Name: Imágenes de contraste en embriones de ratón Uso de alta frecuencia de ultrasonido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprende a inyectar microburbujas en embriones de ratón vivos para imagenología de ultrasonido de alta frecuencia con contraste. Este método permite evaluar parámetros de perfusión vascular y unión de microburbujas dirigidas en estudios de biología del desarrollo.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa Terry Fox del Instituto Nacional del Cáncer de Canadá.

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F.S. Foster reconoce su papel como consultor de VisualSonics Inc.

Los agentes de contraste de ultrasonido fueron inyectadas en la última etapa de la gestación de embriones de ratón y las imágenes de contraste no lineales fueron adquiridos para medir parámetros de perfusión y microburbujas dirigidos vinculante. El éxito de formación de imágenes de microburbujas dentro de la vasculatura embrionaria era dependiente de una serie de factores, siendo el primero la viabilidad del embrión. Todo el equipo y el aparato se prepararon de antemano con el fin de minimizar el tiempo requerido para e...

La ecografía con contraste hace uso de agentes de contraste de microburbujas de visualizar y caracterizar el ambiente vascular. Estos agentes permiten la evaluación no invasiva de la microcirculación, la vascularización y la función cardiovascular. Además, la modificación de la superficie de la burbuja puede resultar en microburbujas específica de unión a los biomarcadores endoteliales, como se ha demostrado en aplicaciones preclínicos de la angiogénesis, la aterosclerosis y la inflamación 1,2 toma de imágenes por ultrasonido molecular de eventos vasculares posibles. Por lo tanto, un mayor contraste de ultrasonido puede ser usado para identificar los entornos complejos y diversos que influyen en los estados vasculares sanas y enfermas 3-5. En el último número de años, el interés en la utilidad de las imágenes de microburbujas se ha extendido al modelo de embrión de ratón versátil. Como modelo de desarrollo de los mamíferos, la introducción de microburbujas en la vasculatura embrionaria mejora fisiológicaestudio del desarrollo del sistema circulatorio (por ejemplo, el flujo sanguíneo, el gasto cardíaco) y en casos de transgénicos y dirigidos modelos de ratones mutantes de la enfermedad cardíaca 6,7, puede ayudar a comprender cómo los factores genéticos alterar la función cardiovascular. De hecho, los análisis 2D cuantitativa y cualitativa de la vasculatura del cerebro embrionario ya se han logrado 8. Además, el embrión de ratón se presenta como un modelo excelente para examinar la unión de microburbujas dirigidas a los marcadores vasculares in vivo. Bartelle et al. 9, por ejemplo, han introducido microburbujas avidina en embrión ventrículos cardíaco para evaluar dirigido específicamente vinculante en Biotag-Bira embriones transgénicos y examinar la anatomía vascular. La generación de modelos heterocigotos y homocigotos ratón también puede ser utilizado como un sustituto de los estudios de modelos tumorales con el objetivo de definir la naturaleza cuantitativa de ultrasonido molecular - un punto de referencia importante en la traducción de esta técnica a la clínica. <p clculo = &quot;jove_content&quot;&gt; microburbujas se presentó con mayor frecuencia a la circulación embrionaria a través de inyecciones intra-cardiaca en embriones únicos expuestos a través de una laparotomía 8-10. En inyecciones útero, sin embargo, se enfrentan a una serie de desafíos. Estos incluyen la orientación de la inyección, la necesidad de contrarrestar el movimiento en la madre y el embrión exteriorizada, el mantenimiento de la viabilidad de hemodinámica en la madre y embriones exteriorizados, abordando los efectos a largo plazo de la anestesia y las complicaciones por sangrado 11. Por lo tanto, el objetivo de la investigación fue desarrollar una técnica para la inyección de microburbujas en aislados de vida embriones en etapa tardía 12. Esta opción ofrece más libertad en términos de control de la inyección y el posicionamiento, la reproducibilidad del plano de formación de imágenes sin obstrucción, y análisis de imagen simplificada y cuantificación. En el presente estudio, se describe un nuevo procedimiento para la inyección de microburbujas en que viven los embriones murinos FOr los efectos de estudiar el comportamiento cinético de microburbujas y de estudiar la unión a marcadores de superficie endoteliales endógenos de microburbujas dirigidas. Ecografía específica contraste no lineal se utiliza para medir una serie de parámetros de perfusión básicos, incluyendo la mejora de pico (PE), lavandería en la tasa y el tiempo hasta el pico (TTP) en aislados embriones E17.5. También demuestran la validez del modelo de embrión para evaluar la naturaleza cuantitativa de la ecografía molecular en una pérdida de la endoglina embrionario de modelo de ratón transgénico función, donde la endoglina es una diana clínicamente relevante debido a su alta expresión en las células endoteliales vasculares en los sitios de angiogénesis activa 13 . La adhesión de isotipo IgG de rata de control de la endoglina 2-dirigida (MB E), (MB C) y (U) MB microburbujas no focalizados se evalúa en la endoglina heterocigotos (Esp +/-) y homocigotos endoglina (Eng + / +) que expresan embriones. Análisis del bindi apuntadong revela que el ultrasonido molecular es capaz de diferenciar entre los genotipos endoglina y relacionando densidad de los receptores a los niveles cuantificables de ultrasonido moleculares.