Aislamiento de ARN a partir de células subpoblaciones específicas utilizando láser captura Microdissection Combinado con Rapid Immunolabeling

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo realizar una marcación inmunológica rápida de una población de células cerebrales de ratón aislada mediante microdisección láser o LCM, manteniendo la integridad del ARN de las muestras. Esto se logra primero congelando rápidamente el tejido cerebral diseccionado. Luego, el cerebro se corta en secciones delgadas sobre portaobjetos de vidrio libres de ARN y se trata con una tinción inmunológica rápida.

Finalmente, la población celular de interés se aísla utilizando microdisección por captura láser (LCM). En última instancia, la tinción rápida seguida de microdisección por captura láser permite la identificación de cambios en la expresión del gen de interés en la muestra celular experimental. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el ordenación de células activadas por fluorescencia es que, con nuestra técnica, se mantiene la resolución espacial, lo que permite aislar específicamente la célula ES del tejido circundante.

Por lo general, las personas nuevas en esta técnica de células Smith realizan círculos porque este procedimiento incluye varios pasos críticos que requieren trabajar rápidamente para mantener la integridad del ARN en las muestras. Para preparar las muestras para el corte, diseccionar los cerebros de ratones posnatales del día uno en medio L 15 frío con hielo dentro de los dos minutos posteriores a la sacrificio. A continuación, colocar los cerebros en moldes de inclusión en la orientación adecuada para el corte y llenar los moldes con medio de inclusión para tejidos congelados.

Luego, congele inmediatamente las muestras en nitrógeno líquido y almacénelas a menos 80 grados Celsius dentro de los 30 segundos posteriores al congelado rápido. Ahora, trate las laminillas de vidrio recubiertas con membrana mediante descontaminación de ARN de superficie para eliminar cualquier rastro de ARN. Enjuáguelas con agua DEPC y déjelas secar al aire cuando las laminillas estén secas.

Establezca la temperatura de la cámara del criostato en menos 20 grados Celsius y transfiera la muestra congelada al criostato. Para cada muestra, sujete el bloque congelado al portaobjetos del espécimen y corte los espécimenes con un grosor de 10 micrones, recolectando las secciones sobre portaobjetos recubiertos con membrana. Después de dejar secar las secciones durante al menos 10 minutos, utilice un lápiz de barrera hidrofóbica para rodear los tejidos.

Después de aproximadamente 10 segundos, coloque los portaobjetos en una solución fijadora fría recién preparada durante no más de cinco minutos a menos 20 grados Celsius. Ahora transfiera los portaobjetos a una bandeja limpia previamente tratada con solución descontaminante de superficie para ARN. Primero, agite los portaobjetos una vez para eliminar cualquier exceso de fijador y lávelos con seis a ocho inmersiones rápidas en D-E-P-C-P-B-S, sacudiendo los portaobjetos.

Para eliminar el exceso de D-E-P-C-P-B-S, agregue 200 microlitros de la solución de anticuerpo primario a cada sección. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, lave las laminillas con tres inmersiones rápidas en D-E-P-C-P-B-S y sacúdalas una vez para eliminar el exceso de solución de lavado. Luego, incube las muestras en 200 microlitros de la solución de anticuerpo secundario a temperatura ambiente después de seis minutos.

Lave las laminillas en D-E-P-C-P-B-S como se acaba de demostrar e incúbelas en una solución BC recién preparada durante cuatro minutos, tras otro lavado rápido en D-E-P-C-P-B-S. Mezcle 196 microlitros de DAB recién preparado con cuatro microlitros de inhibidor de ARN. Justo antes de añadir la solución al corte, deje que el DAB se desarrolle durante uno o dos minutos, seguido de un lavado con A-D-E-P-C-P-B-S. Luego deshidrate los cortes con una incubación de unos segundos en etanol absoluto y seque las laminillas sacudiéndolas para proceder al LCM.

A continuación, agregue 50 microlitros de tampón de lisis de un kit de extracción de ARN en la tapa del tubo de recolección. Luego, coloque un portaobjetos bajo el microscopio con el lado de la muestra orientado hacia la tapa. Seleccione la mejor magnificación para la muestra y ajuste el enfoque para observar las células de interés.

Luego defina el área de corte e inicie el corte con el láser. Recolecte el material disecado en la tapa del tubo recolector y lise las células recolectadas durante 30 minutos a 42 grados Celsius. Durante este tiempo, precondicione una columna de purificación de ARN del kit de extracción de ARN con 250 microlitros de tampón de acondicionamiento.

Luego, cargue 50 microlitros de etanol en las células lisadas sobre la columna y centrifugue la columna durante dos minutos a 16.000 G y temperatura ambiente, seguido de dos lavados con tampón de lavado. Finalmente, eluya el ARN en el volumen mínimo recomendado de 11 microlitros de agua libre de ARN, reservando dos microlitros para probar la calidad del ARN. Este procedimiento rápido de inmunoetiquetado permite la visualización de las células de interés manteniendo la integridad del ARN experimental.

Según el experimento, la microdisección láser (LCM) puede utilizarse tal como se acaba de demostrar para aislar células individuales o regiones de interés más grandes. El ARN degradado tiene un impacto considerable en la calidad del análisis posterior. Por lo tanto, cada muestra se procesa adicionalmente en una plataforma bioanalizadora basada en microflujos X para permitir la cuantificación y verificación de la integridad del ARN aislado, tal como se acaba de demostrar.

Por ejemplo, aquí se muestran resultados típicos del bioanalizador de muestras de ARN de calidad degradada y buena calidad. Los geles digitales y los electroferogramas demuestran la importancia de usar un inhibidor de ARNasa en cada solución para proteger el ARN; tras seguir este procedimiento, el ARN de alta calidad puede procesarse posteriormente para aplicaciones de análisis, incluyendo secuenciación de ARN, microarrays o Q-R-T-P-C-R. Por ejemplo, en estos gráficos, el enriquecimiento promedio de la expresión génica de TH y AADC en la muestra microdiseccionada, en relación con secciones del mesencéfalo, se determinó que era superior a 170 veces.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar muy rápidamente y con material libre de ARN. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar una población específica de células de cualquier tejido.