Name: El chip de varios órganos - Una plataforma de microfluidos para el largo plazo co-cultivo de múltiples tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a diseñar y fabricar chips microfluídicos multi-órgano para cultivar células endoteliales, agregados hepáticos y biopsias de piel durante 28 días. Este protocolo facilita el estudio de interacciones celulares complejas.

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El trabajo ha sido financiado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación, GO-Bio subvención No. 0.315.569.

NOTA: prepucio juvenil humana se obtuvo con la aprobación y el consentimiento informado a la ética (Comité de Ética de la Universidad Charité Medicina, Berlín, Alemania), de conformidad con las leyes pertinentes, a partir de una cirugía pediátrica después de la circuncisión de rutina. 1. La producción de equivalentes de tejido para el cultivo en el MOC <ol><li> Agregado HepaRG y HHSteC en colgar placas de caída para generar esferoides hepáticos. <ol><li> A fin de lograr la tripsinización de las células HepaRG cultivadas en frascos de cultivo celular (75 cm 2), se elimina el medio de la confluencia, los cultivos monocapa diferenciadas, lavar con PBS dos veces, y añadir 3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA. Incubar durante 3 a 5 min a 37 ° C y detener la reacción mediante la adición de 6 ml de inhibidor de tripsina. </li><li> Centrifugar las células HepaRG a 150 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio de cultivo celular HepaRG, y contar las células. La viabilidad celular debe ser&gt; 90%. </li><li> EnPara lograr la tripsinización de las células HHSteC, eliminar el medio de cultivos en monocapa, lavar con PBS dos veces, y añadir 3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA. Incubar durante 5 min a 37 ° C y detener la reacción mediante la adición de 6 ml de inhibidor de tripsina. </li><li> Centrifugar las células HHSteC a 150 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio de cultivo celular HepaRG, y contar las células. </li><li> Combinar HepaRG y HHSteC en una proporción de 24: 1 en HepaRG medio de cultivo celular. Para ello, ajustar el número de células por dilución de suspensiones de células HepaRG en medio de cultivo celular y añadir 1 x 10 5 células / ml HHSteC a 4,8 x 10 6 células / ml HepaRG células. Mezclar con cuidado. </li><li> Preparar una placa de gota colgante mediante la adición de 2 ml de PBS a la gota colgante y la placa de receptor. </li><li> Pipetear 20 l de la suspensión celular en cada pocillo de la placa de gota colgante. Siempre prepare un 10% más que cuelga gotas de lo que necesita para recuperar los agregados, como algunos agregados se pierden During del procedimiento. Con cuidado, coloque la placa en una incubadora a 37 °. Espere 48 horas para los esferoides se formen. </li><li> Con el fin de recuperar los esferoides, asegúrese de usar puntas de pipeta con finales punta anchos o cortar las puntas de 1 ml puntas de pipeta con un cuchillo estéril con el fin de ensanchar la abertura de aproximadamente 2 a 3 mm. Utilice estas puntas de pipeta para manejar los esferoides sin interrumpir ellos. </li><li> Lavar esferoides cuidadosamente de la placa de gota colgante añadiendo repetidamente 1 ml de medio a la parte superior de los pocillos de la placa de gota colgante utilizando una pipeta. Lavar la placa hasta que todos los esferoides se han caído. Los esferoides son ligeramente en forma de disco con un diámetro medio de 300 a 400 micras y una altura de entre 200 y 300 micras, con este punto. </li><li> Recoge los esferoides en la placa receptora y transferirlos a placas de 24 pocillos ultra-bajas de fijación, con un máximo de 20 esferoides por pocillo usando las puntas de pipeta preparadas. Ajuste los volúmenes de medios en cada pocillo a 0,5 ml. Utilice 20 agregados a Inocular un circuito MOC para obtener una tasa de miniaturización de 1 / 100.000 respecto del número de células in vivo. </li><li> Incubar los esferoides a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta su uso posterior en el MOC. No guarde los esferoides más de tres días antes de su uso para asegurar la comparabilidad. Cultivar los agregados durante al menos un día en placas ultra-bajas de fijación para recuperar los esferoides homogéneos. </li></ol></li><li> Perseguir cualquiera de los dos enfoques para generar equivalentes de tejido de la piel: el uso de biopsias por punción (1.2.1) o el uso de ya hechas en modelos de tejidos in vitro (1.3.1). <ol><li> Cortar con un cuchillo transwells incandescente debajo del soporte para preparar 96 pocillos insertos de cultivo celular y almacenar bajo condiciones estériles hasta su uso posterior. </li><li> Esterilizar muestras prepucio en etanol al 80% durante 30 segundos y cortar el anillo abierto. Las muestras deben tener una altura promedio de 2 mm. </li><li> Use un punzón de biopsia para cortar biopsias de 4,5 mm de diámetro para obtener una miniaturiza igualla relación tanto para el hígado y la piel. Cargue las biopsias en el preparado de 96 pocillos Transwell inserta con fórceps. Tenga cuidado de colocar las biopsias con la cara epidérmica hacia arriba. </li><li> Cultura Place celular inserta con biopsias en una placa receptora que contienen HepaRG medio de cultivo celular y almacenar a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta su uso posterior en el MOC. No almacenar muestras de más de 2 a 3 horas. </li></ol></li><li> Integrar ya hechas en modelos de piel in vitro, comprado a varios proveedores, en el MOC, asegurándose de que están en 96 pocillos Transwell formato. Utilice el medio de cultivo celular suministrado por el proveedor o, si un co-cultivo con otro tejido se prevé en una etapa adicional, utilice un medio mínimo apoyar ambos tejidos. Pruebe el respectivo medio mínimo en experimentos estáticos anteriores por su capacidad para apoyar a los tejidos. <ol><li> Recuperar modelos de piel de la placa de soporte y cortar las inserciones de 96 pozos por debajo del soporte con un cuchillo incandescente. </li&gt; <li> Coloque los insertos de nuevo en la placa receptora y almacenar