Name: Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a aislar tipos celulares neuronales específicos de tejido cerebral mediante clasificación por citometría de flujo. Este método permite analizar expresión génica y modificaciones epigenéticas en poblaciones celulares específicas de rata.

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Los autores desean agradecer a Lynn Opdenaker del Centro de Investigación Traslacional de la Universidad de Delaware en el Centro Oncológico Helen F. Graham por su asistencia técnica, así como a Nancy Martin del Recurso Compartido de Citometría de Flujo del Instituto del Cáncer de la Universidad de Duke, y a la Dra. Susan H. Smith por su orientación en los métodos y la recopilación de datos.

1. Preparación para la recolección de tejidos (15 – 30 min)
<ol>
	<li>Pula al fuego tres juegos de pipetas Pasteur de vidrio en diámetros decrecientes y númbralos "1" = aproximadamente 1 mm de diámetro, "2" = aproximadamente 0,75 mm de diámetro y "3" = aproximadamente 0,50 mm de diámetro.</li>
	<li>Resuspenda la enzima A liofilizada con todo el tampón A de acuerdo con el protocolo proporcionado con el kit de disociación neural (consulte la tabla de materiales). No haga vórtice. Alicuente la solución en alícuotas de 50 μl y almacene a -20 ºC para su uso posterior.</li>
	<li>Prepare 1 L de tampón de eliminación de mielina y filtro de vacío para la esterilización [tampón de eliminación de mielina = 1.000 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M, 2 ml de 500 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 10 g de albúmina sérica bovina (BSA)].</li>
	<li>Corta una lámina de malla de nailon en cuadrados pequeños de 2,5 x 2,5 cm (1 x 1 pulgada) que se usarán para filtrar los desechos celulares y autoclave en un vaso de precipitados pequeño cubierto con papel de aluminio.</li>
	<li>Prepare 1 L de tampón de lavado [tampón de lavado = 1.000 ml de 0,1 M de PBS, 2 ml de 500 mM de EDTA y 10 g de BSA].</li>
</ol>
2. Recolección de tejidos
<ol>
	<li>Poner al baño maría a 37 ºC.</li>
	<li>Prepare el tampón X del kit de disociación neuronal añadiendo beta-mercaptoetanol al tampón X hasta una concentración final de 0,067 mM (para 4 muestras, añadir 13,5 μl de 50 mM de beta-mercaptoetanol a 10 ml de tampón X).</li>
	<li>Prepare la mezcla de enzimas 1 mezclando 50 μl de enzima P con 1.900 μl de tampón X para cada muestra, tal como se describe en el protocolo del kit de disociación neuronal. Por ejemplo, para 4 muestras, mezcle 200 μl de enzima P con 7.600 μl de tampón X.</li>
	<li>Colocar el Tampón X en el baño maría a 37 ºC.</li>
	<li>Coloque 2 ml de solución salina tamponada de Hank's fría (HBSS) (sin Ca++ y Mg++) en un pocillo de una placa de cultivo estéril de 6 pocillos para cada muestra que se recogerá y manténgala en hielo para la disección del tejido.</li>
</ol>
3. Disección de tejidos (45 min – 1 hr)
<ol>
	<li>Inyecte al animal un volumen adecuado de solución de eutanasia (solución comercial de barbitúricos, por ejemplo, Euthasol), de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), y perfunda toda la sangre con solución salina fría al 0,9%.
	<ol>
		<li>Administrar a las ratas una sobredosis de solución de eutanasia.</li>
		<li>Controle la anestesia a través de la respiración y el pellizco de los dedos de los pies. Cuando el animal está suficientemente anestesiado (sin respuesta al pellizco de los dedos del pie y a la respiración profunda y lenta), la rata puede ser perfundida.</li>
		<li>Para perfundir a la rata, corta la cavidad torácica con unas tijeras resistentes. Corta el diafragma para permitir el acceso hasta el corazón. Corta las costillas a lo largo de ambos lados hasta la parte superior del pecho, para permitir el acceso completo al corazón. En ese punto, la caja torácica se puede sostener hacia un lado con un par de hemostáticos.</li>
		<li>Realice la perfusión cardíaca insertando una aguja de 18 G (para ratas adultas) conectada a una bomba eléctrica en el ventrículo izquierdo del corazón. La bomba está produciendo una solución salina fría al 0,9%.</li>
