Name: Aislamiento de células tumorales de colon humanos primarios de tejidos quirúrgicos y cultivándolas Directamente en Elastic sustratos blandos de tracción Citometría (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprende a aislar células primarias de tumores de colon humano y cultivarlas en sustratos elásticos blandos. Este método permite analizar las fuerzas de tracción celular mediante citometría de tracción para estudiar la mecánica tumoral.

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Este proyecto fue financiado por la subvención 10-02165 de la Fundación Nacional de Ciencias ECCS, y la subvención 12035 del Programa de Iniciativa de Innovación Interdisciplinaria, Universidad de Illinois. M.Y. A. fue financiado en UIUC por la Alianza del Instituto Nacional del Cáncer para la Nanotecnología en el Cáncer del NIH 'Centro de Capacitación en Nanotecnología del Cáncer del Medio Oeste' Subvención R25 CA154015A. La tinción con inmununona y la microscopía confocal se llevaron a cabo en el Instituto de Biología Genómica (IGB) de la UIUC. M.Y.A. reconoce las discusiones con B. J. Williams de UIUC con respecto a los experimentos de aislamiento. M.Y.A. agradece a C. Nemeh y Abdul Bhuiya de la UIUC por su ayuda en la preparación de la lista de esquemas y materiales.

El protocolo se describe a continuación sigue las directrices de UIUC comité de ética de la investigación humana. 1. Recogida y digestión de Tejidos quirúrgico Muestra <ol><li> Recoger la muestra de tejido del tumor después de la resección de colon derecho (Figura 1A y 1B). Recoger el tejido de un sitio sano adyacente también. </li><li> Transferir el tejido inmediatamente a un vial de 15 ml que contiene 12 ml de solución de HBSS. Conservar el vial en el hielo dentro de una caja de la espuma aislante. </li><li> Transporte el tejido que contiene vial a una campana de cultivo de tejidos para su posterior procesamiento en 45 min. Conservar el vial en un bloque de hielo en el interior de la campana. </li><li> Vierta el tejido suministrado en una placa de 6 pocillos que contiene 6-7 ml de solución de HBSS usando una pipeta. Nota: La cantidad de tejido por pozo no es crítica en esta etapa de aclarado. </li><li> Mantenga la placa de 6 pocillos en un bloque de hielo. Enjuague el tejido en solución HBSS dos veces. </li><li> Cortar el tejido limpiamente en secciones separadas con LIC estérilessor. Tejido Pique en secciones más pequeñas no mayor de 1-2 mm 3 en tamaño, con una hoja de bisturí estéril. </li><li> Pesar un vial tripsina 0,1% marcada (que contiene 1 ml de 0,1% de solución de tripsina) antes de transferir el tejido. Transferencia de ~ 20 mg de tejido en cada uno de los viales de 0,1% de tripsina con una pipeta. </li><li> Trate de minimizar la transferencia de HBSS en el vial tripsina para evitar una mayor dilución de tripsina. </li><li> Pesar los viales de tripsina después de la transferencia de tejidos; documentar la diferencia como la masa de tejido. </li><li> Verter ~ 20 mg de tejido y 1 ml de tripsina en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. </li><li> Ponga la placa de 24 pocillos en un agitador en la nevera a 4 ° C durante 16-20 horas. Durante este período de espera o en un momento anterior, preparar sustratos de gel de poliacrilamida y funcionalizar con proteínas ECM como se describe en la sección 3. </li></ol> 2. La disociación enzimática de la muestra de tejido en suspensión individual de células y el cultivo de células aisladas en el ECM funcionalizado elástico Substrates y platos de poliestireno rígido <ol><li> Después de 16-20 horas de incubación en tripsina bien a 4 ° C en un agitador, transferir tejido de 4 ° C tripsina a 4 ° C vial medio de crecimiento completo (que contiene 2-3 ml de medio de crecimiento completo) usando una pipeta. Asegúrese de transferencia mínima de tripsina en medio de crecimiento. Nota: formulación completa medios de crecimiento es como sigue: RPMI 1640 medio base suplementado con suero de caballo a una concentración final de 10% y penicilina-estreptomicina al 1% de la solución total. </li><li> Coloque el tejido que contiene vial medios de comunicación en un baño de agua caliente a 37 ° C durante 12-15 min. </li><li> Transferir el tejido a un vial de 15 ml que contiene la solución HBSS usando una pipeta, agite suavemente. </li><li> Repita 2.3. </li><li> Retire el tejido de la solución HBSS y traslado al 0,1% solución de colagenasa (en HBSS) vial que contiene 1 ml de solución. Incubar durante 45 minutos a 37 ° C y 5% CO 2 ambiente en una incubadora de cultivo celular humidificado. Durante el