a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta su uso posterior en el MOC. No almacenar muestras de más de un día. </li></ol></li></ol> 2. Fabricación MOC <ol><li> Mezclar los PDMS y agente de curado en una proporción de 10: 1 (v / v) y coloque la mezcla bajo vacío durante 15 min para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Mientras tanto, el tratamiento de una cubierta de placa de policarbonato con el aditivo de caucho de silicona a 80 ° C durante 20 min. </li><li> Inserte los tornillos de teflón en los respectivos orificios de la placa de la cubierta para crear los cuatro compartimentos de cultivo celular PDMS libres y los seis PDMS, 500 micras de espesor, de la microbomba. </li><li> Conecte la placa de la cubierta preparada para el molde maestro de los dos circuitos microvasculares e inyectar el PDMS desgasificados. Tenga cuidado de no integrar las burbujas de aire en el sistema. Si las burbujas emergen, tratar de eliminarlos por la inclinación del dispositivo. </li><li> Incubar el sistema a 80 ° C durante 60 min para curar la capa de PDMS. </li><li> Retire el molde maestro y los tornillos de teflón del dispositivo y unir la capa de PDMS a un portaobjetos de vidrio con una huella de 75 x 25 mm usando 2 bajo la oxidación de plasma a presión. </li><li> Tornillo de adaptadores especiales MOC hilo a los cuatro compartimentos de cultivo de células de la placa de cubierta. </li><li> Conecte jeringas que contienen medio de cultivo para Luer hembra x ¼-28 adaptadores macho y atornillan a los adaptadores MOC de la placa de cubierta. </li><li> Inyectar el medio en el circuito de microfluidos empujando repetidamente hacia abajo y tirando hacia arriba de los émbolos de jeringas. </li><li> Compruebe el correcto llenado de los canales con medio bajo el microscopio. </li></ol> 3. La endotelización del MOC <ol><li> Antes de endothelializing el MOC, a ras cada circuito MOC con medio de crecimiento celular endotelial e incubar estáticamente por tres días a 37 ° C y 5% de CO 2. <ol><li> Esterilizar los MOCs utilizando una mezcla de etanol y limpie los colocan debajo de un banco de flujo laminar. YOn Además, esterilizar dos pares de pinzas y dos llaves hexagonales para su uso posterior. </li><li> Afloje las tapas del compartimiento de cultivo de tejidos de la MOC utilizando las teclas hexagonales y quitar las tapas usando las pinzas. Después de insertar el medio, las tapas roscadas de nuevo en el MOCs de la misma manera. </li></ol></li><li> A fin de lograr la tripsinización de las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC), eliminar el medio de los cultivos en monocapa, lavar con PBS dos veces, y añadir 3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA. Incubar durante 5 min a 37 ° C y detener la reacción mediante la adición de 6 ml de inhibidor de tripsina. </li><li> Centrifugar la HDMEC a 220 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio de crecimiento de células endoteliales, y recuento de células. La viabilidad celular debe ser&gt; 90%. </li><li> Ajuste el recuento de células en la suspensión celular a una concentración final de 2 x 10 7 células / ml por dilución con medio de crecimiento de células endoteliales y transferir 250 l de auna jeringa de 1 ml. Aplicar esta concentración de las células al MOC para mantener la tasa de miniaturización de 1 / 100.000 para todos los órganos. </li><li> Conecte la jeringa a una hembra x ¼-28 adaptador Luer macho, expulsar el aire de este montaje, y atornillarlo a un adaptador especial MOC hilo. Conectar el adaptador a uno de los dos compartimentos de cada circuito de MOC. </li><li> Conectar una jeringa vacía de la misma manera al segundo compartimento del circuito MOC. </li><li> Inyectar las células uniformemente empujando hacia abajo y tirando hacia arriba los dos émbolos de la jeringa varias veces de forma consecutiva. Controlar la infusión de las células bajo el microscopio. </li><li> Incubar la MOC a 37 ° C y 5% de CO 2 en condiciones estáticas durante 3 horas para permitir que las células se adhieran a las paredes del canal. </li><li> Retire el chip de la incubadora, colocarlo debajo de un banco de flujo laminar, y reemplazar las jeringas y los adaptadores MOC MOC con hilo de cámaras especiales de cultivo de células. </li><li> Añadir 400 l de medio fresco a uno compartamento de cada circuito MOC y se deja a eliminar a través de los canales de la presión hidrostática. Después, sustituya el medio en los dos compartimentos con 300 l de medio fresco. </li><li> Cierre los compartimentos usando tapas, como se describe en 3.1.2. </li><li> Conectar el chip a la unidad de control de la bomba. Ajuste la velocidad de bombeo para una frecuencia de 0.475 Hz y cultivar el chip a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Sustituya el medio de cada compartimiento MOC cada uno o dos días y controlar la morfología de las células al microscopio óptico. </li></ol> 4. La carga de la viruta <ol><li> Coloque el MOC bajo el banco de flujo laminar y abrirla, tal como se describe en el paso 3.1.2. </li><li> Retire el papel de los compartimientos de cultivo de tejidos y reemplazarlo con 300 l de medio de cultivo celular fresco HepaRG. </li><li> Transferir 20 esferoides preformadas a un tejido compartimiento de cultura de cada circuito MOC usando las puntas de pipeta con una amplia abertura (consulte los pasos 1.1.8 / 9). Cierre la cap utilizando pinzas y llaves hexagonales. </li><li> Transferencia de 96 pocillos insertos de cultivo de células que contienen equivalentes de piel a la restante compartimiento de cultivo de tejidos de cada circuito MOC utilizando fórceps. Tenga cuidado para evitar la formación de burbujas debajo de la membrana de la piel equivalente. Para ello, inserte transwells en un ángulo ligeramente inclinado y empuje suavemente hacia abajo. Retire el exceso de medio alrededor del transwell siendo empujado desde abajo con una pipeta. </li><li> Cierre la tapa con unas pinzas y llaves hexagonales. </li></ol> 5. Conexión del chip a la Unidad de Control de Bombas <ol><li> Establezca los parámetros operacionales en las unidades de control a los valores