		<li>Luego, abra la aurícula derecha con un pequeño par de tijeras para permitir que la sangre y la perfusión líquida drenen del cuerpo.</li>
		<li>Perfundir ratas con aproximadamente 10 ml (para ratas adultas) de solución salina al 0,9% para eliminar todas las células y factores inmunitarios periféricos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Diseccione la parte deseada de la región del cerebro con hojas de afeitar estériles y una disección adecuada, luego coloque las piezas de tejido en el HBSS frío sin Ca2+ y Mg2+. 
	NOTA: El protocolo requiere HBSS sin Ca2+ y Mg2+ en los primeros pasos del protocolo, ya que estos iones pueden interferir con las enzimas necesarias para la disociación neuronal.</li>
	<li>Una vez que se hayan recolectado todas las muestras de tejido, devuélvalas al banco limpio o a la campana de cultivo estéril para el procesamiento de tejidos.</li>
</ol>
4. Disociación neuronal (1 hora)
<ol>
	<li>Corta cada muestra de tejido en pedazos pequeños con hojas de afeitar estériles en la tapa de la placa de cultivo de 6 pocillos. Este protocolo se ha utilizado para muestras de tejido de aproximadamente 30 a 100 mg, pero está aprobado para muestras de tejido de hasta 400 mg. En el caso de muestras de tejido de más de 400 mg, los volúmenes de reactivos deben ampliarse adecuadamente.</li>
	<li>Utilice 1 ml de HBSS fresco sin Ca2+ y Mg2+ para transferir los trozos de tejido cortados en cubitos con una pipeta a un tubo de centrífuga estéril de 2 ml. Repita los pasos 4.1 y 4.2 para todas las muestras hasta que todas las muestras se hayan transferido a un tubo de centrífuga de 2 ml.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 300 x g durante 2 min a RT y aspirar sobrenadante.</li>
	<li>Añada 1.900 μl de Enzyme Mix 1 tibio, como se preparó en los pasos 2.2 y 2.3, a cada muestra y cierre los tubos.</li>
	<li>Incubar las muestras durante 15 min en el baño de agua a 37 ºC, invirtiendo los tubos varias veces cada 5 min para volver a suspender los trozos de tejido sedimentados.</li>
	<li>Mientras tanto, prepare la mezcla de enzimas 2 mezclando 20 μl de tampón Y con 10 μl de enzima A descongelada (para 4 muestras, mezcle 80 μl de tampón Y con 40 μl de enzima A descongelada).</li>
	<li>Añadir 30 μl de Enzyme Mix 2 a cada muestra e invertir suavemente. No haga vórtice.</li>
	<li>Disocie cada muestra de tejido con la pipeta Pasteur "1", triturando hacia arriba y hacia abajo 30 veces.</li>
	<li>Incubar las muestras durante 15 min en el baño de agua a 37 ºC; invertir los tubos varias veces cada 5 min para volver a suspender los trozos de tejido sedimentados.</li>
	<li>Disociar cada muestra de tejido con la pipeta Pasteur "2", triturando hacia arriba y hacia abajo 30 veces. Evita generar burbujas.</li>
	<li>Disocie cada muestra de tejido con la pipeta Pasteur "3", triturando hacia arriba y hacia abajo 30 veces. Evita generar burbujas.</li>
	<li>Incubar las muestras durante 10 min en el baño de agua a 37 ºC; invertir los tubos varias veces cada 5 min para volver a suspender las células sedimentadas.</li>
	<li>Aplique la suspensión unicelular a una cepa celular de 80 micras colocada encima de un tubo falcon de 15 ml para eliminar cualquier trozo grande de residuos y lave el filtro y las células con 10 ml de HBSS (con Ca2+ y Mg2+) para detener las reacciones enzimáticas. Repita hasta que cada muestra se transfiera a un tubo de halcón limpio de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 300 x g durante 10 min a RT y aspirar el sobrenadante.</li>
</ol>
5. Agotamiento de mielina (45 min)
<ol>
	<li>Vuelva a suspender completamente el pellet de células con 400 μl de tampón de eliminación de mielina.</li>
	<li>Agregue la cantidad especificada de las perlas de eliminación de mielina y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar completamente. 
	NOTA: El volumen de las perlas de eliminación de mielina que se utiliza dependerá del tamaño del tejido, la edad del animal y la cantidad de mielina que se espera en esa región particular del cerebro. Por ejemplo, para una muestra de hipocampo de rata adulta (aproximadamente 300 mg), incubar la muestra con 100 μl de perlas de eliminación de mielina.
	