período de espera, growt calienteh medios de comunicación en un vial de 15 ml a 37 ° C en baño de agua. </li><li> Saque todos los fragmentos de tejido en minimización pipeta colagenasa arrastre. Expulsar sólo los fragmentos de tejido en viales de medios de cultivo pre-calentado. </li><li> Colocar un filtro bien inserto de 40 micras en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Humedecer el filtro con 1 ml de medio de cultivo celular. </li><li> Se tritura el tejido en los medios de comunicación con una pipeta de vidrio de 10 ml varias veces hasta que el tejido está completamente disociado. </li><li> Mantener la punta de pipeta lo más cerca posible a la base del vial. </li><li> Depositar la solución sobre el filtro para eliminar los residuos y las partes no disociadas. </li><li> Centrifugar la suspensión celular se filtró en los medios de comunicación a 150 xg durante 5 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender después sedimento celular con 2 ml de medio de cultivo fresco. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro (si es necesario). Aislado Seed células primarias en matriz extracelular (ECM) geles funcionalizados y platos de poliestireno en concentración deseada.</li></ol> 3. Preparación y funcionalización de diferentes Rigidez poliacrilamida (PA) Geles y poliestireno Sustratos Nota: Para la demostración visual de la Sección 3, los espectadores / lectores son referidos a un reciente Diario de experimentos visualizados (Jove) del artículo 17. <ol><li> La adopción de los protocolos publicados 18, 19, 12 mm activan 2 cubierta de cristal se desliza químicamente para asegurar la unión del hidrogel covalente. <ol><li> En primer lugar, la cubierta de cristal regalo desliza con 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) durante 7 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Retire el ATS completamente con enjuague de agua DI y tratar cubierta se desliza con 0,5% glutaraldehído (diluido en PBS a partir de solución de glutaraldehído social 70%) solución durante 30 minutos. </li></ol></li><li> Obtener 2 soluciones de gel kPa mediante la mezcla de 5% w solución de acrilamida v / y 0,05% -methylenebisacrylamide solución de (bis) N &#39;en solución salina tamponada con HEPES 10 mM 20 N,. Utilice 8% w / v de acrilamida y 0,13% N, -methylenebisacrylamide solución (bis) N &#39;10 en solución salina tamponada con HEPES mM de gel de 10 kPa 20. <ol><li> En ambos casos, usar 1: 200 persulfato de amonio (10% w / v) y 1: 2.000 N, N, N &#39;, N&#39; -tetrametiletilendiamina (TEMED) como iniciador y catalizador para el proceso de polimerización, respectivamente. </li><li> Además, añadir 100 l perlas fluorescentes a 2 solución de gel kPa como marcadores fiduciarios 21, 22. </li></ol></li><li> Depositar una gota de 20 l de pre-polímero de solución de gel de PA en el 12 mm2 activado hoja de la cubierta de cristal. Coloque otra 12 mm 2 regulares hoja de la cubierta de cristal en la caída. Asegúrese de que la caída de los diferenciales entre los cubreobjetos por capilaridad. Invierta el sándwich para 2 geles kPa para asegurar que la mayoría de las perlas vienen cerca de la superficie de cultivo de células. </li><li> Curar el gel de PA durante 45 min a RT. </li><li> Despegar la hoja de la cubierta superior utilizando una sola máquina de afeitar borde. Nota: Durante el pelado, desprendimiento procede de uno de los bordesdel sándwich. El gel permanece adherida a la lámina de vidrio activado. </li><li> Almacene los geles en solución de PBS antes de su uso. </li><li> Funcionalizar geles y cristal con las moléculas de ECM, la fibronectina humana PA a una concentración de 50 g / ml métodos siguientes publicados 23. <ol><li> En pocas palabras, incubar sustratos con 2 ml puro hidrato de hidrazina O / N. </li><li> Retire hidrato de hidrazina y enjuague los sustratos a fondo con agua DI. </li><li> Lavar los sustratos con ácido acético al 5% durante 30 min. </li><li> Retire ácido acético y enjuague los sustratos a fondo con agua DI. </li><li> Mantenga los sustratos sumergidos en agua DI durante 30 min. </li><li> Incubar los sustratos con fibronectina oxidado durante 35 min a una concentración de 50 mg / ml. </li><li> Enjuague los sustratos con PBS en agitador a bajas rpm durante 10 min. </li><li> Incubar todos los sustratos a 37 ° C en 2-3 ml de medio de cultivo durante 30 minutos antes de la galjanoplastia de las células. Nota: las células de la placa en un poblar escasamented forma (1.000-3.000 células / cm 2). Cada hoja de vidrio gel cubierta necesita ser contenido en un 35 mm placa de Petri. Permitir