deseados. Modificar la presión del aire de 0 a 8.000 mbar, de vacío 0 a -800 mbar, y el bombeo de frecuencia 0,24 a 2,4 Hz. Establezca la dirección de bombeo hacia la derecha o hacia la izquierda. </li><li> Retire los MOC contiene equivalentes de tejido de debajo del banco de flujo laminar y conectarlo a las unidades de control de la bomba. </li><li> Después de la numeration en los tubos, insertar tubos de presión de aire a los respectivos accesorios en la MOC. </li><li> Cultivar el MOC a 37 ° C y 5% de CO 2 en una incubadora o, en el caso de imágenes de tejidos vivos, utilice el apoyo MOC para calentar el chip a 37 ° C y cultivar el chip fuera de la incubadora. Utilice el apoyo climatizada para cultivar células en el MOC bajo un microscopio estándar. </li></ol> 6. Realizar intercambios Medios, Medios de muestreo y la exposición a sustancias <ol><li> Realizar intercambio de medios de rutina cada día o cada dos días, considerando el tipo de tejido cultivado y la actividad metabólica de las células. <ol><li> Recuperar el MOC de la incubadora y observarlo bajo el microscopio para controlar los caudales medios y comprobar la contaminación. </li><li> Desconecte el MOC de la unidad de control de la bomba desconectando el tubo de presión del aire. Esterilizar el MOC utilizando toallitas de etanol y se pone debajo de la cabina de flujo laminar. </li><li> Abra el borrador de cultivo de tejidosartamento que contiene los esferoides hepáticos, como se describe en el paso 3.1.2. </li><li> Remover hasta 200 l de compartimiento usando una pipeta sin interrumpir los esferoides y almacenar el medio en un pocillo vacío de una placa de pocillos profundos. Analizar la muestra de medios directamente o cerrar la placa de pocillos profundos y almacenar las muestras de medios a -80 ° C para su posterior análisis. </li><li> Sustituya el medio de la MOC con medio de cultivo celular hasta 250 l fresco y cerrar la tapa. La diferencia en la cantidad de retirados y cuentas para la pérdida reemplazado medio debido a las pequeñas cantidades fugas fuera del chip al cerrar el sistema. </li><li> Abra la tapa del compartimiento de cultivo de tejido que sostiene los equivalentes de piel en este punto para comprobar intacto el tejido. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire en el sistema. Cierre la tapa. </li><li> Conectar el tubo de la unidad de control de la bomba a la MOC, según la etapa 5.3, y colocar el MOC en una incubadora. </li></ol></li></ol> 7. Analizar Muestras diario Medios y realizar análisis en línea <ol><li> Analizar el rendimiento de cultivo de tejidos en línea utilizando imágenes de células vivas o sin conexión, mediante el análisis de las muestras de medios diarios. Realizar este último mediante ensayos enzimáticos de rutina estándar (por ejemplo, lactato deshidrogenasa (LDH) de actividad) o ELISA (por ejemplo, la concentración de albúmina). Un análisis en línea se describe a continuación. </li><li> Retire el papel de la MOC endotelizado, tal como se describe en los pasos 6.1.1 a 6.1.4, y sustituirla en los dos compartimentos de cultivo de tejidos con 200 l de 10 mg solución (LDL) / ml fluoróforo conjugado acetilado lipoproteínas de baja densidad (diluido en medios de cultivo celular). </li><li> Cierre las tapas. Conectar el MOC a la unidad de control de la bomba, según la etapa 5.3, y la bomba por 30 min a 0.475 Hz para distribuir uniformemente la solución dentro del circuito de microfluidos. </li><li> Detenga el bombeo y se incuba la MOC estáticamente durante 3,5 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> T similareso el paso 7.2, eliminar la solución LDL acetilado de ambos compartimentos y reemplazarlo con 400 l de medio fresco en uno de los dos compartimientos. </li><li> Espere de 3 a 5 minutos para dejar que la presión hidrostática en coche el medio a través del circuito de canales de microfluidos. </li><li> Reemplazar el medio que ha fluido a través con 300 l de medio fresco y también llenar el segundo compartimento de cultivo de tejidos con 300 l de medio fresco. </li><li> Cierre el MOC, según la etapa 3.1.2. Póngalo en un microscopio de fluorescencia y observar el crecimiento celular y la viabilidad. </li><li> Coloque el MOC manchado de nuevo en la incubadora para continuar el cultivo. Quite la mancha se escape de las células con cada uno tras la sustitución de medios. </li></ol> 8. Recuperar equivalentes de tejido del MOC y realizar análisis de punto final <ol><li> Recuperar equivalentes de tejido de la MOC al final del experimento para los análisis de punto final. <ol><li> Con el fin de recuperar el hígado y la piel equivalents del MOC, retire los medios de comunicación de cada compartimiento de cultivo de tejidos, como se describe en los pasos 6.1.1 al 6.1.4. </li><li> Retire los insertos de cultivo celular de 96 pocillos que contienen la piel de la MOC utilizando fórceps. Despegar la membrana cuidadosamente de la pieza de inserción por agarre en un lado con unas pinzas y tirando de él hacia abajo. Tenga cuidado de no perder el equivalente de piel en este punto. </li><li> Congelar la membrana que sostiene la piel equivalente en compuesto crio-inclusión y almacenarlo a -80 ° C hasta su posterior análisis. </li></ol></li><li> Eliminar los equivalentes de hígado de manera similar desde el compartimiento de cultivo de tejidos pipeteando ellos utilizando puntas de pipeta de corte (véase el paso 1.1.8 / 9). <ol><li> Insertar los esferoides hepáticos en compuesto crio-inclusión. Tenga cuidado de no transferir demasiado líquido y eliminar cualquier exceso de líquido con una pipeta. Después de colocar los esferoides en el compuesto de inclusión y eliminando el medio, añadir más compuesto crio en la parte superior de los esferoides para encerrar completamente. </li><li> Congele los equivalentes del hígado y almacenarlo a -80 ° C hasta su posterior análisis. </li></ol></li><li> Realizar un análisis de punto final mediante la reducción de los equivalentes de tejido en un Cryo-micrótomo a 8 micras secciones y tinción para los marcadores específicos de tejido, tal como se describe en los protocolos anteriores 10. </li></ol>