</li>
	<li>Incubar durante 15 min en el frigorífico a 4 ºC.</li>
	<li>Lave cada muestra con 5 ml de tampón de eliminación de mielina.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 300 x g durante 10 min en RT.</li>
	<li>Mientras centrifuga las muestras, coloque 1 columna para cada muestra en el campo magnético del clasificador magnético y coloque un filtro limpio de 80 micras encima de cada columna.</li>
	<li>Prepare las columnas y filtre enjuagando cada columna con 1 ml de tampón de eliminación de mielina, 3 veces (3 ml en total). Recoja todo el flujo en un contenedor de residuos, como el fondo de una caja de propinas vacía.</li>
	<li>Coloque el tubo inferior redondo de poliestireno de 5 ml directamente debajo de cada columna en la preparación de la recolección de muestras.</li>
	<li>Cuando las células hayan terminado de centrifugarse, aspire el sobrenadante y vuelva a suspenderlo completamente en 500 μl de tampón de eliminación de mielina. Aplique inmediatamente la suspensión celular a la columna y recoja las células en el tubo de abajo.</li>
	<li>Lave el filtro y la columna con 1 ml de tampón de eliminación de mielina, 4 veces (4 ml en total).</li>
	<li>Centrifugar la recolección de células a 300 x g durante 10 min en RT.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante y las células ya están listas para la tinción.</li>
</ol>
6. Tinción de células vivas para FACS (1 hora para la tinción)
<ol>
	<li>Agitar brevemente las celdas en vórtice (2 seg) para separar el pellet e inmediatamente añadir 5 μl de bloque Fc (anti-clusters de diferenciación 32, CD32), vórtice de nuevo, e incubar en el frigorífico a 4 ºC durante 5 min.</li>
	<li>Mientras tanto, prepare la mezcla de anticuerpos primarios agregando los tres anticuerpos primarios en el tampón de lavado de la siguiente manera: 0,125 μl de anticuerpo CD11b conjugado con aloficocianina (APC) (1:800), 1 μl de anticuerpo anti-GLT1 (1:100) y 0,4 μl de isotiocianato de fluoresceína (FITC) – anticuerpo Thy1 conjugado (1:250) por cada 100 μl de tampón de lavado. Cada muestra recibirá 100 μl de mezcla de anticuerpos primarios para la incubación; Sin embargo, si su muestra es mucho más grande que 400 mg de tejido, es posible que desee considerar aumentar el volumen de su mezcla de anticuerpos primarios en consecuencia</li>
	<li>Prepare los tubos para los controles de tinción individuales extrayendo solo 2 μl de células de cada tubo de muestra y agregándolo a cada tubo de control de tinción individual. Los controles de "tinción única" incluyen: APC-CD11b solamente, GLT1 solamente, FITC-Thy1 solamente, anticuerpo secundario PE solamente, y el control "en blanco" o sin teñir. 
	NOTA: Todas las muestras deben estar representadas en todos los controles de tinción, por lo que se deben agregar 2 μl de células de cada muestra a cada tubo de control de tinción.</li>
	<li>Agite brevemente los tubos (2 segundos) y agregue 100 μl de mezcla de anticuerpos primarios a cada tubo de muestra y 100 μl de anticuerpo primario apropiado a cada tubo de control de tinción, vuelva a hacer un vórtice de los tubos, cubra los tubos con papel de aluminio para proteger los anticuerpos fluorescentes de cualquier luz e incube los tubos en el refrigerador a 4 ºC durante 20 minutos. Las muestras deben mantenerse frías (a 4 ºC) durante el resto del procedimiento para mantener la integridad de las muestras y de los anticuerpos.</li>
	<li>Agite brevemente los tubos y agregue 2 ml de tampón de lavado a cada tubo.</li>
	<li>Tubos de centrífuga a 350 x g durante 5 min a 4 ºC.</li>
	<li>Mientras tanto, prepare la mezcla de anticuerpos secundarios añadiendo 0,2 μl de anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con PE por cada 100 μl de tampón de lavado. Cada muestra recibirá 100 μl de mezcla de anticuerpos secundarios; Sin embargo, si su muestra es mucho más grande que 400 mg de tejido, es posible que desee considerar aumentar el volumen de su mezcla de anticuerpos primarios en consecuencia.</li>
	<li>Cuando se complete la centrifugación, vierta el sobrenadante de cada muestra en el fregadero y seque los tubos boca abajo sobre una toalla de papel.</li>
	<li>Agitar brevemente los tubos y añadir 100 μl de mezcla de anticuerpos secundarios a cada tubo de muestra y el anticuerpo secundario adecuado a cada control de tinción, volver a vorexar los tubos, cubrir los tubos con papel de aluminio e incubar los tubos en el frigorífico a 4 ºC durante 15 min. 
	NOTA: El tubo de control de tinción solo GLT1 debe recibir la mezcla de anticuerpos secundarios.
	