que las células se adhieran completamente antes de cualquier microscopía (al menos O / N). </li></ol></li></ol> 4. Tracción microscopía de fuerza y ​​de inmunofluorescencia microscopía ensayos <ol><li> Ensayo de Tracción Microscopía de Fuerza <ol><li> Cálido tripsina-EDTA / solución de 0.25% 10% SDS a 37 ° C en un baño de agua durante 10 minutos antes de comenzar los experimentos de tracción. </li><li> Retire un gel de la incubadora de cultivo celular a la vez y colocar en la platina del microscopio fluorescente invertido (magnificación 32X). </li><li> Encuentra una sola célula en el campo de visión. Retire la tapa del plato de Petri. </li><li> Tome una imagen de contraste de fase de la célula (por ejemplo, la Figura 3). </li><li> Cambie el modo de imágenes de fluorescencia y seleccione el filtro apropiado. No mueva la platina del microscopio o de la muestra durante este tiempo. </li><li> Tome una imagen del displac perlas fluorescentescado por la tracción celular (Figura 4C). </li><li> Añadir 1 ml de tripsina / solución de SDS al plato de Petri para separar la célula de gel. No mueva la platina del microscopio o de la muestra durante este tiempo. Además, tomar una imagen de control de la célula para asegurar la eliminación completa de gel. </li><li> Tome una imagen de referencia (fuerza null) de las perlas después se retira de la célula. </li><li> Repita los pasos 4.1.2-4.1.8 para el resto de geles. </li><li> Hacer una pila de imágenes usando ImageJ de las dos imágenes obtenidas en el paso 4.1.6 y 4.1.8 para cada caso. Para generar la pila de imagen, utilice siguiente secuencia de comandos en ImageJ después de abrir las imágenes: Imagen → Pilas → Imágenes para apilar. </li><li> Para obtener el campo de desplazamiento y tracción, usar plugins ImageJ siguientes métodos publicados 21, 22 Obtener los códigos y tutoriales detallados para estos plugins utilizando el siguiente enlace:. <a href="https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins">https://sites.google.com/site/qingzongtseng/ima</a>gejplugins. <ol><li> Alinear las imágenes de la pila utilizando el plugin &#39;Matching plantilla&#39;. Uso siguiente secuencia de comandos en ImageJ después de abrir la pila imagen generada en el paso 4.1.10: Plugins → Matching Plantilla → Alinear Rebanadas de Pila → Aceptar. Guarde la pila de imágenes en consecuencia. Use esta nueva pila de imágenes en los siguientes pasos. </li><li> Obtenga el campo de desplazamiento mediante el PIV (partícula imagen velocimetría) plugin (Figura 4D). Uso siguiente secuencia de comandos después de abrir la pila imagen guardada en el paso 4.1.11.1: Plugins → → PIV iterativo PIV (Básico) → Aceptar → Aceptar este PIV y la salida → Ok. Guarde la salida de PIV en el mismo directorio que en la pila imagen original. Use esto como entrada en el siguiente paso. </li><li> Por último, el uso de FTTC (transformada de Fourier de tracción citometría) plugin para obtener el mapa de tracción (Figura 4E). Uso siguiente secuencia de comandos: Plugins → → FTTC Inspropiedades de los materiales ert, es decir, el módulo de Young y la relación entre PA gel → Aceptar → de Poisson Seleccione el archivo de salida PIV guardado en el paso 4.1.11.2 → Aceptar. Guardar FTTC resulta en el mismo directorio que en la pila de imagen y salida de PIV. </li></ol></li></ol></li><li> Inmunofluorescencia microscopía ensayos <ol><li> Tomar los sustratos a inmunotinción a la campana laminar y eliminar los medios de cultivo. </li><li> Enjuagar los sustratos con PBS y fijar las células con paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 min a TA. </li><li> Lavar los sustratos con PBS durante 3 veces (5 min cada vez). En consecuencia, se incuban los sustratos con potenciador de señal de 500 l durante 30 minutos y enjuagar con PBS. </li><li> Se incuban las células con anticuerpo monoclonal anti-vinculina en una dilución 1: 250 en PBS durante 45 min a TA. Lavar los sustratos con PBS durante 3 veces (5 min cada vez). </li><li> Incubar las muestras con anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 de IgG de cabra anti-ratón en una dilución 1: 200en PBS a temperatura ambiente durante 30 min. Lavar los sustratos con PBS durante 3 veces (5 min cada vez). </li><li> Para visualizar la estructura F-actina, incubar las células con TRITC faloidina conjugados a una concentración 50 mg / ml durante 45 min a RT. Lavar los sustratos con PBS durante 3 veces (5 min cada vez). </li><li> Imagen de las muestras mediante microscopio láser confocal de barrido (Figura 5A - 5D). </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