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</ol>

Uwe Marx es CEO de TissUse GmbH que produce y comercializa la plataforma multiorgánica chip utilizado en el artículo. Esta publicación fue financiada por una concesión otorgada por Corning Inc.

La plataforma MOC descrito aquí representa una herramienta estable y potente para el cultivo de tejidos de diversos orígenes en condiciones de flujo medio dinámico durante períodos prolongados cultura 10,16. En este ejemplo, se utilizó la plataforma para cultivar células primarias (HDMEC), equivalentes de tejido generados a partir de una línea celular de hígado (agregados), y un cocultivo de la mencionada anteriormente con una biopsia de tejido. El MOC fue capaz de sostener el co-cultivo de tres tejidos durante 28 días en un circuito de medio combinado. Para el mejor conocimiento de los autores, esta es la primera vez que un co-cultivo de varios tejidos incluyendo biopsias, células primarias y líneas celulares se ha realizado más de cuatro semanas. Uno de los principales inconvenientes de los sistemas de microfluidos es la afinidad de moléculas pequeñas a adherirse a la superficie del material del circuito de fluido. A medida que la relación de superficie a volumen es especialmente alta en los sistemas de microfluidos, este efecto es aún más pronunciado 17 </sarriba&gt;. La cobertura HDMEC estable de los canales, introducido aquí, podría actuar como una barrera biológica prevenir la adhesión de moléculas a la MOC. Además, puede servir como un recipiente de hemocompatible para la circulación de la sangre entera, la prevención de la coagulación de la sangre. Sin embargo, el uso de sangre entera como una sustitución medio no es factible ya que todavía no se ha logrado una vascularización completa de los equivalentes de órganos. Trabajo en la vascularización de los tejidos -generated in vitro existente es prometedor y guía el camino para nuevos estudios 18,19. Es bien sabido que los hepatocitos tienden a perder sus funciones específicas del hígado con el tiempo bajo condiciones de cultivo estático de dos dimensiones in vitro 20. Enzimas metabolizantes, tales como la familia del citocromo P450, son de especial importancia si el metabolismo de un determinado fármaco se va a estudiar. El citocromo P450 3A4, una enzima relacionada con la biotransformación de muchos xenobióticos, y citocromo P450 7A, which interviene en la síntesis de ácidos biliares, se expresaron en el hígado de los agregados se cultivaron en el MOC más de 14 días. Esto indica la preservación de un fenotipo metabólicamente activo, lo que permite estudios de metabolismo de drogas. El aumento de la tasa de producción de albúmina de agregados en el MOC en comparación con cultivos estáticos es una indicación adicional para condiciones de cultivo adecuadas. Las tasas de producción de albúmina observadas durante este estudio fueron similares o incluso superiores a los valores previamente obtenidos por los chips de microfluidos incluyendo células HepG2 21-23, sin embargo, los valores no alcanzaron los de cultivos de hepatocitos humanos primarios 24. Además, el sistema MOC, en su diseño temporal, no permite una segregación independiente de la bilis. Las células en las estructuras biliares-canalículos como polarizadas y agregados formados, como se muestra por MRP-2 tinción. Sin embargo, los canalículos no estaban conectados a un canal técnica recogida de la bilis. Esta mezcla no fisiológicoción de la bilis con el compartimiento de la sangre tiene que ser abordado en un futuro rediseño del sistema. El ajuste de las características de flujo es de gran importancia 25, especialmente con respecto a los tejidos sensibles a la tensión de cizallamiento, tales como el hígado. La cantidad de esfuerzo de cizallamiento percibida por el tejido puede ser modificado de dos maneras: En primer lugar, la presión de aire usada para empujar hacia abajo las membranas de la bomba se puede reducir, disminuyendo los valores de esfuerzo cortante de pico en el sistema. En segundo lugar, los tejidos se pueden incrustar en una estratificación de la matriz extracelular o cultivaron en insertos de cultivo transwell. Este último escudo de los tejidos de la corriente subyacente con una membrana porosa. Estos ajustes deben realizarse de forma individual por cada equivalente de órganos antes de comenzar el experimento MOC. En una operación pulsátil de 2,4 Hz, por ejemplo, que corresponde a una actividad de alto, pero aún fisiológica, corazón de 144 latidos / min en los seres humanos, la tensión de cizallamiento se mide en elcanales del circuito microvascular alcanza aproximadamente 25 dyn / cm 2. Esto corresponde a una tensión de cizalla fisiológica en el extremo superior de la escala en la microvasculatura y es, por lo tanto, también es aplicable para los experimentos incluyendo un endotelización de los canales. Sin embargo, como la corriente de diseño de microfluidos del sistema MOC presentado se compone de un solo circuito de los medios de comunicación que conecta los dos compartimentos de órganos, una tasa de velocidad de bombeo y el estrés de cizalla tiene que ser elegido para todo el sistema. Por lo tanto, un ajuste exacto de las características de flujo a las necesidades de cada solo órgano no siempre es factible. Por otra parte, la atención tiene que ser tomado en el ajuste de las células al medio común. Las células se cultivan en el MOC en un circuito combinado medios de comunicación, por lo tanto, no hay medios de cultivo celular individual puede ser utilizado para cada modelo de tejido, como es el estándar para cultivo celular in vitro. Una formulación de los medios de comunicación combinado mínima necesita ser definido de antemano y tél las células necesitan ser ajustados por etapas para este nuevo medio. Un procedimiento de ajuste de 80% / 20% mayor para los nuevos medios de comunicación durante dos días, luego 50% / 50% seguido de 20% / 80%, y un amplio intercambio siempre condujo a una viabilidad celular razonable y funcionalidad de las culturas en nuestras manos. El actual diseño de microfluidos del sistema MOC permite que el cocultivo de hasta tres tejidos. Se necesita un cocultivo de por lo menos el diez órganos más importantes del cuerpo humano para alcanzar la homeostasis. Por lo tanto, el sistema presentado es capaz de predecir las interacciones tejido específicos de tejido, pero no la verdadera respuesta sistémica a una sustancia. Otro desarrollo de la MOC para incluir más cavidades de órganos está previsto. Por otra parte, la validez del sistema es para ser mostrado usando un conjunto de compuestos de referencia. Preferiblemente, los compuestos que han fracasado durante los ensayos clínicos (como troglitazona) deben ser probados para su desempeño en el Ministerio de Comercio. Considerando que, una verdadera validación de sistemas tan complejos sigue impidiendo que by la falta de normalización en cuanto biomarcadores y criterios de valoración para la evaluación funcional, la recopilación de más datos sobre los resultados toxicológicos de éste y de otros sistemas ampliará su fiabilidad y ámbito de aplicación.