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents<</td></tr><tr>td colspan="4">Antibodies (biotinilado, eBioscience) &#8212; La elección del anticuerpo depende del experimento</td></tr><tr><td><ul style="padding:0px; margin:0px"><li>rata isotipo IgG2 control</li></ul></td><td>eBioscience</td><td>13-4321-85</td><td>Esta combinación de anticuerpos/microburbujas se requiere a menudo como control experimental&nbsp;</td></tr><tr><td><ul style="relleno:0px; margin:0px"><li>biotina anti-ratón CD309</li></ul></td><td>eBioscience</td><td>13-5821-85</td><td></td></tr><tr><td>Rata biotinilada MJ 7/18 anticuerpo contra endoglina de ratón</td><td>Hibridoma</td><td></td> interno <td>Los anticuerpos externos también pueden ser apropiados: hemos utilizado eBioscience (13-1051-85) en el pasado</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> destilada<td colspan="4">Embryo media</td></tr><tr><td><ul style="relleno:0px; margen:0px"><li>500 ml Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio con glucosa alta</li></ul></td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td><ul style="padding:0px; margin:0px"><li>50 ml Suero Fetal Bovino</li></ul></td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>lote # 7592456</td></tr><tr><td><ul style="relleno:0px; margin:0px"><li>Hepes</li></ul></td><td>Gibco</td><td>15630</td><td>5 ml, 1 M</td></tr><tr><td><ul style="relleno:0px; margen:0px"><li>Penicilina-Estreptomicina</li></ul></td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 ml, 10,000 unidades Pen., 10,000 &#956; g Etanol estreptocócico</td></tr><tr><td>, 70%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hielo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>76240</td><td>4%</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato [1x]&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>1x, sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio</td></tr><tr><td>Ratón embarazada, CD-1</td><td>Charles River Laboratories Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (solución salina) al 0,9%</td><td>Hospira</td><td>0409-7984-11</td><td></td></tr><tr><td>Agente de contraste ultrasónico, micromarcador listo para objetivos y no dirigido</td><td>; VisualSonics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel de ultrasonido (Aquasonic 100, incoloro)</td><td>CSP Medical</td><td>133-1009</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular (4) :&nbsp; 100&nbsp; x&nbsp; 20&nbsp; mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular (12) : 60&nbsp; x&nbsp; 15&nbsp; mm</td><td>Centrífuga Sigma</td><td>D8054</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall Legend RT&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos, 50 ml BD Falcon</td><td>VWR</td><td>21008-938</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente</td><td>Beckman Coulter</td><td>Isoton II Diluyente, 8448011</td><td></td></tr><tr><td>tijeras de disección (Wagner)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Wagner 14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de astilla</td><td>VWR</td><td>25601-134</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de vidrio, 2 L (Vaso Griffin)</td><td>VWR</td><td>89000-216</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio, 1 x 90&nbsp; mm GD-1 con filamento</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de agujas de vidrio</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>Guantes</td><td>Ansell</td><td>4002</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de anatomía macroscópica</td><td>Fine Science Tools</td><td>10088-15</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>VWR</td><td>89090-994</td><td></td></tr><tr><td>Cubitera</td><td>Cole Parmer</td><td>RK 06274-01</td><td></td></tr><tr><td>Imagen Plataforma</td><td>: VisualSonics Inc.</td>Sistema <td></td><td>de rieles integrado</td></tr><tr><td>Fuente de luz, fibra óptica</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-562-36</td><td>Idealmente tiene brazos ajustables</td></tr><tr><td>Luers (12), polipropileno con púas hembra &frac14;-28 UNF rosca</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-30</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microultrasonido, alta frecuencia</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>Agujas Vevo2100</td><td></td></tr><tr><td>, calibre 21&nbsp; (1")</td><td>VWR</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de tamaño de partícula</td><td>Beckman Coulter</td><td>Multisizer 3 Coulter Counter</td><td></td></tr><tr><td>Cuchara perforada (Moria)</td><td>Fine Science Tools</td><td>MC 17 10373-17</td><td></td></tr><tr><td>Pines (6), negro anodizado minutien 0.15 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Pipettors [2-20 &#956; l, 20-200 &#956; l, 100-1.000 &#956; l]</td><td>Eppendorf</td><td>Research Plus&nbsp; 3120000038 ajustable; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3120000054; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>3120000062</tr><tr><td>Puntas de pipeta [2-200&nbsp; &#956; l, 50-1.000&nbsp; &#956; l]</td><td>Eppendorf</td><td>epT.I.P.S.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 22491334; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>022491351</tr><tr><td>Tijeras</td> Sylgard 184 Kit de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastómero de Silicona</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubing, laboratorio Tygon 1/32" x 3/32"</td><td>VWR</td><td>63010-007</td><td></td></tr><tr><td>Barra aplicadora de madera (hisopo, cabeza de algodón)</td><td>VWR</td><td>CA89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico con aumento de 5-8X</td><td>Jeringas Fisher Scientific</td><td>Steromaster</td><td></td></tr><tr><td>, 1 ml Jeringas Normject</td><td></td><td>Fisher 14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>(10), 30 ml</td> Bomba de infusión de jeringa <td>VWR</td><td>CA64000-041</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Bio-lince&nbsp;</td><td>Termómetro NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>, -20-110&nbsp; &#176; C</td><td>VWR</td><td>89095-598</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>VWR</td><td>33501-418</td><td></td></tr><tr><td>Tubos, Eppendorf</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>Bastidores de tubos (3)</td><td>VWR</td><td>82024-462</td><td></td></tr><tr><td>Transductor de ultrasonidos, 20 MHz</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>MS250</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen, Fine</td><td>Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes de contraste en embriones de ratón uso de alta frecuencia de ultrasonido