La tensión de tracción celular ha surgido recientemente como un potencial indicador biofísico del estado metastásico 13. Sin embargo, no existen datos tracción experimental con células tumorales primarias en la literatura hasta la fecha. Además, el cultivo de las células del colon directamente aislados primaria en diferentes geles de poliacrilamida rigidez no se informa todavía. Por lo tanto, establecemos un colon primaria optimizadas las condiciones de cultivo de células en geles y poliestireno (Figu...

En los últimos años se ha convertido en cada vez más evidente que mecánica micro-entorno, además de los factores bio-químicas, juega un papel importante en la regulación de las funciones celulares. Las células pueden detectar y responder a la rigidez sustrato sobre el que se adhieren a (como en la cultura 2D) o rodeados por (como en cultivo 3D) 3-7. Al hacerlo, las células pueden modular su diferenciación 3, 4 morfología, migración / motilidad 5, las propiedades biofísicas 6, 7 crecimiento, y otros procesos. Las células cancerosas también responden a la rigidez de la matriz 2D y 3D utilizando una coordinada, combinación jerárquica mecano-químico de los receptores de adhesión y proteínas de la membrana de transducción de señales asociadas, la arquitectura citoesquelética, y motores moleculares 1, 2. Por ejemplo, las células epiteliales mamarias (MECs) formar parénquima normal acinar cuando se cultiva en sustratos 150 Pa que es similar a la rigidezde tejido mamario sano. Curiosamente, exhiben las características de un tumor en desarrollo, tanto estructurales como la transcripción, cuando se cultivan en sustratos rígidos (&gt; 5000 Pa) que imitan la rigidez de un estroma tumoral 8. Además, otro experimento muestra que la tumorigénesis de mama se acompaña de reticulación de colágeno y ECM de refuerzo 9. Experimentos recientes muestran que (HCT-8) células de carcinoma de colon humano muestran metástasis como fenotipo (MLP) cuando se cultivan en sustratos 2D tienen rigidez fisiológicamente relevante (20-47 kPa), pero no en muy rígido (3.6 GPa) sustratos 10- 12 .Estos células primero forman grupos de células tumorales y luego se disocian el uno del otro, a partir de la periferia. Como este epitelial a redondeadas morfológica (E a ​​R transición) se produce el cambio, proliferan, reducir célula-célula y célula-ECM adherencia, y convertirse migratoria. HCT-8 células cultivadas sobre sustratos de poliestireno muy duras, que no presentan estosrasgos malignos. Así, se ha planteado la hipótesis de que HCT-8 células se vuelven metastásico debido a su exposición a las micro-entorno adecuado. Vale la pena señalar que estos experimentos se llevan a cabo con las líneas celulares de cáncer inmortalizadas o células primarias de murino derivado, no con células cancerosas humanas primarias. Un estudio reciente propone que la tensión de tracción celular aumentada se puede utilizar como un potencial biofísico firma para las células metastásicas 13 .El estudio implica la medición de la fuerza de tracción para diferentes líneas celulares de cáncer humano en geles de poliacrilamida. Se encuentra que las células cancerosas metastásicas pueden ejercer significativamente mayor esfuerzo de tracción en comparación con las células no metastásicas en todos los casos 13. Sin embargo, estos resultados contradicen directamente los resultados publicados anteriormente en murino líneas celulares derivadas de cáncer de mama 14. Además, un estudio reciente pone de manifiesto diferencias notables entre las células humanas inmortalizadas y primaria en su pro remodelación del citoesqueletoperfiles de proteína y la supervivencia celular expresión de la proteína 15. Por lo tanto, es importante volver a visitar muchos de los ensayos biofísicos incluyendo tracción para las células cancerosas humanas primarias. Esto se abordará la cuestión de si las células primarias recapitulan inmortalizada líneas celulares de cáncer tendencia tracción. El protocolo descrito aquí está optimizado para el aislamiento de células primarias humanas de colon (tanto sanas y cancerosas), y para el cultivo de ellos en sustratos blandos (hidrogeles de poliacrilamida), así como en placas de Petri. El protocolo se basa en la digestión y la consiguiente disociación enzimática de muestra de tejido quirúrgico en suspensión de células individuales 16. Para nuestro conocimiento, esta es la primera demostración de cultivo aislado tumor de colon primario y las células normales directamente sobre sustratos de hidrogel blandas con microperlas fluorescentes embebidos para citometría de tracción. Sustratos gel transparente también permiten inmunotinción. Este ensayo reveló diferencias en la organización F-actina yadherencias focales en las células del colon humanas primarias como cambios de rigidez del sustrato. Esta plataforma de cultivo celular se abre la posibilidad de explorar diversas propiedades biofísicas de células humanas primarias tales como rigidez celular y la tracción como parámetros para pronósticos de cáncer.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Worthington</td><td>LS003736</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>3- Aminopropiltrymetoxisilano (ATS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>01201-5</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>N-metilenebisacrilamida (bis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina humana</td><td>BD biociencias</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de hidracina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18412</td><td></td></tr><tr><td>Peligroso Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído&nbsp;</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>RT15710</td><td></td></tr><tr><td>Potenciador de señales</td><td>Life technologies</td><td>I36933</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti vinculina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>TRITC conjugados de faloidina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>0.1 y micro; m perlas fluroscentes</td><td>Life technologies</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA</td><td>Life technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiales</td></tr><tr><td>12 mm2 2 cubreobjetos de vidrio</td><td>Corning</td><td>2865-12</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células tumorales de colon humanos primarios de tejidos quirúrgicos y cultivándolas directamente en elastic sustratos blandos de tracción citometría