Monocapa o suspensión de los ensayos actuales de cultivo de células para el desarrollo de medicamentos no logran emular el microambiente celular humana y, por lo tanto, llevar a una desdiferenciación rápida y pérdida de función en cultivos de células humanas primarias. Se necesitan modelos de tejido con mayor relevancia fisiológica para predecir la eficacia y seguridad de los compuestos antes de admitir a los ensayos clínicos. Recientemente, estándar en las técnicas de cultivo celular in vitro han evolucionado a partir de cultivos en monocapa de dos dimensiones hacia modelos multi-celulares tridimensionales, con el objetivo de imitar el microambiente del tejido vivo en. Estos sistemas ya han demostrado mejoras importantes hacia la predicción más precisa del modo de acción de los compuestos 1,2. Además, la adaptación de las condiciones de cultivo in vitro a las necesidades altamente especializadas de las células es de particular interés. Bajo estándar en condiciones in vitro, una variedad de importantes cultura parámetros, tales como el suministro de nutrientes y oxígeno, la eliminación de productos de acumulación, y la fuerza mecánica que actúan sobre las células a menudo no pueden ser controlados a fondo en la mayoría de los casos. Muchos órganos poseen gradientes de concentración fisiológicamente relevantes de sustancias y oxígeno disuelto. Sin embargo, esas condiciones altamente reguladas y optimizadas están en clara oposición a los gradientes de difusión incontrolables alrededor de los tejidos bajo condiciones in vitro, dando lugar a un entorno altamente inestable y limitar el desarrollo celular 3. Por lo tanto, se requieren más estable y sobre todo más cuantificable en condiciones in vitro para mantener las células viables y diferenciado durante períodos prolongados de tiempo. Sistemas perfundidos, donde se eliminan periódicamente los componentes del medio y sustituidos, son a menudo mejor caracterizado y controlable que cultivos estáticos relativos a la rodea directa de los tejidos. En condiciones estáticas, gradientes de difusión de secreciones celulares y los nutrientes del medio de cultivopodría rodear células cultivadas 3. Al presentar caudales medianos bien caracterizados alrededor de los tejidos permiten las secreciones de células se mezclen con el medio rico a través de perfusión. Esto permite la generación de microambientes celulares definidos, asegurando un fenotipo celular estable y metabolizar la expresión de la enzima durante toda la duración del ensayo 4. La evolución reciente de chip multi-órgano (MOC) a base de sistemas combinan las ventajas de un flujo medio controlado alrededor de los tejidos con las pequeñas necesidades a medio y masa celular de biorreactores microescala de ingeniería, lo que lleva a una reducida cantidad de sustancia necesaria durante la prueba. Varios sistemas de microfluidos para el cultivo de tejidos se han descrito hasta el momento 5,6. Relaciones tisulares y fluido dentro de estos sistemas juegan un papel especialmente importante en la simulación de diafonía celular fisiológicamente relevante. Sin embargo, debido a limitaciones técnicas, tales como el uso de bombas externas y embalses de medios de comunicación, THe general el volumen circulante medios de comunicación en la mayoría de los sistemas es demasiado grande en comparación con los volúmenes de tejido. El grupo de Shuler et al. Fueron los primeros en desarrollar un sistema que garantice tiempos de residencia adecuados de sustancias dentro de los compartimientos de cultivo celular y vivo relevantes ratios de 7,8-tejido a fluido en. Esto se logró mediante la ampliación del depósito externo abajo a una placa de 96 pocillos, que también representa el compartimiento de &quot;otros tejidos&quot;. A fin de minimizar el volumen de medio que circula dentro de nuestra plataforma MOC, hemos integrado un peristáltica microbomba on-chip, eliminando la necesidad de circuitos de medios externos. Este microbomba es capaz de operar el sistema a un número seleccionable de velocidades de flujo de medios de comunicación y las tasas de esfuerzo cortante 9. Un sistema de canales de microfluidos de 500 micras de ancho y 100 m de altura interconecta dos espacios de cultivo de tejidos estandarizados, teniendo cada uno el tamaño de un único pocillo de una placa de 96 pocillos. La adhesión a los tamaños de la industria y placa estándars permite la integración de modelos de tejido ya existentes producidos en el formato transwell. Además, la posición vertical de transwell insertos de cultivo celular es ajustable, lo que permite el cultivo de modelos de tejidos que no están sólo directamente expuestos al flujo de fluido, pero también puede ser levantado y protegido de la corriente subyacente. De manera similar, los cultivos interfase aire-líquido son factibles utilizando este sistema. La plataforma MOC se fabrica a partir de un polidimetilsiloxano (PDMS) capa de 2 mm de alto y un portaobjetos de microscopio de vidrio con una superficie de 75 x 25 mm 2, que se une permanentemente por la baja oxidación de plasma a presión para formar el circuito de microfluidos estanca a los fluidos. La capa de PDMS que contiene los respectivos canales y compartimientos de cultivo de células se produce por litografía blanda estándar y réplica de moldeo 9. El diseño de microfluidos del MOC utilizado durante este estudio consistió en dos circuitos separados por chip de microfluidos, cada uno con dos células cULTURA compartimentos interconectados por un sistema de canales 100 micras de altura. Esto permitió que el rendimiento de los dos co-cultivos de dos tejidos individuales utilizando un chip de múltiples órganos. Frecuencias de bombeo se ajustaron para producir caudales medio de 40 l / min. Este diseño de dos MOC tejido proporcionado la capacidad de cocultivo un esferoide hígado y una biopsia en sacabocados de la piel en los espacios de cultivo separadas, aunque en un circuito de los medios de comunicación combinada en condiciones de flujo fisiológicas. Células diferenciadas HepaRG se agregaron junto con las células humanas hepáticas estrelladas (HHSteC) en una proporción de 24: 1 para formar esferoides homogéneos. Esta relación se encontró que era óptima, como se observa en los experimentos anteriores 10, a pesar de que, casi dos veces el número de hepatocitos se usaron en comparación con la situación in vivo. La piel se cultivó en una interfase aire-líquido dentro de un inserto de cultivo celular Transwell, permitiendo así la exposición sustancia tópica. Estos modelos de tejido se co-cultivaron durante 28 days en el MOC para demostrar la amplitud de este sistema. Además, el circuito de canal de microfluidos de los chips estaba completamente cubierta con células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC) para simular más estrechamente el sistema vascular.