</li>
	<li>Después de la incubación, agite brevemente los tubos y agregue 2 ml de tampón de lavado a cada tubo.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 350 x g durante 5 min a 4 ºC.</li>
	<li>Cuando se complete la centrifugación, vierta el sobrenadante de cada muestra en el fregadero y seque los tubos boca abajo sobre una toalla de papel.</li>
	<li>Agite los tubos y agregue 0,25 ml de PBS estéril a cada tubo. Las muestras están listas para ser clasificadas. 
	NOTA: Es posible que más células requieran 0,5 ml de PBS estéril; Sin embargo, es mejor comenzar con un volumen más bajo><, ya que la muestra siempre se puede diluir si está demasiado concentrada con células.
	NOTA: Opcionalmente, agregue DNasa al tubo para evitar la aglomeración de las células y, por lo tanto, la obstrucción del clasificador. Las muestras también se pueden filtrar con un filtro estéril de 80 micras justo antes de la clasificación para evitar obstruir el clasificador.
	
</li>
	<li>Lleve las células al clasificador en hielo. Recoja las poblaciones celulares en tubos de centrífuga sin nucleasas de 2 ml con 0,5 ml de PBS estéril en cada tubo.</li>
	<li>Después de la clasificación, centrifugar las células a 300 x g durante 2 minutos a 4 ºC. Aspire la mayor parte del PBS y congele rápidamente las células en el congelador a -80 ºC hasta su posterior procesamiento para la extracción de ARN (ver 1 para más detalles del protocolo), la extracción de ADN (ver 2 para más detalles del protocolo) o la lisis celular para el análisis de proteínas.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Al igual que muchos otros tejidos y sistemas, el cerebro está compuesto por una población celular heterogénea que funciona en conjunto para afectar el comportamiento. El análisis de la expresión génica, la expresión de proteínas o las modificaciones epigenéticas de células individuales dentro de esa población heterogénea tiene el potencial de revelar información sobre la función del sistema en su conjunto, identificar los procesos celulares que regulan tanto el comportamiento normal como los procesos de enfermedad, y pro...

