Name: Instantánea de todo el genoma de los Reguladores de la cromatina y los Estados en Xenopus Los embriones por chip-Sec (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprende el método ChIP-Seq para mapear reguladores de cromatina en embriones de Xenopus. Esta técnica permite analizar la arquitectura del genoma y comprender la regulación génica durante el desarrollo embrionario temprano.

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Agradecemos a Chris Benner por implementar el genoma de X. tropicalis (xenTro2, xenTro2r) en HOMER y al laboratorio de Gilchrist por las discusiones sobre el análisis posterior a la secuenciación. I.P. ayudó en el análisis de términos GO. G.E.G. y J.C.S. fueron apoyados por el Wellcome Trust y ahora son apoyados por el Consejo de Investigación Médica (programa número U117597140).

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Nuestro protocolo describe cómo realizar y analizar los perfiles de la cromatina en todo el genoma a partir de embriones de Xenopus. Cubre cada paso de las proteínas de reticulación a loci endógenos in vivo para procesar millones de lecturas que representa sitios genómicas enriquecidas en silico. Dado el creciente número de borradores del genoma están disponibles, este protocolo debe ser aplicable a otros organismos modelo y no modelo. La sección experimental más importante, lo que diferencia a este protocolo aparte del trabajo previo 8,31,33,34, es el procedimiento posterior a la fijación para extraer núcleos reticulados. Se facilita la solubilización de la cromatina eficiente y de cizallamiento y fácil ampliación de la escala. Junto con la mejora de la eficiencia de la preparación de la biblioteca este protocolo permite la construcción de bibliotecas-chip Sec de alta complejidad de la mitad a dos millones de células que expresan el epítopo asociada a la cromatina de interés. Para los experimentos chip-qPCR, algunos diez mil de estas células son normalmente suficientepara comprobar para el enriquecimiento de ADN en unos seis loci genómicos diferentes. Estos números son estimaciones conservadoras, pero puede variar dependiendo del nivel de expresión de la proteína, la calidad del anticuerpo, la eficiencia, y la accesibilidad epítopo de reticulación. Como una guía, un solo embrión de Xenopus contiene alrededor de 4.000 células en la etapa de mediados de blástula (8,5 después de Nieuwkoop y Faber 29), 40.000 células en la última etapa de gástrula (12) y 100.000 células en la fase tailbud temprana (20). La hora exacta de fijación para la inmunoprecipitación eficaz necesita ser determinado empíricamente por chip-qPCR (sección 10). En general, se requieren tiempos de fijación más largos si el experimento implica X. laevis embriones, primeras etapas de desarrollo, y propiedades de unión de ADN débiles (o indirectos). Sin embargo, no se recomienda la fijación de Xenopus embriones de más de 40 minutos, o el procesamiento de más embriones que los indicados (sección 3), cuya esquila cromatina se vuelve menos eficiente. Es importante noutilizar cualquier glicina después de la fijación ya que este paso común para saciar el formaldehído puede hacer extracción nuclear a partir de embriones de yema rica muy difíciles. Actualmente, no se conoce la razón de esto. Es concebible que el aducto de formaldehído glicina reacciona adicionalmente con grupos amino o residuos de arginina 35 N-terminal. El anticuerpo es clave para cualquier experimento de chip y controles suficientes necesita ser llevado a cabo para mostrar su especificidad para el epítopo de interés (ver directrices por Landt et al. 36). Si ningún anticuerpo chip-grado se encuentra disponible, la introducción de proteínas de fusión etiquetadas con epítopo correspondiente puede ser una alternativa legítima como estas proteínas pueden ocupar sitios de unión 37 endógeno. En este caso, los embriones no inyectados son los mejores para usar como un control negativo en lugar de un chip con suero no específico. Esta estrategia también se puede aplicar si la proteína de interés se expresa en niveles bajos resultantes en el pobre recuperación de enriADN ched. Como para la fabricación de bibliotecas-Chip SEQ, debido a la baja cantidad de ADN en uso, se recomienda optar por los procedimientos que reducen el número de pasos de limpieza y para reacciones combinan para mantener cualquier pérdida de ADN en un mínimo. Los adaptadores y cebadores tienen que ser compatibles con la secuenciación multiplex y la plataforma de NGS (véase la Tabla de Materiales Específicos / Equipo). Si se utiliza adaptadores Y (que contiene los brazos de una sola hebra de largo), es crítico para pre-amplificar la biblioteca con tres a cinco rondas de PCR antes de insertos de ADN de tamaño-seleccionar (por ejemplo., De 100 a 300 pb) mediante electroforesis en gel. Extremos de cadena simple causan fragmentos de ADN que migran de forma heterogénea. Trial se ejecuta con diferentes cantidades de ADN de entrada (por ejemplo, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 y 20 ng) se recomienda para determinar el número total de ciclos de PCR (menos de o igual a 18 ciclos) requerida para hacer un tamaño -seleccionado biblioteca de 100 a 200 ng. La reducción del número de ciclos de PCR hace que la secuenciación de redulee menos probable ndant. En fase sólida perlas de inmovilización reversibles son buena limpieza de reactivos para recuperar de manera eficiente el ADN de interés y fiable extraer cualquier adaptador y dímeros libres de la ligadura y reacciones de PCR. En términos de número, tipo y duración de la lee, alrededor de 20 y 30 millones de fin de lecturas simples de 36 pb es suficiente para la mayoría de los experimentos-chip Sec para cubrir todo el genoma Xenopus con la profundidad suficiente. Las máquinas NGS más prevalentes son rutinariamente capaz de satisfacer estos criterios. Sin embargo, puede ser beneficioso para aumentar el número de lecturas, si se espera que un amplias distribuciones de lee, como se observa con las modificaciones de histonas, en lugar de picos agudos. Para muchos experimentos-chip Sec, 4-5 bibliotecas diferente indexados se unen y se secuenciaron en el carril celular uno de flujo usando una máquina de NGS alto rendimiento. A veces también es aconsejable extender la longitud de lectura y la secuencia de los dos extremos de la plantilla de ADN (de extremo emparejado) para aumentar mapeabilidad wanalizar gallina cromatina dentro de las regiones genómicas repetitivas. Este protocolo se ha aplicado con éxito a una amplia variedad de características de la cromatina, tales como factores de transcripción, mediadores de señalización y las modificaciones de histonas post-traduccionales. Sin embargo, los embriones adquieren un creciente grado de heterogeneidad celular a medida que desarrollan y los perfiles de la cromatina se vuelven más difíciles de interpretar. Pasos prometedores se han hecho en Arabidopsis y Drosophila a los paisajes de la cromatina perfil específicamente mediante la extracción de tejido de tipo específico núcleos celulares 38,39. Nuestro protocolo incluye una etapa de extracción nuclear, que podría allanar el camino para que los tejidos específicos de chip-Sec en otros embriones.