<table><tbody><tr><td>Células HepaRG</td><td>Biopredic International</td><td></td><td>células indiferenciadas</td></tr><tr><td>HHSteC</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td></td><td>células y todos los suplementos de cultivo</td></tr><tr><td>HepaRG Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicilina 100 &micro; g/ml de estreptomicina 5 y micro; g/ml de insulina humana 2 mM L-glutamina 5 x 10-5 M hemisuccinato de hidrocortisona</td></tr> Medio <tr><td>HDMEC</td><td>Medio PromoCell</td><td></td><td>Medio de crecimiento de células endoteliales MV2 con Supplement-Pack MV2 y 1% de penicilina-estreptomicina</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Carl</td><td>Roth</td><td></td><td>añadir un 2% a los medios HepaRG</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Biowest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina</td><td>Carl Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAXYMum Consejos de Recuperación</td><td>Corning</td><td></td><td>1,000 &micro; l Puntas de pipeta de diámetro ancho</td></tr><tr><td>Placa colgante de 384 pocillos</td><td>3D Biomatrix</td><td></td><td>Perfecta 3D Placa colgante de 384 pocillos</td></tr><tr><td>Matraces para cultivo de tejidos</td><td>Corning</td><td></td><td>75 cm2</td></tr><tr><td>Placa de fijación ultra baja</td><td>Corning</td><td></td><td>24 pocillos</td></tr><tr><td>Insertos de cultivo celular Transwell</td><td>Unidad</td><td></td><td>de 96 pocillos, 0,4 y micro; m tamaño de poro</td></tr><tr><td>Placas de pocillos profundos</td><td>Corning</td><td></td><td>de 96 pocillos, 1 ml</td></tr><tr><td>Punzón de biopsia</td><td>Stusche</td><td></td><td>4,5 mm</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio</td><td>Huella Menzel</td><td></td><td>de 75 x 25&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184</td></tr><tr><td>Aditivo de caucho de silicona</td><td>Wacker Chemie</td><td></td><td>Wacker Primer G790</td></tr><tr><td>Tubos para presión de aire</td><td>SMC Pneumatik GmbH</td><td></td><td>Poliuretano-Schlauch, metrisch</td></tr><tr><td>Alúmina ELISA</td><td>Bethyl Laboratories Bethyl Albúmina</td><td></td><td>humana ELISA Set de cuantificación</td></tr><tr><td>Ensayo</td> <td>de lactato deshidrogenasaStanbio Laboratorio</td><td></td><td>LDH Liqui-UV kit</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 acetilado LDL</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>1 mg/ml</td></tr></tbody></table>

el chip de varios órganos - una plataforma de microfluidos para el largo plazo co-cultivo de múltiples tejidos

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

La cantidad cada vez mayor de nuevas sustancias lanzadas al mercado y la limitada previsibilidad de los actuales sistemas de ensayo in vitro han llevado a una gran necesidad de nuevas soluciones para el ensayo de sustancias. Muchos medicamentos que se han retirado del mercado debido a lesiones hepáticas inducidas por medicamentos liberaron su potencial tóxico solo después de varias dosis de pruebas crónicas en humanos. Sin embargo, un microambiente controlado es fundamental para los experimentos de dosificación múltiple a largo plazo, ya que incluso alteraciones menores en las condiciones extracelulares pueden influir en gran medida en la fisiología celular. Nos centramos dentro de nuestro programa de investigación en la generación de un biorreactor de microingeniería, que puede ser perfundido dinámicamente por una bomba en chip y combina al menos dos espacios de cultivo para aplicaciones multiorgánicas. Este sistema circulatorio imita mejor las condiciones in vivo de los cultivos celulares primarios y asegura una transmisión extracelular más estable y cuantificable de señales a las células. 
Para fines de demostración, los equivalentes hepáticos humanos, generados mediante la agregación de células HepaRG diferenciadas con células estrelladas hepáticas humanas en placas colgantes, se cocultivaron con biopsias de punción de piel humana durante un máximo de 28 días dentro del microbiorreactor. El uso de insertos de cultivo celular permite cultivar la piel en una interfaz aire-líquido, lo que permite la exposición a sustancias tópicas. El sistema de microbiorreactor es capaz de soportar estos cocultivos con un flujo de fluido y una relación volumen-líquido casi fisiológicos, lo que garantiza condiciones de cultivo estables y organotípicas. La posibilidad de cultivos a largo plazo permite la exposición repetida a sustancias. Además, una vascularización del circuito de canales microfluídicos utilizando células endoteliales microvasculares dérmicas humanas produce un modelo vascular fisiológicamente más relevante.

