La determinación de la proteína de membrana de topología usando fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP)

El objetivo general de este procedimiento es determinar la topología de las proteínas integrales de membrana. Esto se logra por expresión de efusión, proteína entre la proteína verde fluorescente o GFP y las colas de aminoácidos o carboxilo de la membrana. Proteína de interés en las células para fines de control, se pueden expresar proteínas fluorescentes solubles como RFP.

A continuación, la membrana plasmática se somete a una permeación selectiva. Usando la excavación de detergente, las proteínas fluorescentes solubles saldrán de la célula, mientras que las proteínas fluorescentes unidas a la membrana se retendrán dentro de la célula. El paso final es la aplicación de una proteasa a las células de perme y la determinación de la retención o pérdida de la señal fluorescente.

En última instancia, los cambios en la intensidad de la fluorescencia observados mediante imágenes de microscopía de fluorescencia se utilizan para mostrar la topología y la orientación de las proteínas de membrana integrales. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el mapeo de epítopos, es que el procedimiento no requiere una gran cantidad de equipos especializados ni varios reactivos que pueden ser difíciles de conseguir. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología de las proteínas de membrana, como qué dominios de una proteína de membrana integral pueden estar ubicados dentro del citosol frente a qué dominios pueden estar ubicados dentro de la luz de orgánulos como el retículo endoplásmico gold G o los endosomas.

Comience este procedimiento con la generación y validación de la proteína fluorescente KY como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfecte la proteína fluorescente KY en células de riñón embrionarias humanas o células HEK 2 93 utilizando cualquier método de transfección estándar de alta eficiencia y baja toxicidad, incluidas las tecnologías basadas en lípidos, virus o electroporación para generar una expresión transitoria o estable, las células se colocan luego en cubreobjetos recubiertos de polilisina. Mantenga las células durante cinco a 48 horas en un medio de cultivo de tejidos adecuado a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo de tejidos con capacidad de dióxido de carbono.

Monitoree las células para la expresión de la proteína de fusión GFP mediante microscopía de epifluorescencia, y la señal fluorescente intrínseca de la señal fluorescente GFP generalmente alcanza un máximo dentro de las 24 a 72 horas. Después de la transfección. El uso de las células cuando la señal fluorescente alcanza un nivel máximo, la expresión de la proteína también se puede monitorear mediante análisis de inmunotransferencia utilizando anticuerpos dirigidos contra la proteína de interés o la fracción GFP.

Para comenzar, configure el sistema de perfusión alimentado por gravedad para el tratamiento de las células. Prepare jeringas de 50 mililitros para soluciones con tubos de polietileno que están conectados a depósitos independientes y a un colector con una sola salida en el baño. Coloque una pipeta de succión para mantener un volumen de baño constante y lograr el intercambio de soluciones mediante el cambio manual entre los depósitos de perfusión para la permeabilidad de la membrana plasmática.

Primero, retire el medio de cultivo celular de las células. Lave las células tres veces durante un minuto cada una. En el tampón KHM, coloque los cubreobjetos en una platina de microscopio de fluorescencia y recoja la primera imagen, que representa la imagen no permeable de control para permear selectivamente la membrana plasmática.

Agregue digit toin en el tampón KHM a las celdas, perfunda las celdas con el tampón más digit toin a una velocidad de cinco mililitros por minuto durante 10 a 60 segundos. La confirmación de que la membrana plasmática es adecuadamente permeable se realiza fácilmente mediante la expresión de una molécula soluble de GFP o RFP, que se difundirá fácilmente fuera de la célula después de la membrana. A continuación, la permeación confirma que el quimer de la proteína GFP de interés está integrado en la membrana, confirmando la retención celular de la señal fluorescente después del digón y la permeación de la membrana plasmática.

A continuación, exprese una proteína fluorescente específica de un órgano, como una proteína mitocondrial, como se menciona en el protocolo de texto. Determine las condiciones óptimas de expresión como antes. Confirmar que la excavación y la concentración son apropiadas para el tipo de célula empleada, asegurándose de que la morfología de los canales de los órganos intracelulares permanezca constante durante una exposición prolongada.

Para cavar toin. Después de lavar las células en tampón KHM, agregue proteasa directamente sobre las células. Examine las células a un caudal de cinco mililitros por minuto, utilizando un sistema de perfusión alimentado por gravedad para bañar continuamente la preparación.

A continuación, determine si la señal fluorescente persiste o se degrada. Recoja imágenes de microscopía fluorescente bajo los conjuntos de filtros apropiados utilizando la función de captura de imágenes de video en un microscopio fluorescente controlado por computadora. Cuantificar las intensidades de las señales fluorescentes en función de las condiciones de incubación.

Obtenga la intensidad media de píxeles dentro de una región de interés que encierra una celda individual. Una pérdida de más del 90% de la intensidad de la señal inicial durante 30 a 60 segundos es consistente con la degradación proteolítica de la proteína GFP ky. La desaparición completa de la señal fluorescente soluble debe producirse dentro de los 10 a 60 segundos posteriores a la aplicación de digit toin.

La confirmación de que la proteína de interés está asociada con orgánulos intracelulares se logra al observar la retención de la señal fluorescente después del digón y la permeación. La cola de carboxilo de la quinasa anclada en la membrana LTK dos se fusionó con GFP y expresó ltk fluorescente transitoriamente. La señal de dos GFP se perdió rápidamente después de la adición de la proteinasa K, lo que indica que la ubicación del extremo carboxilo de ltk dos está dentro del citosol.

Cavi y GFP es una proteína de la membrana plasmática con una fracción de GFP unida al dominio citosólico. Al igual que con LTK dos, la señal de cavi y GFP es insensible a la dígito a la ína, pero sensible a la adición posterior de la proteasa DS red mito codifica la proteína fluorescente roja fusionada a la secuencia de diana mitocondrial del citocromo C oxidasa después de la permeación de digon, así como la adición de proteinasa K. La fluorescencia asociada con DS red mito permanece estable. Esto es consistente con que el Fluor cuatro está en las mitocondrias donde no está expuesto al citosol.

Cuando la fracción fluorescente unida a una proteína de membrana está orientada hacia el exterior de la célula, como en la proteína priónica anclada a GPI unida a una proteína fluorescente amarilla. El tratamiento con proteinasa debería apagar rápidamente la señal fluorescente sin la necesidad previa de permeación de excavación como se espera. Tras el tratamiento con proteinasa, la señal fluorescente extracelular desapareció rápidamente para las células que expresaban esta construcción.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una o dos horas si se hace correctamente. Después de ver este video, debería tener una mayor comprensión de cómo determinar la topología de la proteína de membrana de su interés.