El propósito del protocolo descrito a continuación es aislar tipos de células individuales de una población heterogénea de tejido neural para el análisis posterior de la expresión génica específica del tipo de célula, la expresión de proteínas o incluso los marcadores epigenéticos. El cerebro se compone de muchos tipos de células que se derivan de distintas células progenitoras y que tienen propiedades y funciones específicas del tipo de célula. A pesar de estas diferencias, estos distintos tipos de células neuronales pueden expresar receptores y moléculas de señalización intracelular similares que hacen que el análisis de estas proteínas más ubicuas sea difícil de medir o interpretar de una manera específica para el tipo de célula utilizando métodos convencionales. Los neurocientíficos deben identificar la función y la activación de estos distintos tipos de células en el cerebro y cómo pueden afectar individualmente el comportamiento, ya que este será en última instancia el primer paso para identificar medicamentos más específicos y objetivos terapéuticos para enfermedades neurológicas y neuropsiquiátricas. A pesar de este objetivo general de la investigación en neurociencia, puede ser difícil aislar tipos de células neuronales individuales del cerebro para el análisis de la expresión de genes o proteínas, la activación de moléculas de señalización o la modificación de marcadores epigenéticos en el ADN. De las técnicas que se utilizan actualmente, la inmunohistoquímica puede identificar la expresión de proteínas de una manera específica del tipo de célula cuando se combina con la tinción adicional de un marcador específico del tipo de célula, aunque esto depende de anticuerpos específicos que pueden teñir adecuadamente las proteínas de interés y puede ser difícil de cuantificar. La hibridación in situ puede identificar la localización específica del ácido ribonucleico mensajero (ARNm) en células individuales del cerebro, pero este es un proceso laborioso que también limita el análisis conjunto de tipos celulares específicos y solo permite el análisis de uno o quizás unos pocos genes de interés. La microdisección de captura láser utiliza un láser para aislar subpoblaciones de células que se visualizan mediante microscopía; sin embargo, la naturaleza lenta de este proceso y el rendimiento relativamente bajo pueden limitar significativamente el análisis posterior de las proteínas o los niveles de ARNm, especialmente si la expresión de estas moléculas es baja para empezar. La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) es una técnica relativamente novedosa en el campo de la neurociencia para aislar tipos de células individuales del cerebro para su posterior análisis de la expresión génica1 y/o de las dianas epigenéticas2. Este proceso también se puede utilizar para clasificar tipos específicos de células neuronales para el análisis posterior de la expresión génica específica del tipo de célula, la expresión de proteínas o los marcadores epigenéticos. El FACS se ha utilizado en una serie de campos de investigación médica, como el cáncer y la inmunología, durante décadas para contar y clasificar diferentes células en función de características físicas o bioquímicas. Además, la citometría de flujo se ha utilizado clásicamente para analizar la expresión de proteínas por célula, utilizando anticuerpos específicos. El procedimiento que se describe a continuación aprovecha las técnicas clásicas de citometría de flujo para aislar tipos de células individuales para su posterior análisis de los criterios de valoración de la biología molecular. El citómetro de flujo puede analizar varios miles de células en un segundo, lo que lo convierte en una alternativa rápida y eficiente a las técnicas descritas anteriormente. Además, las células se pueden aislar en función de la expresión celular de una proteína específica (por ejemplo, un receptor de neurotransmisores) o una combinación de dos o más proteínas (colocalización de múltiples proteínas en un tipo de célula específico). Esto permite al usuario aislar tipos de células neuronales muy selectivos en función de sus propiedades moleculares para identificar su función en el cerebro.