Standard in vitro de cultivos de tejidos se realiza bajo condiciones estáticas, lo que limita la difusión del suministro de oxígeno y nutrientes a los tejidos. Sistemas de fluidos, que muestran características mejoradas de abastecimiento, a menudo se ven obstaculizados por sus grandes necesidades de medianas, que tiene no fisiológicamente medio alto a las relaciones de los tejidos. Por lo tanto, los metabolitos se diluyen y las células no son capaces de condicionar sus alrededores. El MOC presentado en este estudio conecta dos compartimientos de cultivo de tejidos separados, cada uno del tamaño de un único pocillo de una placa de 96 pocillos estándar, por un sistema de canales de microfluidos. La pequeña escala del sistema y la integración de la bomba en el chip permite que el sistema funcione a volúmenes de medios de sólo 200 a 800 l. Esto corresponde a un medio sistémico total para la proporción de tejido de 8: 1 a 31: 1, respectivamente, para los co-cultivos de tejidos de hígado y de la piel (que tienen un volumen de tejido total de alrededor de 26 l). El volumen de líquido extracelular total en un hombre que pesa 73 kg es 14,6 L, de la cual el volumen de fluido intercapilar es 5,1 L, dando lugar a un fluido extracelular fisiológica a la relación de tejido de 1: 4. Por lo tanto, la cantidad de medios de comunicación en todo el sistema de circulación en el MOC es aún mayor en comparación con la situación fisiológica; y, sin embargo, representa la media más pequeña proporción de tejido reportado hasta el momento para los sistemas múltiples de órganos 5. Como se retienen industria formatos estándar de cultivo de tejidos, los investigadores son capaces de combinar modelos de tejido estática existentes y ya validados dentro de un flujo de fluido común. La Figura 1 muestra el esquema de un montaje experimental de posibles co-cultivos de tejido único o multi-MOC de tejido. Biopsias de tejidos primarios in vitro -generated y equivalentes de tejido de líneas celulares o células primarias se pueden cultivar ya sea usando 96 pocillos insertos de cultivo celular o colocándolos directamente en los compartimentos de cultivo de tejidos. Como el sistema de canales que interconectan los compartimientos de cultivo celular se encuentra a 100 μm de altura, equivalentes de tejido que excedan estas dimensiones se mantendrá dentro de los compartimentos de la cultura. El endotelialización del circuito MOC con HDMECs primarias permite un paso más hacia condiciones de cultivo más fisiológicas, proporcionando una estructura vascular biológica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1: Representación esquemática. De culturas MOC Los equivalentes de tejido se preparan bajo condiciones estándar in vitro, se inocularon en el MOC y cultivadas como cultivos individuales o cocultivos bajo condiciones dinámicas. Se realizan muestras de medios diarios y análisis de punto final. La presión del aire para accionar la bomba es aplicada a través de los tres tubos azules conectados al MOC desde arriba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52526/52526fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </a&gt; Siguiendo el protocolo endotelización, un confluente HDMEC cobertura del circuito de canal de microfluidos se obtiene dentro de los cuatro días de cultivo dinámico, como se muestra en la Figura 2. Las células se adhieren fácilmente a las paredes del canal MOC, crean una monocapa confluente, y se alargan a lo largo de la cizalla estrés (Figura 2B). Además, las células cubren toda la circunferencia de los canales, como se informó anteriormente 9. No se observó un mayor cambio en la morfología endotelial tras cuatro días de cultivo hasta el final de la cultura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig2.jpg" /> Figura 2:. Endotelizado canales MOC células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC) formaron una monocapa confluente en el circuito de microfluidos. Las células se tiñeron con LDL acetilado después de 23 días de cultivo MOC. (A) Todo el mcircuito icrovascular estaba cubierta con células y las células (B) alargadas a lo largo de la tensión de cizallamiento. Las barras de escala: (A) 1000 micras y (b) 100 micras. En un experimento adicional, en forma de disco esferoides de células hepáticas consistentes se forman a partir HepaRG y HHSteC durante dos días de cultivo gota colgante, como este sistema modelo se había informado anteriormente como adecuados para estudios de metabolismo de fármacos 11-13. Para fines de demostración, un compartimiento de cultivo de tejidos de cada circuito MOC se sembró con 20 esferoides en 96 pozos insertos de cultivo de células y tejidos se cultivaron más de 14 días bajo condiciones dinámicas utilizando MOCs no endotelizado. Cualquier número de agregados o cantidad de material primario se puede integrar ya sea directamente en los compartimentos o el uso de insertos de cultivo celular. Tinción de inmunofluorescencia de los esferoides después de la recuperación de la MOC muestra una expresión fuerte, homogéneo para licitoqueratina ver-típica 8/18 y la fase I enzimas que metabolizan el citocromo P450 3A4 y 7A1 (Figura 3A y 3B). La tinción de la proteína de resistencia a múltiples fármacos transportador canalicular 2 (MRP-2) reveló un fenotipo polarizado y la existencia de redes de canalículos biliares como rudimentario (Figura 3C). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig3.jpg" /> Figura 3 :. El cultivo de hígado artificial micro-tejidos humanos en los agregados. MOC hepáticas cultivadas durante 14 días en el MOC se tiñeron para (A) citoqueratina 8/18 (rojo) y (B) el citocromo P450 3A4 (rojo) y 7A1 (verde). (C) Expresión de transportador canalicular MRP-2 (verde), la tinción nuclear azul. Las barras de escala: 100 m. Como la producción de albúmina es una condición previa esencial de cultivos de tejidos de hígado, tiene abejan seleccionada para supervisar la actividad de hígado de típico en el MOC. El análisis de muestras de medios diarios para la producción de albúmina muestra un aumento significativo en la tasa de producción en cultivos MOC en comparación con cultivos estáticos (Figura 4) y a los valores reportados en la literatura 11. El aumento en la tasa de síntesis de albúmina podría atribuirse a la mayor suministro de oxígeno y nutrientes en cultivos MOC. Por lo tanto, el MOC es capaz de sostener los agregados de hígado más de un periodo de cultivo de 14 días en un estado metabólicamente activo, mejorando el comportamiento típico de hígado, tales como la producción de albúmina. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig4.jpg" /> Figura 4: Catorce días desempeño esferoide hígado en el MOC producción de albúmina de cultivos de tejidos individuales de hígado en el MOC y en la cultura estática.. Los datos son medias ± SEM (n = 4). Repetidas pruebas de toxicidad de dosis subsistémicas del chemicos y cosméticos en animales requiere de 21 a 28 días de exposición, según la definición de la directriz de la OCDE no. 410 &quot;Dosis repetida dérmica aguda: estudio de 21/28 días.&quot; Co-cultivos de piel para el hígado a largo plazo se ejemplifican aquí por hasta 28 días para hacer frente a los requisitos reglamentarios. Se proporciona una interfaz de aire-líquido para exposición posterior sustancia dérmica mediante el cultivo de las biopsias de piel en 96 pocillos insertos de cultivo celular. El experimento de cocultivo se realiza a modo de ejemplo en MOCs endotelizado para probar si un cocultivo de tres tejido en un circuito de los medios de comunicación combinado se puede mantener viable y metabólicamente activa de más de 28 días. Análisis de la actividad de la LDH en los sobrenadantes del medio reveló un nivel constante disminución durante los primeros ocho días de cultivo, que se mantuvo constante en alrededor de 80 U / l después (Figura 5). Esto indica una facturación tejido artificial pero estable en el sistema en momentos posteriores. Comparando el cocultivo de tres tejido para sola hígadoexperimentos de cocultivo -tissue y hepáticas endotelial, un nivel significativamente disminuido LDH se podían encontrar, especialmente durante los primeros días en culturas no incluyendo la piel. La muerte celular dentro de esta primera periodo de alta actividad LDH se produjo principalmente en el compartimiento de cultivo de piel, como cultivos de tejidos MOC sola piel revelaron (datos no mostrados). Esto podría ser debido a la zona que rodea a la herida de biopsia, como resultado de la perforación de la piel. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig5.jpg" /> Figura 5: El rendimiento de los tejidos de quince días en el MOC actividad LDH en los sobrenadantes del medio de cultivos de tejidos solo hígado (MOC Li), cultivos de hígado en MOCs endotelizado (MOC Li-Va) y co-cultivos de hígado-piel en endotelizado MOC (MOC Li. -Va-Sk). Los datos son medias ± SEM (n = 4). Durante el periodo de cultivo de 28 días, esferoides hígado adheridos a la parte inferior de la MOC unand células crecieron, formando una conexión de múltiples capas entre esferoides adyacentes. Esto no es contraria a la funcionalidad de los tejidos. Análisis de punto final por inmunofluorescencia mostró que esferoides hígado eran todavía metabólicamente activo después de 28 días de cocultivo MOC, como se muestra por el citocromo P450 3A4 tinción (Figura 6A). HHSteC se distribuye a través de todo el equivalente hígado, como se muestra por tinción con vimentina (Figura 6B). Un aumento en la intensidad de la tinción vimentina se pudo observar en las áreas donde las células habían crecido a partir de esferoides. La tinción de factor de von Willebrand (vWF) mostraron que las células endoteliales no habían penetrado profundamente en el tejido, pero estaban en contacto directo célula-célula con los hepatocitos exteriores (Figura 6c). Tinción inmunohistoquímica de las biopsias de piel mostró una expresión de tenascina C y colágeno IV en la membrana basal (Figura 6D), mientras que la tinción del control estática mostró elevatniveles ed de tenascina C (Figura 6E). La tenascina C ha demostrado ser upregulated durante la cicatrización de heridas, los procesos inflamatorios y fibrosis, lo que sugiere inducida por los procesos fibróticos en estática, pero no en cultivos dinámicos 14,15. La viabilidad celular estable y funcionalidad de los tejidos después de un cocultivo 28 días en el MOC demostrar que el sistema es capaz de mantener una combinación de hasta tres tejidos en un circuito de los medios de comunicación común. Las células primarias, así como modelos de tejidos y biopsias, pueden ser cultivadas simultáneamente en el sistema de MOC. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig6highres.jpg" width="700" /> Figura 6:. Rendimiento de cultivos de tejidos multi-más de 28 días equivalentes de hígado y biopsias de piel se cultivaron en un MOC y funcionalidad celular endotelializado se demostró mediante inmunotinción de (A) Fase I enzimas del citocromo P4503A4 (rojo), (B) vimentina (rojo), (C) citoqueratina 8/18 (rojo) y vWF (verde) en el tejido hepático. Las biopsias de piel cocultivaron durante 28 días (D) en el MOC o (E) en condiciones estáticas se tiñeron para tenascina c (rojo) y colágeno IV (verde), la tinción nuclear azul. Tinción (F) H &amp; E de la piel después de 28 días de cultivo MOC. Las barras de escala: 100 m.

