Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

El objetivo general de este procedimiento es aislar tipos celulares neuronales individuales a partir de tejido cerebral para su posterior análisis. Esto se logra primero disociando el tejido neural en una suspensión de células individuales. En el segundo paso, se elimina la mielina de la suspensión y luego las células se tiñen con anticuerpos específicos para cada tipo celular.

En el paso final, las poblaciones celulares individuales se separan mediante citometría de flujo. En última instancia, este método de aislamiento específico por tipo celular permitirá a los usuarios analizar cambios en la expresión génica o proteica o modificaciones epigenéticas de manera específica para cada tipo celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como qué tipos celulares expresan ciertos receptores, cuáles expresan ciertas proteínas y cuáles presentan ciertas modificaciones epigenéticas, con el fin de comprender mejor los mecanismos específicos de cada tipo celular en el cerebro.

Comience la disociación neural utilizando hojas de bisturí estériles para cortar cada muestra obtenida de tejidos cerebrales adultos en pequeños fragmentos de entre 30 y 400 miligramos sobre la tapa de una placa de cultivo de seis pocillos. A continuación, sumerja el tejido en un mililitro de HBSS libre de calcio y magnesio y utilice una pipeta para transferir las muestras a tubos cónicos estériles de dos mililitros una vez que se hayan recolectado todos los tejidos. Centrifugue las muestras y aspire los sobrenadantes.

Añada 1.900 microlitros de enzima tibia. Mezcle una vez e incube las muestras durante 15 minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius, invirtiendo el tubo varias veces cada cinco minutos para resuspender los fragmentos de tejido sedimentados.

Al final de la incubación, agregue 30 microlitros de enzima recién preparada. Mezcle dos veces cada muestra e invierta suavemente los tubos. Luego, utilizando una pipeta de pistón etiquetada como uno, disocie cada muestra con 30 movimientos de aspiración y expulsión.

Teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas. Incube las muestras durante otros 15 minutos a 37 grados Celsius con inversión cada cinco minutos, seguido de la disociación de las muestras con pipeta Pasteur. Número dos, como se acaba de demostrar.

Luego cambie a la pipeta número tres, repita la disociación e incube las muestras durante 10 minutos más. En el baño de agua, invierta cada cinco minutos; al final de la incubación, filtre las suspensiones de células individuales a través de filtros celulares de 80 micrones hacia tubos Falcon de 15 mililitros. Lave cada filtro con 10 mililitros de HBSS sin calcio ni magnesio para detener las reacciones enzimáticas una vez que se haya filtrado la última muestra, centrifugue los tubos y aspire los sobrenadantes para agotar la mielina de la célula.

Las suspensiones resuspenden completamente los sedimentos en 400 microlitros de tampón de eliminación de mielina, y agregue la cantidad adecuada de microesferas de eliminación de mielina a cada tubo. Pipetee las soluciones hacia arriba y hacia abajo hasta que las células y las microesferas estén completamente mezcladas. A continuación, incube la muestra a cuatro grados Celsius durante 15 minutos.

Después de la incubación, lave cada muestra con cinco mililitros de tampón de eliminación de mielina mientras las células están centrifugándose; coloque una columna para cada muestra en el campo magnético de un separador magnético y coloque un filtro limpio de 80 micrones encima de cada columna. Enjuague cada filtro y columna tres veces con un mililitro de tampón de eliminación de mielina, recolectando todo el flujo de paso en un recipiente de desecho. Después del enjuague final, coloque tubos redondos de poliestireno de cinco mililitros directamente debajo de cada columna para recolectar el eluato.

Luego aspire el sobrenadante de las muestras y resuspenda los pellet en 500 microlitros de tampón de eliminación de mielina. Aplique inmediatamente las suspensiones celulares a las columnas, recolectando las células en los tubos inferiores. Luego enjuague cada filtro y columna cuatro veces con un mililitro de tampón de eliminación de mielina por lavado.

Después del último lavado, centrifugar las células y aspirar los sobrenadantes para teñir las células y separarlas mediante citometría de flujo. Vortexear cada muestra durante aproximadamente dos segundos para disociar los sedimentos y transferir un microlitro de células de cada tubo a tubos individuales. Para los controles de tinción, añadir inmediatamente cinco microlitros de bloqueo FC a cada tubo, incluidos los controles de tinción.

Luego, vortexe las muestras nuevamente e incúbelas a cuatro grados Celsius. Después de cinco minutos, agregue 100 microlitros del cóctel adecuado de anticuerpos primarios. Cubra los tubos para proteger los anticuerpos de la luz e incube las células a cuatro grados Celsius durante 20 minutos.

Al final de la incubación, lave las muestras con dos mililitros de tampón de lavado, luego aspire los sobrenadantes y marque cada muestra con 100 microlitros del anticuerpo secundario adecuado. Tape los tubos y colóquelos a cuatro grados Celsius durante 15 minutos. A continuación, lave las muestras con dos mililitros de tampón de lavado, centrifugue las muestras y luego aspire el sobrenadante.

Supernatantes Resus, suspenda los pellet en 250 microlitros de PBS estéril y separe las células; aquí se muestran poblaciones representativas de células neuronales separadas por citometría de flujo provenientes de un hipocampo masculino individual. Las células se seleccionaron inicialmente entre todos los eventos posibles según sus propiedades de dispersión hacia adelante y dispersión lateral. A continuación, se seleccionaron las células individuales o singletes, excluyendo dobletes o agregados celulares más grandes, según su tamaño, para permitir una separación precisa de los tipos celulares individuales. Posteriormente, las células individuales se separaron en poblaciones de células CD11B positivas y CD11B negativas, con una separación adicional de las células CD11B negativas en células GT1 y TH1 positivas. Luego, se utilizó el programa de análisis para determinar el número total de eventos en cada población, así como el porcentaje respecto a las poblaciones parentales, con el fin de confirmar la pureza de las células separadas.

En este ejemplo particular, se analizó mediante PCR en tiempo real la expresión génica relativa de genes específicos de tipos celulares alternativos. Como era de esperar, estos datos confirmaron la pureza de las células ordenadas, así como identificaron algunas diferencias interesantes entre las regiones cerebrales investigadas. Tras confirmar la pureza del ordenamiento, se puede medir la expresión de otros genes de interés para determinar el tipo celular específico en el que se expresan, o si su expresión se modifica tras un tratamiento de manera específica al tipo celular.

Por ejemplo, aquí se investigó la expresión de cow binding, una proteína fijadora de calcio utilizada frecuentemente para identificar neuronas en el hipocampo y el cerebelo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar tipos celulares neuronales específicos de interés, como la célula neural mostrada aquí, utilizando anticuerpos adecuados contra antígenos de superficie celular.