Los primeros intentos de caracterizar las interacciones proteína-ADN in vivo se informaron hace unos 30 años en un esfuerzo por comprender la transcripción génica mediada por ARN polimerasa en bacterias y en la mosca de la fruta1,2. Desde entonces, el uso de la inmunoprecipitación para enriquecer las características distintivas de la cromatina (ChIP) ha sido ampliamente adoptado para capturar eventos de unión y estados de cromatina con alta eficiencia3. Posteriormente, con la aparición de potentes tecnologías de microarrays, este método condujo a la caracterización de paisajes de cromatina de todo el genoma4. Más recientemente, el perfil de cromatina se ha vuelto aún más completo y de alta resolución, ya que millones de plantillas de ADN coinmunoprecipitadas ahora se pueden secuenciar en paralelo y mapear en el genoma (ChIP-Seq)5. A medida que se dispone de un número cada vez mayor de ensamblajes de genomas, ChIP-Seq es un enfoque atractivo para aprender más sobre la regulación del genoma que subyace a los procesos biológicos. 
Aquí proporcionamos un protocolo para realizar ChIP-Seq en embriones ricos en yema como los de la rana Xenopus. El Consorcio Internacional del Genoma de Xenopus 6 ha publicado borradores de los genomas de las dos especies de Xenopus ampliamente utilizadas, X. tropicalis y X. laevis. Los embriones de las especies de Xenopus comparten muchas características deseables que facilitan y permiten la interpretación de los estudios de cromatina de todo el genoma, incluida la producción de un gran número de embriones de alta calidad, el gran tamaño de los propios embriones y su desarrollo externo. Además, los embriones son susceptibles a manipulaciones clásicas y novedosas como el rastreo de linajes celulares, la hibridación in situ de montaje completo, la sobreexpresión de ARN y la tecnología de knockout mediada por TALEN/CRISPR.
El siguiente protocolo se basa en el trabajo de Lee et al., Blythe et al. y Gentsch et al. 7-9. Brevemente, los embriones de Xenopus se fijan con formaldehído en la etapa de desarrollo de interés para unirse covalentemente (entrecruzarse) proteínas a su ADN genómico asociado. Después de la extracción nuclear, la cromatina reticulada se fragmenta para centrar la secuenciación posterior en sitios específicos de unión o modificación genómica, y para minimizar las contribuciones de las secuencias de ADN flanqueantes. Posteriormente, los fragmentos de cromatina se inmunoprecipitan con un anticuerpo de grado ChIP para enriquecer los que contienen la proteína de interés. El ADN coinmunoprecipitado se extrae de la proteína y se purifica antes de crear una biblioteca indexada (de extremo emparejado) para la secuenciación de próxima generación (NGS). Al final, se ofrecen líneas de comandos sencillas para el análisis posterior a la secuenciación de los datos de ChIP-Seq.