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Las imágenes con contraste por ultrasonido pueden transmitir información cuantitativa esencial sobre la vascularización y la perfusión de los tejidos y, en aplicaciones específicas, facilitar la detección y medición de biomarcadores vasculares a nivel molecular. Dentro del embrión de ratón, esta técnica no invasiva se puede utilizar para descubrir los mecanismos básicos que subyacen al desarrollo vascular en el sistema circulatorio temprano del ratón y en modelos genéticos de enfermedad cardiovascular. El embrión de ratón también se presenta como un modelo excelente para estudiar la adhesión de las microburbujas a las dianas angiogénicas (incluido el receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2) o αvβ 3) y para evaluar la naturaleza cuantitativa de la ecografía molecular. Por lo tanto, desarrollamos un método para introducir agentes de contraste ultrasónicos en la vasculatura de embriones vivos aislados. Esto permite libertad en términos de control y posicionamiento de la inyección, reproducibilidad del plano de imagen sin obstrucciones ni movimiento, y análisis y cuantificación de imágenes simplificados. En la etapa gestacional tardía (día embrionario (E)16.6 y E17.5) se aislaron embriones murinos del útero, se exteriorizaron suavemente del saco vitelino y se inyectaron agentes de contraste de microburbujas en las venas accesibles en la superficie coriónica del disco placentario. A continuación, se emplearon imágenes de ultrasonido con contraste no lineal para recopilar una serie de parámetros básicos de perfusión (realce del pico, tasa de lavado y tiempo hasta el pico) y cuantificar la unión de microburbujas dirigidas en un modelo de ratón endoglina. Mostramos la circulación exitosa de microburbujas dentro de embriones vivos y la utilidad de este enfoque en la caracterización de la vasculatura embrionaria y el comportamiento de las microburbujas.