Para realizar FACS, las células neuronales se preparan en una suspensión de una sola célula que se pasa a través de una célula de flujo que transporta y alinea las células para que pasen en fila india a través de un haz de luz y láseres para su análisis. Una computadora adquiere los datos de cada celda y los traza en un histograma para el análisis de los parámetros especificados (tamaño, granularidad y fluorescencia). Sobre la base de estos parámetros, las celdas se pueden clasificar inmediatamente en tubos separados para su recolección y posterior análisis de cualquier punto final deseado. El protocolo que se describe a continuación utiliza tres anticuerpos para clasificar las neuronas (utilizando un antígeno de timocitos 1, el anticuerpo Thy1), los astrocitos (utilizando un transportador glial de glutamato, el anticuerpo GLT1) y la microglía (utilizando un grupo de moléculas de diferenciación 11B, anticuerpo CD11b). Este protocolo se puede utilizar como se describe a continuación o modificado con diferentes anticuerpos dependiendo del tipo de célula que se desee aislar para sus propios experimentos.
Hay algunas advertencias a considerar al determinar si este protocolo es apropiado para experimentos específicos. Una advertencia importante puede referirse al tipo específico de célula que se desea aislar. En este protocolo, los tres anticuerpos que se utilizan son anticuerpos extracelulares, que permiten al experimentador mantener intactos los tipos de células durante el procedimiento de tinción, preservando así la integridad del ARN, el ADN y las proteínas en su interior. Es posible que uno desee aislar un tipo específico de célula neuronal utilizando un anticuerpo que identifica una proteína que solo se expresa dentro de esa célula en particular. Por ejemplo, se podría querer aislar neuronas dopaminérgicas usando un anticuerpo contra la tirosina hidroxilasa o aislar neuronas de acetilcolina usando un anticuerpo para la colina acetiltransferasa. Estas proteínas son intracelulares y, por lo tanto, requerirían fijación y permeabilización de la membrana celular para su posterior tinción con los anticuerpos adecuados. Si bien esto se ha hecho antes de 4,5, este proceso puede disminuir significativamente el rendimiento de ARN o ADN de estas células permeabilizadas. Otra advertencia puede ser que no todos los anticuerpos son apropiados para el FACS. Por ejemplo, actualmente se puede utilizar un anticuerpo que funciona muy bien para el western blot, una técnica que requiere la desnaturalización de las proteínas. Este anticuerpo puede no ser necesariamente adecuado para la identificación de estos tipos de células mediante FACS, dado que las proteínas no se desnaturalizan en ningún punto de este protocolo y, por lo tanto, es posible que el anticuerpo no tenga forma de unirse a su antígeno inherente. Las empresas proporcionan hojas de especificaciones que identifican las aplicaciones para las que se ha aprobado un anticuerpo. Si un anticuerpo no ha sido aprobado para la citometría de flujo, no debe disuadir a uno de probar este protocolo con un anticuerpo en particular; sin embargo, hay que tener en cuenta que no está garantizado que funcione para FACS. Una tercera advertencia de este protocolo tiene que ver con el número de células que se está tratando de aislar. FACS es una técnica excelente para producir la mayor cantidad posible de células incluso a partir de una pequeña pieza de tejido, pero también es posible que si se desea aislar una población relativamente escasa de células de una región cerebral relativamente pequeña, el rendimiento de un animal sea inherentemente bajo. En este caso, puede ser necesario agrupar el tejido cerebral de unos pocos animales en el mismo grupo de tratamiento para obtener el número de células necesario para el análisis posterior; sin embargo, una publicación reciente ha utilizado la preamplificación de ADNc dirigida a genes para el análisis posterior de la expresión génica de un pequeño número de neuronas activadas (5-6%) de un conjunto más grande de neuronas clasificadas, lo que indica que es posible analizar la expresión génica incluso de pequeños subconjuntos de células neuronales sin agrupar un gran número de animales6Una última advertencia de esta técnica es que uno debe tener acceso a un clasificador de células que no esté demasiado lejos. El clasificador de células es una máquina complicada que requiere una formación importante para poder utilizarla correctamente. Por lo tanto, estas máquinas a menudo son operadas por un técnico calificado en una instalación central. Además, el objetivo de este procedimiento es disociar el tejido neural, teñirlo para obtener anticuerpos específicos e inmediatamente llevar esas muestras a un clasificador en un corto período de tiempo (tal vez medio día). Este período de tiempo ayudará a aumentar la supervivencia y el rendimiento de las células aisladas y a mantener la integridad de las células para su posterior procesamiento y análisis. Si se cumplen todos estos parámetros descritos anteriormente, FACS es un método excelente para analizar la expresión específica del tipo celular de genes y proteínas del tejido neural.
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Delaware y la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