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Las células cancerosas responden a matriz de rigidez mecánica de una manera compleja usando un sistema coordinado, jerárquica mecano-químico compuesto de receptores de adhesión y proteínas de la membrana de transducción de señales asociadas, la arquitectura citoesquelética, y motores moleculares 1, 2. Mecanosensibilidad de las diferentes células cancerosas in vitro son investigado principalmente con las líneas celulares inmortalizadas o células primarias de murino derivado, no con células cancerosas humanas primarias. Por lo tanto, se sabe poco acerca de la mecanosensibilidad de células de cáncer de colon humanas primarias in vitro. Aquí, un protocolo optimizado se desarrolla que describe el aislamiento de las células del colon humanos primarios a partir de muestras de tejidos humanos quirúrgicos sanos y cancerosos. Las células del colon aislados son entonces cultivadas con éxito en sustratos funcionalizados por una matriz extracelular blando (2 kPa rigidez) y rígido (10 kPa rigidez) hidrogeles de poliacrilamida y poliestireno rígido (~ 3,6 GPa rigidez) (fibronectinaen este caso). Microperlas fluorescentes están incrustados en geles suaves cerca de la superficie de cultivo de células, y el ensayo de tracción se lleva a cabo para evaluar las tensiones contráctiles celulares utilizando software de acceso libre y gratuito. Además, la microscopía de inmunofluorescencia en diferentes sustratos de rigidez proporciona información útil sobre la morfología celular primaria, la organización del citoesqueleto y vinculina que contiene adhesiones focales como una función de la rigidez del sustrato.