La inyección de agentes de contraste de ultrasonido en el útero los embriones de ratón ex depende del éxito en el aislamiento de la vida, embriones en fase tardía de la gestación del útero y el mantenimiento de la viabilidad en el transcurso de la inyección y de formación de imágenes de ultrasonido relacionada. Una vez que el embrión se ha exteriorizado y posicionado, como se muestra en la Figura 1, la inyección cuidadosa de agente de contraste en la vasculatura embrionaria es posible....

A continuación, presentamos un protocolo para inyectar medios de contraste de microburbujas de ultrasonidos en la vida, aislados finales de la gestación de embriones murinos etapa. Este método permite el estudio de los parámetros de perfusión y de marcadores moleculares vasculares dentro del embrión utilizando imágenes de ultrasonido de alta frecuencia con contraste.

Imágenes de contraste en embriones de ratón Uso de alta frecuencia de ultrasonido

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

El objetivo general de este procedimiento es inyectar microburbujas en embriones de ratón vivos aislados, para la obtención de imágenes por ultrasonido con contraste. Esto se logra primero recolectando embriones vivos E 16.5 o E 17.5 de un ratón preñado.Después de preparar las microburbujas de direccionamiento, se inyectan en el embrión vivo a través de la red vascular placentaria. El paso final consiste en obtener imágenes de las microburbujas mediante ecografía. En última instancia, la ecografía con contraste podría utilizarse para medir parámetros de perfusión vascular y evaluar la unión de microburbujas dirigidas en embriones.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con el manejo de los embriones y las partes de inyección del protocolo hasta que hayan practicado lo suficiente para aplicar las presiones adecuadas con la aguja y las pinzas necesarias para un experimento exitoso. La persona que demostrará el procedimiento será Brian Nixon, un estudiante cooperante de nuestro laboratorio. Para reconstituir los viales de destino listos, comience diluyendo 20 microgramos de la solución de anticuerpo en un volumen final de un mililitro de solución salina

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En la cirugía de la supervivencia en ratones in utero permite la manipulación molecular de la expresión génica durante el desarrollo. A continuación se describe el uso de alta frecuencia, la ecografía para guiar la inyección de vectores retrovirales en el cerebro del ratón en el día embrionario (E) 9.5.

Guiada por ultrasonido microinyección en el cerebro anterior Ratón In Utero En E9.5

La muerte fetal y perinatal es una característica común en el estudio de las alteraciones genéticas que afectan el desarrollo cardíaco. Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido ha mejorado en 2-D y resolución pueden proporcionar información relevante sobre el desarrollo cardíaco temprano y es un método ideal para detectar el impacto en la estructura y función cardíaca antes de la muerte.

La ecocardiografía fetal murino

Este video muestra un procedimiento para inyectar agentes de contraste de microburbujas en un embrión de ratón aislado en etapa de gestación tardía. Las imágenes de ultrasonido basadas en agentes de contraste de microburbujas ayudan a visualizar y caracterizar el entorno vascular del embrión.

Inyección de microburbujas en embriones aislados de ratón: una técnica para administrar agentes de contraste de microburbujas en la vasculatura de embriones murinos vivos

En este video, demostramos la ecografía de alta frecuencia para obtener imágenes de los sitios de implantación de embriones en un modelo murino embarazada. Esta técnica de imagen detecta con éxito el embarazo viable y caracteriza los sitios de implantación embrionaria durante el embarazo murino temprano.

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En el útero de medición de la frecuencia cardíaca en el ratón por no invasiva Ecocardiografía en modo M

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Aprende a inyectar microburbujas en embriones de ratón vivos para imagenología de ultrasonido de alta frecuencia con contraste. Este método permite evaluar parámetros de perfusión vascular y unión de microburbujas dirigidas en estudios de biología del desarrollo.

Imágenes de contraste en embriones de ratón Uso de alta frecuencia de ultrasonido

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