Aquí, presentamos un protocolo para cocultivar células primarias, modelos de tejido y biopsias en un chip microfluídico multi-órgano durante un máximo de 28 días. Las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas, los agregados hepáticos y las biopsias de piel se combinaron con éxito en una circulación de medios común.

El chip de varios órganos - Una plataforma de microfluidos para el largo plazo co-cultivo de múltiples tejidos

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

the-multi-organ-chip-microfluidic-platform-for-long-term-multi-tissue

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Describimos una plataforma basada en el chip para el cultivo en tres dimensiones de las células de micro-biorreactores. Un chip puede albergar hasta 10 millones de euros. células que pueden ser cultivadas bajo condiciones definidas con precisión en lo que respecta al flujo de fluidos, etc tensión de oxígeno en un asa estéril, cerrado de circulación.

Basada en el chip tridimensional de cultivo celular en perfundido Micro-biorreactores

Presentamos un método para la deposición microfluídica de genipina y fibronectina modeladas en sustratos de PDMS, lo que permite una mayor viabilidad de los tejidos densos de células de músculo liso vascular. Este método de fabricación de tejido se combina con la tecnología previa de película delgada muscular vascular para medir la contractilidad vascular a lo largo de cursos de tiempo relevantes para la enfermedad.

Microfluidic genipina Deposición Técnica de Cultura extendido de micropatterned vasculares musculares Thin Films

Se describe un protocolo in vitro de co-cultivo microbioma intestinal y vellosidades intestinales durante un periodo prolongado utilizando un sistema de microphysiological gut-on-a-chip humano.

Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos

Aquí, presentamos un protocolo que describe la fabricación de elástico, doble canal, órgano chip microfluídico célula cultura dispositivos Recapitulando a nivel órgano funcionalidad in vitro.

Fabricación escalable de elástico, doble canal, Chips microfluídicos órgano

Este informe describe un método microfluídico basado en chips para establecer un experimento de cultivo de una sola célula en el que se puede lograr un emparejamiento de alta eficiencia y un análisis microscópico de varias células individuales.

Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico

La barrera hematoencefálica (BBB) es una unidad neurovascular multicelular que regula estrechamente la homeostasis cerebral. Mediante la combinación de iPSC shumanos y tecnologías de órgano en chip, hemos generado un chip BBB personalizado, adecuado para el modelado de enfermedades y predicciones de penetrabilidad de fármacos del SNC. Se describe un protocolo detallado para la generación y el funcionamiento del chip BBB.

Generación de un chip de barrera hematoencefálica basada en iPSC humana

Presentamos un sistema microfluídico para estudios de alto rendimiento en maquinaria de vida compleja, que consta de 1500 unidades de cultivo, una gama de bombas peristálticas mejoradas y un módulo de mezcla in situ. El chip microfluídico permite el análisis de las condiciones microambientales altamente complejas y dinámicas in vivo.

Generación de condiciones ambientales dinámicas utilizando un dispositivo microfluídico de alto rendimiento

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo tridimensional de piel simplificado e indiferenciado utilizando una plataforma microfluídica micromecanizado. Un enfoque de flujo paralelo permite la deposición in situ de un compartimento dérmico para la siembra de células epiteliales en la parte superior, todo controlado por bombas de jeringa.

Generación de un modelo tridimensional simplificado de piel en un chip en una plataforma microfluídica micromecanizado

Los organoides intestinales derivados de biopsias y las tecnologías de organ-on-a-chips se combinan en una plataforma microfisiológica para recapitular la funcionalidad intestinal específica de la región.

Combinación de organoides humanos y tecnología organ-on-a-chip para modelar la funcionalidad específica de la región intestinal

Nuestro protocolo detallado describe la creación y el uso del modelo avanzado de intestino en chip, que simula la mucosa intestinal humana con estructuras 3D y varios tipos de células, lo que permite un análisis en profundidad de las respuestas inmunitarias y las funciones celulares en respuesta a la colonización microbiana.

Modelo inmunocompetente de intestino en chip para analizar las respuestas inmunitarias de la mucosa intestinal

Aquí, presentamos protocolos que detallan instrucciones para implementar cultivos celulares en 3D utilizando matrices de colágeno y colágeno-agarosa en un sistema microfisiológico. Estos protocolos apoyan el cocultivo de esferoides de túbulo proximal renal y carcinoma de células renales, simulando condiciones in vivo y permitiendo la investigación avanzada de las interacciones de las células de cáncer de riñón.

Cocultivo microfluídico de epitelio renal sano y tumoral para modelar la progresión del cáncer de riñón

Aprende a diseñar y fabricar chips microfluídicos multi-órgano para cultivar células endoteliales, agregados hepáticos y biopsias de piel durante 28 días. Este protocolo facilita el estudio de interacciones celulares complejas.

El chip de varios órganos - Una plataforma de microfluidos para el largo plazo co-cultivo de múltiples tejidos

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