El protocolo descrito anteriormente se emplea con éxito para múltiples muestras de tejido (n = 12) de cuatro pacientes diferentes según las directrices de la junta de revisión institucional. La figura 1A ilustra un tumor colorrectal representante de la derecha después de la cirugía de la que se obtienen los cortes de tejido para cultivos celulares. Una sección de tejido típico en solución HBSS después de la transferencia a la campana laminar para su posterior procesamiento se muestra en la Figur...

Se describe un protocolo para extraer células humanas primarias de un tumor de colon quirúrgico y tejidos normales. A continuación, las células aisladas se cultivan en sustratos elásticos blandos (hidrogeles de poliacrilamida) funcionalizados por una proteína de la matriz extracelular e incrustados con microesferas fluorescentes. La citometría de tracción se realiza para evaluar las tensiones contráctiles celulares.

Aislamiento de células tumorales de colon humanos primarios de tejidos quirúrgicos y cultivándolas Directamente en Elastic sustratos blandos de tracción Citometría

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar células primarias de tumores colorrectales humanos quirúrgicos, así como de tejido normal, y cultivarlas directamente sobre sustratos con diferente elasticidad para su análisis. Esto se logra primero recolectando tejido quirúrgico de un tumor de colon humano y de una región normal. A continuación, la disociación enzimática del tejido troceado da como resultado numerosas células individuales.El paso final consiste en cultivar las células aisladas sobre geles de hidrogel de poliacrilamida blanda embebidos con microesferas fluorescentes a nanoescala y sobre placas de poliestireno. Finalmente, se realiza la citometría de tracción para obtener un mapa espacial de la tracción celular, y se lleva a cabo microscopía de inmunofluorescencia para visualizar la organización del citoesqueleto. La ventaja principal de esta técnica es que las células primarias humanas del colon aisladas a partir de tejidos quirúrgicos pueden cultivarse directamente sobre sustratos con distinta rigidez para ensayos de citometría de tracción y microscopía de inmunofluorescencia.Este método puede ayudarnos a responder la pregunta de si la contractilidad de las células tumorales primarias puede utilizarse como un marcador potencial para el pronóstico del cáncer. Para comenzar, recolecte la muestra de tejido tumoral tal como se describe en el protocolo escrito. Luego, vierta el tejido en una placa de seis pocillos que contenga de seis a siete mililitros de solución salina equilibrada de Hank o HBSS utilizando una pipeta.Mantenga la placa de seis pocillos sobre un bloque de hielo y enjuague el tejido dos veces con solución HBSS. A continuación, corte limpiamente el tejido en secciones separadas con tijeras estériles. Pique el tejido en secciones más pequeñas, de no más de uno a dos milímetros cúbicos de tamaño, utilizando una hoja de bisturí estéril.Pese un vial etiquetado con solución de tripsina al 0,1 % que contenga un mililitro antes de transferir el tejido. Luego, transfiera aproximadamente 20 miligramos de tejido a cada uno de los viales con tripsina mediante una pipeta. Pese los viales después de la transferencia del tejido y registre la diferencia como la masa del tejido.Ahora vierta aproximadamente 20 miligramos de tejido y un mililitro de tripsina en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Coloque la placa de 24 pocillos en un agitador a cuatro grados Celsius durante 16 a 20 horas. Después de 16 a 20 horas de incubación en la tripsina, utilice una pipeta para transferir el tejido a dos o tres mililitros de medio de crecimiento completo a cuatro grados Celsius.Coloque el vial en un baño de agua tibia a 37 grados Celsius durante 12 a 15 minutos. A continuación, transfiera el tejido a un vial de 15 mililitros que contenga solución HBSS. Utilizando una pipeta, agite suavemente y repita este paso una segunda vez.Luego, retire el tejido de la solución de HBSS y transfiéralo a un vial que contenga un mililitro de solución de 0,1 % de colagenasa. Incube durante 45 minutos a 37 grados Celsius y en un ambiente de 5 % de dióxido de carbono en un incubador de cultivo celular humedecido. Durante el período de incubación, caliente el medio de crecimiento en viales de 15 mililitros a 37 grados Celsius. A continuación, aspire todos los fragmentos de tejido hacia la punta de una pipeta, minimizando la colagenasa, y expulse únicamente los fragmentos de tejido al cultivo precalentado.Viales de medio. A continuación, coloque un filtro de 40 micrones en cada pocillo de una placa de seis pocillos y humedezca el filtro con un mililitro de medio de cultivo celular.Volver a resuspender el tejido en medio con una pipeta de vidrio de 10 mililitros varias veces hasta que el tejido esté completamente disociado. Mantener la punta de la pipeta lo más