<table><tbody><tr><td>Kit de disociación neuronal (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Esferas de eliminación de mielina II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-733</td><td></td></tr><tr><td>LS Columnas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separador QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Lámina de malla de nailon</td><td>Amazon</td><td>CMN-0074-10YD</td><td>Malla de 40 pulgadas de ancho, tamaño de 80 micras</td></tr><tr><td>Fc Block / anti-CD32</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BDB550270 reactividad para ratas</td></tr><tr><td>Concuerpo CD11b conjugado con APC</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Reactividad 201809 para ratas</td></tr><tr><td>Conejo anti-GLT1</td><td>Novus Biologicals</td><td>Reactividad NBP1-20136</td><td>para ratas o humanos</td></tr><tr><td>anti-conejo conjugado con PE anticuerpo secundario</td><td>eBioscience</td><td>1037259</td><td>anticuerpo secundario anti-GLT1</td></tr><tr><td>anti-rata CD90 (Thy1) conjugado con FITC</td><td></td><td>Reactividad 202504 Biolegend para ratas</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

El cerebro se compone de cuatro tipos de células primarias incluyendo neuronas, astrocitos, microglia y oligodendrocitos. Aunque no son el tipo de célula más abundante en el cerebro, las neuronas son las más ampliamente estudiado de estos tipos de células dado su papel directo en impactando comportamientos. Otros tipos de células en el cerebro también afectar la función y el comportamiento neuronal a través de las moléculas de señalización que producen. Los neurocientíficos deben comprender las interacciones entre los tipos de células en el cerebro para entender mejor cómo estas interacciones afectan la función neuronal y la enfermedad. Hasta la fecha, el método más común de analizar la proteína o la expresión génica utiliza la homogeneización de muestras de tejidos enteros, generalmente con sangre, y sin tener en cuenta el tipo de célula. Este enfoque es un enfoque informativo para examinar los cambios generales en la expresión de genes o proteínas que pueden influir en la función y el comportamiento neural; sin embargo, este método de análisis no se presta a una mayor comprensión de la célula--tipo específica la expresión génica y el efecto de la comunicación de célula a célula en la función neural. Análisis de la epigenética de comportamiento ha sido un área de creciente interés que examina cómo las modificaciones del ácido desoxirribonucleico (ADN) estructura de impacto de la expresión génica a largo plazo y el comportamiento; sin embargo, esta información sólo puede ser relevante si se analiza de una manera específica del tipo de célula dado el linaje diferencial y marcadores epigenéticos que por lo tanto puede estar presente en ciertos genes de tipos de células neuronales individuales. La fluorescencia técnica de clasificación de células activadas (FACS) se describe a continuación proporciona una manera simple y eficaz para aislar las células neuronales individuales para el posterior análisis de la expresión génica, expresión de proteínas, o las modificaciones epigenéticas del ADN. Esta técnica también puede ser modificado para aislar tipos más específicos de células neuronales en el cerebro para el análisis específico del tipo celular subsiguiente.

La importancia del agotamiento de la mielina y la perfusión del tejido
Figura 1 muestra la importancia de la eliminación de mielina. La eliminación de mielina (pasos 5.1 a 5.12 del protocolo anterior) ocurre cuando la suspensión de células individuales se incuba con las perlas de eliminación de mielina, se lava y luego se pasa a través de la columna en el separador magnético. El propósito de estos pasos es reducir la cantidad de restos celulares presentes en cada muestra. Cuan...

El objetivo de este protocolo es utilizar la técnica de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para clasificar tipos específicos de células neuronales para su posterior análisis de la expresión génica específica del tipo de célula, marcadores epigenéticos y/o expresión de proteínas.

Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar tipos celulares neuronales individuales a partir de tejido cerebral para su posterior análisis. Esto se logra primero disociando el tejido neural en una suspensión de células individuales. En el segundo paso, se elimina la mielina de la suspensión y luego las células se tiñen con anticuerpos específicos para cada tipo celular.En el paso final, las poblaciones celulares individuales se separan mediante citometría de flujo. En última instancia, este método de aislamiento específico por tipo celular permitirá a los usuarios analizar cambios en la expresión génica o proteica o modificaciones epigenéticas de manera específica para cada tipo celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como qué tipos celulares expresan ciertos receptores, cuáles expresan ciertas proteínas y cuáles presentan ciertas modificaciones epigenéticas, con el fin de comprender mejor los mecanismos específicos de cada tipo celular en el cerebro.Comience la disociación neural utilizando hojas de bisturí estériles para cortar cada muestra obtenida de tejidos cerebrales adultos en pequeños fragmentos de entre 30 y 400

using-fluorescence-activated-cell-sorting-to-examine-cell-type

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra un método para aislar neuronas marcadas con fluorescencia del cerebro de un ratón.