<table><tbody><tr><td>Micropunta cónica de 1/16 de pulgada</td><td>Qsonica</td><td>4417</td><td>Esta micropunta es compatible con Sonicator 3000 de Misonix y Q500/700 de Qsonica.</td></tr><tr><td>Frasco de muestra de vidrio de 8 ml con tapón</td><td>Wheaton</td><td>224884</td><td>viales de muestra de vidrio transparente de 8 ml para muestras acuosas con tapones de rosca revestidos de caucho fenólico de tamaño 15-425.</td></tr><tr><td>Adaptador</td><td>, p. ej., adaptador universal IDT o Sigma</td><td>NA</td><td>TruSeq, 
AATGATACGGCGACCACCGAG 
ATCTACACTCTTTCCCTACAC 
GACGCTCTTCCGATC*T. Adaptador indexado TruSeq, 
P-GATCGGAAGAGCACACGTC 
TGAACTCCAGTCAC &#8208; NNNNNN&#8208; 
ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, grupo fosforotioato bondfosfato en 5' fin. NNNNNN, índice (consulte la Guía de preparación de muestras TruSeq ChIP para la secuencia de ADN). Pida adaptadores purificados por HPLC. Los adaptadores se pueden preparar combinando cantidades equimolares (cada 100 &#181; M) del adaptador universal y del adaptador indexado y enfriarlos lentamente desde 95 &#176; C a temperatura ambiente. Utilice 1,5 pmol por ng de ADN de entrada. Almacenar a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>b2g4pipe (software)</td><td>Blast2GO</td><td>no comercial</td><td>http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip</td></tr><tr><td>BLAST+ (software)</td><td>Camacho et al.</td><td>no comercial</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&amp; DOC_TYPE=Descargar</td></tr><tr><td>Bowtie (software)</td><td>Langmead et al.</td><td>no comercial</td><td></td></tr><tr><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml cisFinder (software)</td><td>Sharov et al.</td><td>no comercial</td><td>http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/</td></tr> <tr><td>Chip para electroforesis capilar</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td>Cargue este chip con 1 &micro; l ADN para el control de calidad de la biblioteca. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis capilar basado en chip</td><td>Agilent Technologies G2940CA</td><td></td><td>El Agilent 2100 BioAnalyzer se utiliza para comprobar la calidad de las bibliotecas ChIP-Seq. Mantenga los reactivos a 4 °C.</td></tr><tr><td>Kit de preparación de la biblioteca ChIP-Seq (KAPA Hyper Prep Kit)</td>El kit <td>KK8504</td> de <td>Kapa Biosystems</td><td>contiene mezcla de enzimas de reparación de extremos y relaves A, tampón de reparación de extremos y de relaves A, ligasa de ADN, tampón de ligadura, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) y mezcla de cebadores de amplificación de bibliotecas KAPA (10X) (consulte también cebadores de PCR). Los adaptadores no están incluidos. Almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Kit de preparación de la biblioteca ChIP-Seq (alternativo, kit de preparación ThruPLEX-FD)</td>El kit <td>R40048</td> <td>de Rubicon Genomics</td><td>utiliza sus propios adaptadores y cebadores de bucle de tallo. Este kit elimina los pasos intermedios de purificación y es tan sensible como el kit KAPA Hyper Prep. Almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Cluster3 (software)</td><td>de Hoon et al.</td><td>no comercial</td><td>http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster</td></tr><tr><td>FastQC (software)</td><td>Simon Andrews</td> no <td>comercial</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</td></tr><tr><td>Tecnologías de vida</td> del<td>fluorímetro</td><td>Q32866</td><td>Qubit 2.0 Fluorómetro</td></tr><tr><td>Reactivos del fluorómetro</td><td>tecnologías de vida</td><td>Q32851</td><td>El kit proporciona reactivo de ensayo concentrado, tampón de dilución y patrones de ADN prediluidos para el fluorómetro Qubit. Almacene los estándares de ADN a 4 & grados; C, tampón y tinte a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma</td><td>F8775-4X25ML</td><td>Solución de formaldehído, para biología molecular, 36,5-38% en H2O, estabilizada con 10-15% de metanol. Almacene a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: El formaldehído es corrosivo y altamente tóxico.</td></tr><tr><td>Gel (E-Gel EX agarosa, 2%)</td><td>life technologies</td><td>G4010</td><td>Gel prefabricado con 11 pocillos, formato abatible. Deje vacío un carril entre la escalera y la biblioteca para evitar la contaminación cruzada. Guarde los geles a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Tecnologías de vida útil</td> <td>del sistema de electroforesis en gel</td><td>G6465</td><td>E-Gel iBase y E-Gel Safe Imager kit combinado para bibliotecas ChIP-Seq de selección de tamaño.</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>Almacene todos los reactivos a temperatura ambiente. Uso 500 &micro; l de tampón QG por 100 mg de rodaja de gel de agarosa al 2% para extraer ADN. Utilice las columnas MinElute (del kit de purificación MinElute PCR) para eluir el ADN dos veces.</td></tr><tr><td>HOMER (software)</td><td>Chris Benner</td><td>no comercial</td><td>http://homer.salk.edu/homer/index.html</td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>Techne</td><td>FHB1D</td><td>Hibridador HB-1D</td></tr><tr><td>IGV (software)</td><td>Robinson et al.</td><td>no comercial</td><td>http://www.broadinstitute.org/igv/home</td></tr><tr><td>Illumina Filtro de calidad CASAVA-1.8 (software)</td><td>Assaf Gordon</td><td>no comercial</td><td>http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter</td></tr><tr><td>Java TreeView (software)</td><td>Alok Saldanha</td> no <td>comercial</td><td>http://jtreeview.sourceforge.net</td></tr><tr><td>Gato de laboratorio</td><td>Edu-Lab</td><td>CH0642</td><td>Este conector se utiliza para elevar la muestra en un recinto de sonido para la sonicación.</td></tr><tr><td>Escalera, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N3231</td><td>Mantenga 1x solución a temperatura ambiente. Almacene el stock a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Escalera, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232</td><td>Mantenga 1x solución a temperatura ambiente. Almacene el stock a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml de baja retención</td><td>life technologies</td><td>AM12450</td><td>tubos de microfuga antiadherentes sin RNasa, 1,5 ml</td></tr><tr><td>MACS2 (software)</td><td>Tao Liu</td><td>no comercial</td><td>https://github.com/taoliu/MACS</td></tr><tr><td>Magnetic beads</td><td>life technologies</td><td>11201D</td><td>Estos Dynabeads son perlas superparamagnéticas con IgG anti-ratón policlonal de oveja purificada por afinidad unidas covalentemente a la superficie del cordón. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Perlas magnéticas</td><td>life technologies</td><td>11203D</td><td>Estas Dynabeads son perlas superparamagnéticas con IgG anti-conejo policlonal purificada por afinidad unida covalentemente a la superficie de la perla. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Perlas magnéticas</td><td>life technologies</td><td>10001D</td><td>Estas Dynabeads son perlas superparamagnéticas con proteína A recombinante unida covalentemente a la superficie del cordón. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Perlas magnéticas</td><td>life technologies</td><td>10003D</td><td>Estas Dynabeads son perlas superparamagnéticas con proteína G recombinante unida covalentemente a la superficie del cordón. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tecnologías de vida útil de bastidor magnético</td><td></td><td>12321D</td><td>Imán DynaMag-2</td></tr><tr><td>MEME</td><td>Bailey et al.</td><td>no comercial</td><td>http://meme.nbcr.net/meme/</td></tr> <tr><td>Na3VO4</td><td>New England BioLabs</td><td>P0758</td><td>El ortovanadato de sodio (100 mM) es un inhibidor general de uso común para las proteínas fosfotirosilfosfatasas. Almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>NaF</td><td>New England BioLabs</td><td>P0759</td><td>El fluoruro de sodio (500 mM) se usa comúnmente como inhibidor general de las fosfoserilo y fosfotrionil fosfatasas. Almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Máquina NGS</td><td>Illumina</td><td>SY-301-1301</td><td>Analizador de genoma IIx</td></tr><tr><td>Máquina NGS (alto rendimiento)</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td>HiSeq</td></tr><tr><td>Suero normal (control de anticuerpos)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2028</td><td>Uso como control para anticuerpos IgG policlonales de cabra en experimentos ChIP-qPCR. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Suero normal (control de anticuerpos)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td>Uso como control para anticuerpos IgG policlonales de ratón en experimentos de ChIP-qPCR. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Suero normal (control de anticuerpos)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2027</td><td>Uso como control de anticuerpos IgG policlonales de conejo en experimentos ChIP-qPCR. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Solución de tinción de ácido nucleico</td><td>iNtRON</td><td>21141</td><td>Utilice la solución de tinción de ácido nucleico RedSafe a 1:50.000. Almacene a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Naranja G</td><td>Sigma</td><td>O3756-25G</td><td>1-Phenylazo-2-naftol-6,8-disulfónico sal disódica. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Primeros de PCR</td><td>, por ejemplo, IDT o Sigma</td><td></td><td>Primers para enriquecer fragmentos de ADN ligados por adaptador mediante PCR: AATGATACGGCGACCACCGA*G y CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, enlace fosforotioato. Imprimaciones diseñadas por Ethan Ford. Combine las imprimaciones en 5 y micro; M cada uno. Uso 5 &micro; l en un 50 &micro; l Reacción de PCR. Almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR MinElute&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td>para la purificación de ChIP-qPCR y muestras de prueba de cizallamiento. Almacene las columnas de centrifugación MinElute a 4 & grados; C, todos los demás tampones y tubos de recolección a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1, pH 7,9)</td><td>life technologies</td><td>AM9730</td><td>Fenol:Cloroformo:IAA (25:24:1) se premezcla y se suministra a pH 6,6. Utilice el tampón alcalino Tris proporcionado para elevar el pH a 7,9. Almacenar a 4 °C. PRECAUCIÓN: fenol: cloroformo: el alcohol isoamílico es corrosivo, altamente tóxico y combustible.</td></tr><tr><td>Primer3 (software)</td><td>Steve Rozen & Helen Skaletsky</td><td>no comercial</td><td>http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi</td></tr><tr><td>Comprimidos inhibidores de la proteasa</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>cOmplete, Mini, sin EDTA. Utilizar 1 comprimido por cada 10 ml. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Comprimidos inhibidores de la proteasa</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>cOmplete, sin EDTA. Utilizar 1 comprimido por cada 50 ml. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>life technologies</td><td>AM2548</td><td>proteinasa K solución (20 &micro; g/&micro; l). Almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>life technologies</td><td>12091-039</td><td>RNasa A (20 &micro; g/&micro; l). Almacene a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Rotador</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td>Rotador SB3</td></tr><tr><td>SAMtools (software)</td><td>Li et al.</td><td>no comercial</td><td>http://samtools.sourceforge.neta</td></tr><tr><td>Perlas de inmovilización reversibles en fase sólida</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>Las perlas Agencourt AMPure XP se utilizan para minimizar la contaminación del dímero del adaptador en las bibliotecas ChIP-Seq. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Sonicator 3000</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>Ya están disponibles los modelos más nuevos. Q125, Q500 o Q700 son adecuados para el cizallamiento de cromatina reticulada.</td></tr><tr><td>Caja acústica</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>opcional: siga las recomendaciones del fabricante para obtener la caja acústica correcta.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>eppendorf</td><td>22670000</td><td>Thermomixer para tubos de 24 x 1,5 mL. Control preciso de la temperatura desde 4 & ° C por encima de la temperatura ambiente a 99 °C.</td></tr></tbody></table>