cerca posible de la base del vial. Luego, depositar la solución sobre el filtro para eliminar los restos y las partes no asociadas.Centrifugue la suspensión celular filtrada en medio a 150 veces G durante cinco minutos. A temperatura ambiente, retire el sobrenadante posteriormente y resuspenda el botón celular con dos mililitros de medio de cultivo fresco. Siembre las células primarias aisladas en geles funcionalizados con matriz extracelular o ECM, o en placas de poliestireno, a la concentración deseada.Para realizar el ensayo de microscopía de fuerza de tracción, primero caliente la solución de trips 0,25 % en EDTA 10 % SDS a 37 grados Celsius en un baño de agua durante 10 minutos. Antes de los experimentos de tracción, comience por retirar un gel a la vez del incubador de cultivo celular y colóquelo sobre la platina del microscopio. Después de localizar una sola célula en el campo de visión, retire la tapa de la placa de Petri y tome una imagen de contraste de fase de la célula.A continuación, cambie el modo de imagen a fluorescencia y seleccione el filtro adecuado. No mueva la platina del microscopio ni la muestra durante este tiempo. Luego, tome una imagen de las microesferas fluorescentes desplazadas por la tracción celular.Ahora agregue un mililitro de solución de SDS tripsina a la placa de Petri para desprender la célula del gel. Tome una imagen de referencia de las perlas. Después de eliminar la célula, lleve los sustratos que se inmunotincionarán a la cabina de flujo laminar y elimine el medio de cultivo. Luego enjuague los sustratos con solución salina tamponada con fosfato o PBS y fije las células con paraformaldehído al 4 % en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave los sustratos con PBS durante cinco minutos, un total de tres veces.Luego, incubar los sustratos con 500 microlitros de potenciador de señal durante 30 minutos antes de enjuagar con PBS. A continuación, incubar las células con anticuerpo monoclonal anti vanolin a una dilución de uno a 250 en PBS durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después, lavar los sustratos con PBS durante cinco minutos, un total de tres veces.Incube las muestras con un anticuerpo secundario LOR 4 88 de cabra anti ratón IgG en una dilución de uno a 200 en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, lave los sustratos nuevamente con PBS durante cinco minutos, un total de tres veces. Para visualizar la estructura de f actina, incube las células con conjugados de tetraetil rodamina Fín a una concentración de 50 microlitros por mililitro durante 45 minutos a temperatura ambiente.Luego, lave nuevamente los sustratos como antes. Finalmente, proceda a obtener imágenes de las muestras utilizando un microscopio confocal de barrido con láser. Las micrografías de contraste de fase ilustran la morfología representativa de células primarias de cáncer de colon humano y células normales. En función de la rigidez del sustrato, es evidente que las células primarias de colon se expanden más en placas de poliestireno en comparación con los geles de poliacrilamida.Los ensayos de tracción se realizan sobre geles blandos de dos kilopascales recubiertos con matriz extracelular, tras confirmar el adenocarcinoma invasivo mediante tinción histopatológica con hematoxilina y eosina. Aquí se muestra una instantánea de las microesferas fluorescentes a escala nanométrica embebidas dentro del gel, a partir de las imágenes de microesferas desplazadas y de referencia. Los campos de desplazamiento se obtienen utilizando el complemento de simetría por imágenes de partículas de ImageJ.Se muestra un campo representativo de desplazamiento de perlas generado por células tumorales invasivas del colon sobre un gel de dos kilopascales, junto con la tensión de tracción obtenida. Utilizando el complemento de citometría de tracción por transformada de Fourier de ImageJ correspondiente al campo de desplazamiento. Aquí se muestran el citoesqueleto de actina F y las adhesiones focales que contienen cullina en células primarias humanas del colon sobre geles blandos de dos kilopascales y sustratos rígidos de poliestireno.No había ninguna fibra de actina presente en las células menos extendidas sobre geles blandos. Asimismo, están presentes adhesiones focales puntuales que contienen cullina en geles blandos. Por el contrario, las células primarias muestran una morfología bien extendida, actina bien definida y fibras de estrés, así como adhesiones focales discretas y alargadas sobre sustratos rígidos de poliestireno.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la medición de la rigidez celular mediante microscopía de fuerza atómica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células del colon a partir de tejido quirúrgico mediante disociación geomática in situ y, posteriormente, cultivarlas directamente sobre hidrogeles de poliacrilamida para evaluar la contractilidad celular.