Aislamiento de neuronas marcadas con fluorescencia de un cerebro murino

Este video muestra el procedimiento para aislar y clasificar núcleos de tejido cerebral humano recién congelado utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS), que permite el estudio de diferentes poblaciones celulares para diversas aplicaciones neurológicas.

Aislamiento de poblaciones celulares del tejido cerebral mediante la clasificación de núcleos activados por fluorescencia

Este video muestra un protocolo para aislar células de hipocampos de ratas, incluyendo neuronas, astrocitos y microglía.

Obtención de varias poblaciones de células neuronales a partir de un hipocampo de ratas

Este video muestra la disociación de tejido cerebral de rata congelado en una suspensión de una sola célula utilizando digestión enzimática y trituración mecánica. Las células preparadas se fijan y permeabilizan con etanol para aplicaciones posteriores como la citometría de flujo o el análisis de expresión génica.

Obtención de una suspensión unicelular a partir de tejido cerebral de rata congelado

Source: Kimmelmann-Shultz, B., et. al. Uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteínas en el cerebro de roedores. J. Vis. Exp. (2019) Este video demuestra un método de escaneo de alta resolución y fluorescencia de infrarrojo cercano para medir la expresión de proteínas en el cerebro de los roedores.

Medición de la expresión de proteínas en el cerebro de roedores mediante fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución 

La expresión de genes de un subconjunto de células en un tejido específico representa un reto importante. En este artículo se describe cómo aislar el ARN total de alta calidad a partir de una población de células específicas mediante la combinación de un método immunolabeling rápida con láser captura microdissection.

Aislamiento de ARN a partir de células subpoblaciones específicas utilizando láser captura Microdissection Combinado con Rapid Immunolabeling

Reportamos un método basado en la Clasificación de Células Activadas Fluorescentes (FACS) para aislar células madre neurales (NSCs) y su progenie de la zona subventricular (SVZ) del cerebro de ratón adulto. Aplicado a ratones transgénicos Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), permite el estudio de la progresión del ciclo celular mediante imágenes en vivo.

Clasificación celular del Neuronales madre y progenitoras Las células del adulto Ratón zona subventricular y Live-imágenes de sus Dinámica del Ciclo Celular

Aquí se presenta un protocolo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para estudiar las alteraciones moleculares en Fos-expresión de conjuntos neuronales a partir de tejido cerebral en fresco y congelados. El uso de tejido congelado permite el aislamiento FACS de muchas áreas del cerebro a través de múltiples sesiones para maximizar el uso de sujetos animales valiosos.

La fluorescencia de células activadas (FACS) y análisis de expresión génica de las neuronas que expresan Fos-Fresco y de tejido congelado de cerebro de rata

Aquí, presentamos un protocolo que utiliza colorantes de infrarrojo cercano junto con inmunohistoquímica y escaneo de alta resolución para analizar las proteínas en las regiones cerebrales.

Uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteína en el cerebro de roedores

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) es una poderosa herramienta para estudiar el papel de la proteína translocadora de 18 kDa o la expresión del receptorserotonina 5HT 2A en la enfermedad de Alzheimer a escala celular. Este protocolo describe la aplicación ex-vivo de FACS-RTT en el modelo de rata TgF344-AD.

Clasificación celular activada por fluorescencia-tejido tratado con radioligando (FACS-RTT) para determinar el origen celular de la señal radiactiva

Aquí se presenta un método para secuenciar núcleos individuales aislados del giro dentado de ratón que excluye la mayoría de las neuronas a través de la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FAN). Este enfoque genera perfiles de expresión de alta calidad y facilita el estudio de la mayoría de los otros tipos de células representadas en el nicho, incluidas las poblaciones escasas, como las células madre neurales.

Clasificación negativa de neuronas de núcleos activados por fluorescencia combinada con secuenciación de ARN de núcleos únicos para estudiar el nicho neurogénico del hipocampo

Aprende a aislar tipos celulares neuronales específicos de tejido cerebral mediante clasificación por citometría de flujo. Este método permite analizar expresión génica y modificaciones epigenéticas en poblaciones celulares específicas de rata.

Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata (Video) | JoVE Journal

Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

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