instantánea de todo el genoma de los reguladores de la cromatina y los estados en<em&gt; xenopus</em&gt; los embriones por chip-sec

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

El reclutamiento de reguladores de la cromatina y la asignación de estados de cromatina a loci genómicos específicos son fundamentales para las decisiones sobre el destino celular y la formación de tejidos y órganos durante el desarrollo. La determinación de las ubicaciones y los niveles de estas características de la cromatina in vivo proporcionará información valiosa sobre la regulación espacio-temporal de los elementos genómicos y apoyará las aspiraciones de imitar el desarrollo del tejido embrionario in vitro. El método más utilizado para la elaboración de perfiles de alto resolución y de todo el genoma es la inmunoprecipitación de cromatina, seguida de la secuenciación de próxima generación (ChIP-Seq). Este protocolo describe cómo se pueden procesar los embriones ricos en yema, como los de la rana Xenopus, para los experimentos ChIP-Seq, y ofrece líneas de comandos sencillas para el análisis posterior a la secuenciación. Debido a la alta eficiencia con la que el protocolo extrae núcleos de tejido fijado en formaldehído, el método permite un fácil escalado para obtener suficiente material ChIP para el perfil de todo el genoma. Nuestro protocolo se ha utilizado con éxito para mapear varias proteínas de unión al ADN, como factores de transcripción, mediadores de señalización, componentes de la maquinaria de transcripción, modificadores de cromatina y modificaciones de histonas postraduccionales, y para que esto se haga en varias etapas de la embriogénesis. Por último, este protocolo debería ser ampliamente aplicable a otros organismos modelo y no modelo a medida que se disponga de más y más ensamblajes de genomas.