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Investigación

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Bioingeniería

Este video describe el ensayo de microscopía de fuerza de tracción. El ensayo determina la tracción celular de las células de cáncer de colon humano en la matriz extracelular presente en un hidrogel elástico suave que tiene perlas fluorescentes incrustadas. El desplazamiento resultante de las perlas fluorescentes se mide utilizando un software adecuado.

Ensayo de citometría de tracción: un método para cuantificar la fuerza de tracción ejercida por las células cancerosas en la MEC

Este video describe la técnica de estudiar el citoesqueleto y las adherencias focales en células primarias de cáncer de colon humano para comprender sus variaciones dependiendo de la rigidez del sustrato. Este cultivo de células cancerosas sobre sustratos blandos y duros permite realizar diversas mediciones biofísicas posteriores para el pronóstico del cáncer.

Ensayo de organización de citoesqueleto y adhesión focal: un método basado en inmunofluorescencia para estudiar la adhesión celular y la diseminación en sustratos

Un método simple para establecer organoide del tumor de colon murino primaria se describe. Este método utiliza la característica de que las células de tumor de colon sobrevivir y crecer en organoides en medios que contienen factores de crecimiento limitadas, mientras que el colon normal epiteliales no lo hacen.

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El miofibroblastos es una célula estromal influyente del tracto gastrointestinal que regula importantes procesos fisiológicos en los estados tanto normales y de enfermedad. Se describe una técnica que permite el aislamiento de miofibroblastos primarios de ratón y tejido de colon humano, que puede ser utilizado para la experimentación in vitro.

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Describimos el establecimiento de tumores colorrectales ortotópicos mediante la inyección de células tumorales o organoides en el ciego de ratones y el subsiguiente aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) de este modelo.

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El siguiente protocolo se centra en el establecimiento de un cultivo primario de sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente (STS). Este modelo podría ayudarnos a entender mejor el fondo molecular y perfil farmacológico de estos raros tumores malignos y podría representar un punto de partida para futuras investigaciones destinadas a mejorar la gestión de STS.

Establecimiento de un cultivo primario de Sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente

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Aislamiento de células endoteliales humanas de Colon Normal y el Carcinoma colorrectal - un protocolo mejorado

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Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

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Establecimiento de un sistema de cocultivo de organoides tumorales colorrectales derivados de pacientes y linfocitos infiltrantes de tumores (TIL)

Aprende a aislar células primarias de tumores de colon humano y cultivarlas en sustratos elásticos blandos. Este método permite analizar las fuerzas de tracción celular mediante citometría de tracción para estudiar la mecánica tumoral.

Aislamiento de células tumorales de colon humanos primarios de tejidos quirúrgicos y cultivándolas Directamente en Elastic sustratos blandos de tracción Citometría (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de células tumorales de colon humanos primarios de tejidos quirúrgicos y cultivándolas Directamente en Elastic sustratos blandos de tracción Citometría

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