puede realizar fácilmente mediante la expresión de una molécula GFP o RFP soluble, que difundirá rápidamente fuera de la célula tras la permeabilización de la membrana. Luego, confirme que la quimera de la proteína GFP de interés está integrada en la membrana, verificando la retención celular de la señal fluorescente tras la digotonina y la permeabilización de la membrana plasmática.A continuación, exprese una proteína fluorescente específica de un orgánulo, como una proteína mitocondrial, tal como se indica en el protocolo del texto. Determine las condiciones óptimas de expresión como antes. Confirme que la digestión y la concentración son adecuadas para el tipo celular empleado asegurándose de que la morfología de los canales intracelulares de los orgánulos permanezca constante durante exposiciones prolongadas.Para cavar hasta la médula. Después de lavar las células en tampón KHM, agregue proteasa directamente sobre las células. Pase las células a un flujo de cinco mililitros por minuto, utilizando un sistema de perfusión por gravedad para bañar continuamente el preparado.A continuación, determine si la señal fluorescente persiste o se degrada. Obtenga imágenes de microscopía fluorescente con los juegos de filtros adecuados utilizando la función de captura de imagen de video en un microscopio fluorescente controlado por computadora. Cuantifique las intensidades de la señal fluorescente en función de las condiciones de incubación.Obtenga la intensidad media de píxeles dentro de una región de interés que encierre una célula individual. Una pérdida superior al 90 % de la intensidad de señal inicial en un período de 30 a 60 segundos es consistente con la degradación proteolítica de la proteína GFP ky. Debe producirse la desaparición completa de la señal fluorescente soluble entre 10 y 60 segundos tras la aplicación de digitonina.La confirmación de que la proteína de interés está asociada con orgánulos intracelulares se logra observando la retención de la señal fluorescente tras la digestión y permeabilización. La cola carboxilo del cinasa anclada a la membrana LTK dos se fusionó con GFP y se expresó transitoriamente en ltk fluorescente. La señal de GFP dos se perdió rápidamente tras la adición de proteinasa K, lo que indica que la ubicación del extremo carboxilo de ltk dos se encuentra dentro del citosol.Cavi y GFP es una proteína de membrana plasmática con un grupo GFP unido al dominio citosólico. Al igual que con LTK dos, la señal de cavi y GFP es insensible a digitonina, pero sensible a la adición posterior de proteasa. DS red mito codifica una proteína fluorescente roja fusionada a la secuencia de direccionamiento mitocondrial de la citocromo C oxidasa tras la permeabilización con digon, así como a la adición de proteinasa K. La fluorescencia asociada con DS red mito permanece estable. Esto es consistente con el fluoróforo cuatro localizado en las mitocondrias, donde no está expuesto al citosol.Cuando la porción fluorescente unida a una proteína de membrana está orientada hacia el exterior celular, como en la proteína priónica anclada mediante un anclaje de GPI unido a la proteína fluorescente amarilla, el tratamiento con proteinasa debería extinguir rápidamente la señal fluorescente sin necesidad previa de permeabilización con dig para la entrada de la enzima, tal como se espera. Tras el tratamiento con proteinasa, la señal fluorescente extracelular desapareció rápidamente en las células que expresaban este constructo.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una o dos horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una comprensión más clara de cómo determinar la topología de su proteína de membrana de interés.

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La determinación de la proteína de membrana de topología usando fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP)

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