Se espera que los resultados equivalentes a los que aquí se presenta si el protocolo es bien ejecutado y el anticuerpo en uso es de calidad chip-grado (véase la discusión). Este protocolo permite la extracción de los núcleos de embriones de Xenopus de formaldehído-fijo y la esquila eficiente de la cromatina por sonicación (Figura 1A-C). Cromatina esquilada muestra una distribución asimétrica de los fragmentos de ADN que van principalmente de 100 a 1000 pb y alcanzando un máximo entre 300 y 500 pb (Figura 1C). Se requiere un mínimo de 50 pg de ADN immunoprecipitated de realizar con éxito una gama emparejado biblioteca-chip Sec indexados con insertos de ADN de tamaño similar (Figura 2A). La biblioteca debe ser en gran medida carente de dímeros de adaptador, que se pueden ver en el electroferograma aproximadamente a 120 pb. Tras la secuenciación por síntesis, pre-procesado lee se asignan al genoma (Figura 2 B, C). En un experimento exitoso con <em&gt; X. embriones tropicalis, normalmente 50 a 70% de un solo extremo lee de 40 pb puede ser asignada única para el conjunto de genoma de v7.1 con como máximo dos desajustes. Mientras lee de entrada alinear bastante uniformemente en todo el genoma, la alineación de Chip lee los resultados en enriquecimientos específicos de cadena que flanquean la característica de la cromatina de interés. Esto es porque todos los fragmentos son secuenciados desde el extremo 5 &#39;(Figura 2C) 25. La extensión de la alineación en la dirección de lectura a un tamaño medio fragmento produce perfiles exactos para las características individuales de la cromatina, tales como eventos de unión a factor de transcripción. Estas ocupaciones de ADN aparecen como picos cuando se visualizan en el IGV o cualquier otro genoma navegador compatible. Las personas que llaman pico como MACS se utilizan para determinar la localización de estos picos (Figura 3A). De esta manera decenas de miles de sitios de unión han sido determinados en el X. tropicalis genoma de factores de transcripción T-box como Vegt 26. Chip-qPCR expementos deben confirmar el enriquecimiento local de encontrado por chip-Sec (Figura 3B). Experimentos-chip Sec permiten explorar las características de todo el genoma de las características de la cromatina. Por ejemplo, el cálculo de la distribución de lectura sobre los elementos genómicos, como inicio de la transcripción y sitios de terminación puede resaltar cualquier preferencia vinculantes espaciales alrededor de genes (Figura 3C). Del mismo modo, un mapa de calor de las distribuciones de lectura en lugares pico se utiliza para comparar las diferentes características de la cromatina en un genoma de gran escala (Figura 3D). Ciertos factores de transcripción se unen secuencia de ADN específica. De novo motivo de análisis de picos subyacentes de ADN genómico puede recuperar este tipo de información, incluyendo enriquecida con Co motivos de co-factores potenciales (Figura 3E). La gran mayoría de los genes diana mostrar ocupación de ADN a un menor en vez de mayor nivel (Figura 3F). Esta característica libre de escala parece ser bastante común entre los trfactores anscription y sugiere que sólo una pequeña fracción de los genes diana están regulados directamente con relevancia biológica 27,28. El análisis de los términos de GO enriquecido u otros atributos como la expresión diferencial de genes diana puede revelar más conocimientos sobre la función biológica de la función de la cromatina en el embrión de Xenopus (Figura 3G). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig1highres.jpg" /> Figura 1. La cromatina procedimiento de inmunoprecipitación para los embriones de Xenopus. Embriones (A) son formaldehído-fijo en la etapa de desarrollo de interés para unen covalentemente (entrecruzamiento) cualquiera de las proteínas asociadas con el ADN genómico. Tras la extracción nuclear (B), la cromatina reticulada se fragmenta para reducir de unión al ADN genómico o sitios de modificación de la cromatina minimizando el DN flanqueandoUna secuencia (C). Posteriormente, los fragmentos de cromatina se inmunoprecipitaron con un anticuerpo chip-grado para enriquecer los que contienen el epítopo de interés (D). El ADN co-immunoprecipitated se despojó de la proteína y se purifica (E) antes de crear la biblioteca de fragmentos chip para NGS (Figura 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig2highres.jpg" /> Figura 2. Preparación de la biblioteca-chip Sec, la secuenciación por síntesis, la cartografía y el llamado pico. (A) El electroferograma muestra una buena biblioteca-chip Sec con moldes de ADN de 250 a 450 pb. Estas plantillas implican el inserto de ADN de interés flanqueado por lo universal (58 pb) y el (63 pb) adaptador de indexado. (B) </strong&gt; Millones de grupos, con cada grupo que contiene plantillas idénticas, son de base secuenciados por base en presencia de los cuatro nucleótidos que poseen reversible, fluoróforo distinto y propiedades de terminación idénticos. Fluorescente imágenes se procesan en tiempo real para llamar correspondientes bases, que en última instancia se ensamblan en las lecturas. (C) Sólo lee ese mapa única para el genoma Xenopus se mantienen. Como todos los fragmentos se secuencian a partir del extremo 5 &#39;, el mapeo de Chip lee los resultados en picos específicos de cadena que flanquean la función de la cromatina de interés. De este modo, las personas que llaman pico detectar el enriquecimiento que se origina de inmunoprecipitación y extender la lee a una longitud media fragmento de localizar con precisión las características de la cromatina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52535 / 52535fig3highres.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Un ejemplo de análisis post-secuencia y la visualización de datos por medio del factor cigóticos T-box transcripción Vegt (zVegT). Todos los leídos recuentos mostrados aquí están normalizados a 10 millones asignan de forma única y lee no redundante. (A) Extracto del perfil de todo el genoma de zVegT unión en X. embriones tropicalis gástrula (etapa 11 a 12,5 después de Nieuwkoop y Faber 29). Cada pico, un choque en cadena de lecturas extendida, representa un sitio de unión. Estos picos son llamados por MACS2 con una tasa de falso descubrimiento (FDR) de menos de 1%. Cada gen MESP muestra zVegT muy proximal y aguas arriba de unión, pero sólo ENTHERMICS MEDICAL SYSTEMS y mespb se expresan en esa etapa (datos de RNA-Seq 30). (B) los niveles de ocupación de ADN de zVegT según lo determinado por chip-qPCR en varios loci (incluyendo un no región -bound 0,5 kb aguas arriba de β-actina) confirm el enriquecimiento específico encontrado por chip-Sec. Comparar los resultados de ENTHERMICS MEDICAL SYSTEMS con pico llamado (barra roja) en (A). El nivel de ocupación de ADN se visualiza como un porcentaje de entrada para ambos, el chip con el anticuerpo Vegt (policlonal de conejo de isotipo IgG) y el chip con el control de anticuerpo (IgG de conejo normal). Las barras de error representan la desviación típica de dos réplicas biológicas. (C) MetaGene análisis muestra zVegT unión preferencial (etiquetas binned más de 25 pb) al promotor con respecto a cualquier otra región genómica alrededor y dentro de los cuerpos de genes. (D) Heatmap muestra k-media agrupados niveles (k = 5) de ocupación de ADN (etiquetas binned más de 25 pb) de zVegT y Smad2 / Smad3 (datos-chip Sec 31) relativa a todas las regiones con destino a zVegT en la etapa de gástrula. El mapa de calor es log 2 basado y centrado a 5 etiquetas por pb. (E) De novo motivo de análisis descubre la canónica factor de transcripción T-box motivo de unión en el 38% de zVegT-regiones con destino si la puntuación subyacente motivo se normaliza a una tasa de descubrimiento del 5% en las secuencias de fondo. El mapa de densidad de muestra más alto enriquecimiento para el motivo de la caja en T en el centro de sitios de unión zVegT, mientras que el motivo de Smad2 / Smad3 unión canónica apenas se enriquece. (F) histograma muestra los niveles de ocupación de ADN de zVegT, que se calculan para cada gen diana de todos los picos (+/- 200 pb) entre 5 kb aguas arriba [-]. y 1 kb abajo [+] de los sitios de inicio de transcripción correspondiente (G) Top 300 genes con niveles más altos de ocupación de ADN dentro de -5 kb y 1 kb son enriquecida para los procesos biológicos del desarrollo embrionario temprano. Estos GO términos están en línea con la supuesta función de zVegT. El FDR se basa en una prueba exacta de Fisher de dos colas y corregido para múltiples pruebas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La cuestión de cómo los reguladores y los estados de la cromatina cromatina afecta al genoma in vivo es fundamental para nuestra comprensión de cómo los primeros se toman las decisiones del destino celular en el embrión en desarrollo. Chip-Sec-el método más popular para investigar las características de la cromatina en un nivel se describe aquí mundial para los embriones de Xenopus.

Instantánea de todo el genoma de los Reguladores de la cromatina y los Estados en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los embriones por chip-Sec

