Aislamiento de ARN a partir de células subpoblaciones específicas utilizando láser captura Microdissection Combinado con Rapid Immunolabeling

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo realizar un marcado inmunológico rápido de una población de células cerebrales de ratón aislada por microdisección de captura láser o LCM, manteniendo la integridad del ARN de las muestras. Esto se logra congelando primero rápidamente el tejido cerebral disecado. A continuación, el cerebro se corta en secciones finas en portaobjetos de microscopio de vidrio sin ARN y se trata con una tinción inmunológica rápida.

Finalmente, la población celular de interés se aísla utilizando LCM. En última instancia, la tinción rápida seguida de la microdisección por captura láser permite identificar cambios en la expresión del gen de interés en la muestra de célula experimental. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la clasificación por células activadas fluorescentes, es que con nuestra técnica, se mantiene la resolución espacial permitiendo la disolución de la célula específica de ES a partir del tejido circundante.

Por lo general, las personas nuevas en esta célula de Smith darán vueltas porque este procedimiento incluye varios pasos críticos que requieren trabajar rápidamente para mantener la integridad del ARN en las muestras. Para preparar las muestras para el corte, diseccione los cerebros de los ratones postnatales del primer día en un medio L 15 helado dentro de los dos minutos posteriores al sacrificio. A continuación, coloque los cerebros en moldes de inclusión en la orientación adecuada para seccionar y llene los moldes con tejido congelado, medios de inclusión.

Luego, congele inmediatamente las muestras en nitrógeno líquido y guárdelas a menos 80 grados Celsius dentro de los 30 segundos posteriores a la congelación instantánea. Ahora, trate los portaobjetos de vidrio recubiertos de membrana con descontaminación de ARN superficial para eliminar cualquier rastro de ARN. Enjuágalos con agua DEPC y déjalos secar al aire cuando los portaobjetos estén secos.

Ajuste la temperatura de la cámara de criostato a menos 20 grados Celsius y transfiera la muestra congelada al criostato. Para cada muestra, monte el bloque congelado en la abrazadera de muestras y corte las muestras a un grosor de 10 micras, recogiendo las secciones en los portaobjetos recubiertos de membrana. Después de dejar que las secciones se sequen durante al menos 10 minutos, use un bolígrafo de barrera hidrofóbica para rodear los tejidos.

Después de unos 10 segundos, coloque los portaobjetos en una solución fijadora fría recién preparada durante no más de cinco minutos a menos 20 grados centígrados. Ahora transfiera los portaobjetos a una bandeja limpia pretratada con una solución de descontaminación de ARN de superficie. Primero, agite los portaobjetos una vez para eliminar cualquier exceso de fijador y lávelos con seis a ocho inmersiones rápidas En D-E-P-C-P-B-S deslice los portaobjetos.

Para eliminar el exceso de D-E-P-C-P-B-S, agregue 200 microlitros de la solución de anticuerpos primarios a cada sección. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, lave los portaobjetos con tres inmersiones rápidas en D-E-P-C-P-B-S y gírelos una vez para eliminar el exceso de solución de lavado. A continuación, incubar las muestras en 200 microlitros de la solución de anticuerpo secundario a temperatura ambiente después de seis minutos.

Lave los portaobjetos en D-E-P-C-P-B-S como se acaba de demostrar e incube en una solución BC recién preparada durante cuatro minutos después de otro lavado rápido D-E-P-C-P-B-S, mezcle 196 microlitros de DAB recién preparado con cuatro microlitros de inhibidor de ARN. Justo antes de agregar la solución a la sección, deje que el DAB se desarrolle durante uno o dos minutos, seguido de un lavado A-D-E-P-C-P-B-S. A continuación, deshidratar las secciones con unos segundos de incubación en etanol absoluto y secar los portaobjetos para proceder a la LCM.

A continuación, 50 microlitros de tampón de lisis de un kit de extracción de ARN en la tapa del tubo colector. A continuación, coloque un portaobjetos bajo el microscopio con el lado de la muestra hacia el tapón. Elija el mejor aumento para la muestra y ajuste el enfoque para ver las celdas de interés.

A continuación, defina el área de corte y comience a cortar con el láser. La recolección del material diseccionado en el tubo colector tapó las células recolectadas durante 30 minutos a 42 grados centígrados. Durante este tiempo, preacondicione una columna de purificación de ARN del kit de extracción de ARN con 250 microlitros de tampón acondicionador.

A continuación, cargue 50 microlitros de etanol en las células lisadas de la columna y centrifugue la columna durante dos minutos a 16.000 Gs y temperatura ambiente, seguido de dos enjuagues con tampón de lavado. Finalmente, eluya el ARN en el volumen mínimo recomendado de 11 microlitros de agua libre de ARN, reservando dos microlitros para probar la calidad del ARN. Este procedimiento rápido de etiquetado inmunológico permite la visualización de las células de interés mientras se mantiene la integridad del ARN experimental.

Dependiendo del experimento, el LCM se puede utilizar, como se acaba de demostrar, para aislar células individuales o regiones de interés más grandes. El ARN degradado tiene un impacto considerable en la calidad del análisis posterior. Por lo tanto, cada muestra se procesa posteriormente en un bioanalizador de plataforma basado en microfluidos X para permitir la cuantificación y verificación de la integridad del ARN aislado, como se acaba de demostrar.

Por ejemplo, aquí, los resultados típicos de los bioanalizadores son tanto degradados como de buena calidad. Se muestran muestras de ARN. De hecho, el gel digital y los electroferogramas demuestran la importancia de usar un inhibidor de rasas en cada solución para proteger el ARN siguiendo este procedimiento, el ARN de alta calidad se puede procesar posteriormente para aplicaciones posteriores, incluida la secuenciación de ARN MICROARRAY o Q-R-D-P-C-R, por ejemplo, en estos gráficos, se determinó que el enriquecimiento promedio para la expresión génica TH y A A DC en la muestra microdisecada en relación con las secciones del cerebro medio era más de 170 veces.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que trabaja muy rápido y con material libre de ARN. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar una población específica de células de cualquier tejido.