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

El objetivo de este procedimiento, comúnmente conocido como ChIP-seq, abreviatura de inmunoprecipitación de cromatina, seguido de secuenciación de próxima generación, es determinar la ubicación de los reguladores de la cromatina y los estados de la cromatina en todo el genoma en el embrión opus. Esto se logra fijando primero los embriones zap y, por lo tanto, uniendo covalentemente las proteínas asociadas al ADN con el genoma. A continuación, se extraen los núcleos y su cromatina se solubiliza y se comparte por sonicación.En este punto, la proteína de interés unida al ADN se purifica mediante inmunoprecipitación y lavado extenso. El paso final es crear una biblioteca ChIP-seq indexada a partir de los fragmentos de ADN purificados. En última instancia, millones de cinco hombres primarios de estos fragmentos de ADN, los llamados res, se secuencian en paralelo, se alinean con el genoma y se extienden hasta la longitud media del fragmento.Se determina el enriquecimiento local de los llamados picos para identificar todas las ocupaciones de ADN específicas del sitio de la proteína de interés y, por lo tanto, ampliar el estudio de sus características en todo el genoma. Por lo tanto, este protocolo puede proporcionar información detallada sobre la arquitectura de la cromatina de todo el genoma de los embriones de emúes. También se puede aplicar potencialmente a otros organismos con genomas secuenciados.Comienza con los embriones de la escritura. Los detalles hasta este punto se proporcionan en el protocolo de texto. Transfiéralos en un frasco de vidrio de ocho mililitros y lávelos con 0.01 XMMR.Después del lavado, fije los embriones con 1% de formaldehído y 0,01 XMMR. Deje que la solución dure al menos 15 a no más de 40 minutos a temperatura ambiente. Termine la solución lavando los embriones tres veces con 0.01 XMMR frío.Evite que los embriones toquen la superficie de la solución, ya que la tensión superficial provocará la ruptura. Una vez que se ha lavado el fijador, hacer alícuotas de 250 embriones en tubos de microrresiduos. A continuación, hipopeso la mayor cantidad posible de 0,01 XMMR y proceda con la extracción de la cromatina para hacer una pausa.Aquí se equiparan los embriones en 250 microlitros de tampón HEG frío. Una vez colocados en el tampón, los embriones pueden congelarse en nitrógeno líquido y almacenarse a menos 80 grados centígrados. Comience por homogeneizar los embriones fijados en E un tampón.Los detalles sobre el escalado y la preparación del búfer se proporcionan en el protocolo de texto. Siguiente centrífuga. Los homogeneizados a cuatro grados centígrados aspiran y desechan el sate y vuelven a suspender los pellets en E uno.Nuevamente, mantenga la muestra en hielo durante 10 minutos. Repite la centrifugación y esta vez Reese, suspende la paleta en Mi dos. Espere 10 minutos mientras el homogeneizado se enfría en hielo.A continuación, repita la centrifugación de nuevo, y Reese suspenda el pellet en E tres. Esta vez, después de enfriar durante otros 10 minutos, la suspensión debe parecer bastante transparente porque en este punto, el detergente ónico hace que la mayoría de las plaquetas de la yema restantes sean solubles. Ahora, repita la centrifugación. Andre.Suspenda los gránulos en uno a tres mililitros de E tres. Si es necesario, utilice el último paso de centrifugación para separar todos los gránulos de los núcleos reticulados deseados. Esta suspensión también contiene gránulos de pigmento y algunas plaquetas de yema residuales.Estos gránulos y plaquetas de la yema se separarán de la cromatina tras la sonicación por centrifugación. Ahora mantenga la muestra en hielo y proceda con la fragmentación de la cromatina. Alternativamente, rompa y congele la muestra para su almacenamiento temporal.Comience transfiriendo la muestra en E tres a un tubo de poliestireno hecho a medida. Para el sonicate, conecte el tubo a un vaso de precipitados de 800 mililitros con agua helada utilizando una pinza de termómetro corta para que permanezca llamado durante la sonicación. Coloque el vaso de precipitados en un conector y ajústelo de modo que la punta del sónico se sumerja aproximadamente dos tercios del camino en la muestra.La punta del sónico no debe tocar la pared del tubo. Optimice la sonicación, comenzando con los parámetros recomendados por el fabricante de mi Sonic Sonicate 3000 equipado con un sónico de micro punta cónica de 16 pulgadas siete minutos en total. 30 segundos cada vez entre sonicación.Deje reposar la muestra durante un minuto. Comience cada sonicación a una potencia de uno y auméntela gradualmente hasta entre dos y cuatro. Si la muestra comienza a espumar, vuelva a colocar el tubo y deje que la espuma se disipe antes de continuar Después de la sonicación, la cromatina se solubiliza y se corta.Transfiéralo a un pre enfriamiento de 1,5 mililitros a micro tubos de basura y centrifugar a toda velocidad. Durante cinco minutos de cuatro grados centígrados, recoja el SNA y transfiéralo a tubos de preenfriamiento. Deseche la bolita.Utilice 50 microlitros de SUP natant para evaluar visualmente la fragmentación y guardar el resto para la inmunoprecipitación. Comience transfiriendo de 10 a 30 microlitros de SUP de cromatina a un nuevo tubo para que sirva como muestra de entrada. A continuación, añada un anticuerpo de grado chip a aproximadamente un microgramo por millón de células a la cromatina restante.Incubar la muestra de anticuerpos de cromatina durante la noche, también a cuatro grados centígrados, pero con 10 RPM de rotación. Al día siguiente, lavar las perlas magnéticas compatibles con anticuerpos en E tres durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Utilizando la concentración de perlas sugerida por el fabricante en las perlas lavadas para la cromatina preincubada de anticuerpos, incube a cuatro grados centígrados con rotación durante cuatro horas más.Luego, con un tampón de desgarrador refrigerado, lave las cuentas 10 veces. Use el imán durante 20 a 30 segundos para separar las cuentas entre lavados. La solución debe ser clara.Siga los lavados del tampón del desgarrador con un lavado con 10 tampones refrigerados. A continuación, transfiera las perlas en un pequeño volumen de 10 tampones a un nuevo tubo. Separe las perlas y deseche el tampón residual.Para desprender la cromatina inmunoprecipitada. Reese ha doblado las perlas en 50 a 100 microlitros de tampón de solución SDS y ha vórtice el tubo con un mezclador térmico. A continuación, centrifugar el tubo a toda velocidad durante 30 segundos y recoger el snat que contiene el eluido de cromatina inmunoprecipitado.Repita la solución SDS, paso una vez y combine todo el eluido. A continuación, se procede a la extracción de ADN, ChIP-seq, preparación de la biblioteca y secuenciación de próxima generación como se describe en el protocolo de texto Siguiendo este protocolo, la cromatina compartida muestra una distribución asimétrica de los fragmentos de ADN, que oscila principalmente entre 100 y 1000 pares de bases y alcanza un máximo entre 300 y 500 pares de bases. Se requiere un mínimo de 50 picogramos de ADN inmunoprecipitado para crear con éxito una biblioteca de N ChIP-seq emparejada con índices con inserciones de ADN de tamaño similar.La biblioteca debe estar en gran parte desprovista de dímeros adaptadores, que se pueden ver en el electroferograma en aproximadamente 120 pares de bases. La secuenciación de la biblioteca ChIP-seq reduce millones de secuencias cortas de ADN, las llamadas lecturas. Estos se asignan al genoma, mientras que las lecturas de entrada se alinean uniformemente a lo largo del genoma.Las lecturas de chips muestran enriquecimientos específicos de la hebra que flanquean la característica de cromatina de interés. La extensión de la alineación en la dirección de lectura a un tamaño de fragmento promedio reduce los perfiles precisos para las características de una sola cromatina, como los eventos de unión del factor de transcripción. Estos aparecen como picos en un navegador de genomas, como se muestra aquí para el té de verduras en la etapa de la lista gastronómica de los embriones de los trópicos de Zeno.Los experimentos ChIP-seq permiten explorar las características de todo el genoma de las características de la cromatina, como los motivos de secuencia de ADN enriquecido que subyacen a los picos, o el análisis de ontología génica de objetivos genéticos, como se muestra aquí, las interacciones de TDNA de banco mapeadas después de su desarrollo. Este método allana el camino para que los investigadores exploren el panorama de la cromatina embrionaria, tanto a escala de genoma completo como con una resolución muy alta.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

La diferenciación de ESC coincide con los cambios de tipo de células específicas en la estructura y composición de la cromatina. La detección de los cambios proporciona información valiosa sobre los mecanismos que definen stemcellness y la diferenciación celular. Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) representa un método valioso para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a la diferenciación de células madre.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

Demostramos una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para identificar las interacciones factor en genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de expresión génica en el tejido embrionario del ratón. Este protocolo debe ser ampliamente aplicable para el estudio de la activación de genes específicos de tejido, como ocurre durante el desarrollo embrionario normal.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

Una regulación de puesta a punto de la transcripción génica subyace en la decisión del destino celular embrionaria. En este documento, se describen ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina utilizados para investigar la regulación epigenética de tanto la diferenciación cardiaca de células madre y el desarrollo cardiaco de embriones de ratón.

La regulación epigenética de Cardíaca diferenciación de células madre embrionarias y Tejidos

Aquí, describimos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el protocolo de preparación de biblioteca de ChIP-seq para generar perfiles de epigenómica global de muestras embrionarias de pollo baja abundancia.

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) - una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.

Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

Aquí, describimos un protocolo de secuencia de ChIP de alto rendimiento optimizado y tubería de análisis computacional para la determinación de patrones de estado de todo el genoma cromatina de líneas celulares y tejidos del tumor congelado.

Una plataforma integrada para la asignación de todo el genoma de cromatina Estados mediante secuenciación del ChIP de alto rendimiento en los tejidos del Tumor

Aquí, describimos los métodos para realizar ChIP-Seq y mapas de CARIP-Seq, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación, generar global epigenómica y RNA asociada a la cromatina en células madre embrionarias.

CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias

Este método está diseñado para seguir la formación de dominios de cromatina mediadas por PRC2 en líneas celulares, y el método se puede adaptar a muchos otros sistemas.

Un método para estudiar la formación de novo de dominios de cromatina

La determinación precisa de las ubicaciones de unión a proteínas en todo el genoma es importante para entender la regulación genética. Aquí describimos un método de mapeo genómico que trata el ADN inmunoprecipitado con cromatina con digestión exonucleasa (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento. Este método detecta interacciones proteína-ADN con resolución cartográfica de par base cercano y alta relación señal-ruido en las neuronas de mamíferos.

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

Este protocolo proporciona una canalización computacional optimizada para cuantificar las transcripciones de potenciadores nacientes. Al integrar la accesibilidad de la cromatina, la característica de la cromatina y los datos transcripcionales, permite una detección precisa y un análisis específico de la actividad potenciadora de la hebra en regiones intragénicas complejas, sin dejar de ser accesible para los investigadores sin una amplia formación en bioinformática.

Una canalización computacional para la cuantificación de ARN potenciador intergénico / intragénico en células madre embrionarias de ratón

Aquí presentamos un protocolo ATAC-seq rápido y sencillo para implementarse en un gusano completo de la etapa L4 de Caenorhabditis elegans usando solo 30 μL de pellet de gusano.

Perfilado de accesibilidad de la cromatina en larvas completas de Caenorhabditis elegans L4

Aprende el método ChIP-Seq para mapear reguladores de cromatina en embriones de Xenopus. Esta técnica permite analizar la arquitectura del genoma y comprender la regulación génica durante el desarrollo embrionario temprano.

Instantánea de todo el genoma de los Reguladores de la cromatina y los Estados en

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