Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

El objetivo general de este procedimiento es aislar tipos individuales de células neuronales del tejido cerebral para su posterior análisis. Esto se logra disociando primero el tejido neural en una suspensión de una sola célula. En el segundo paso, la mielina se elimina de la suspensión y luego las células se tiñen para obtener anticuerpos específicos del tipo celular.

En el paso final, las poblaciones celulares individuales se clasifican por citometría de flujo. En última instancia, este método de aislamiento específico del tipo de célula permitirá a los usuarios analizar los cambios en la expresión de genes o proteínas o las modificaciones epigenéticas de una manera específica del tipo de célula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como qué tipos de células expresan ciertos receptores, cuáles expresan ciertas proteínas y cuáles expresan ciertas modificaciones epigenéticas para que podamos comprender mejor los mecanismos específicos del tipo de célula en el cerebro.

Comience la disociación neuronal usando hojas de afeitar estériles para cortar cada muestra recolectada de tejidos cerebrales adultos en pequeños trozos de 30 a 400 miligramos en la tapa de una placa de cultivo de seis pocillos. A continuación, sumerja el tejido en un mililitro de HBSS libre de calcio y magnesio y utilice una pipeta para transferir las muestras a tubos de centrífuga estériles de dos mililitros cuando se hayan recogido todos los tejidos. Centrifugar las muestras y aspirar los sobrenadantes.

Agrega 1,900 microlitros de enzima tibia. Mezcle uno e incube las muestras durante 15 minutos. En un baño de agua a 37 grados centígrados, invirtiendo el tubo varias veces cada cinco minutos para volver a suspender los trozos de tejido asentados.

Al final de la incubación, agregue 30 microlitros de enzima recién preparada. Mezcle dos en cada muestra e invierta suavemente los tubos. Luego, usando una pipeta de plagas etiquetada como una, disocie cada muestra con 30 iteraciones hacia arriba y hacia abajo.

Teniendo cuidado de evitar que se generen burbujas. Incubar las muestras durante otros 15 minutos a 37 grados centígrados con inversión cada cinco minutos, seguido de la disociación de las muestras con pipeta de plagas. Número dos, como se acaba de demostrar.

Luego cambie a la pipeta número tres, repita la disociación e incube las muestras durante 10 minutos más. En el baño de agua con inversión cada cinco minutos al final del filtro de incubación, la célula única se suspende a través de filtros de celdas de 80 micras en tubos Falcon de 15 mililitros. Lavar cada colador con 10 mililitros de HBSS libre de calcio y magnesio para detener las reacciones enzimáticas cuando se ha filtrado la última muestra, girar los tubos y aspirar los sobrenadantes para agotar la mielina de la célula.

Las suspensiones resuspenden completamente los gránulos en 400 microlitros de tampón de eliminación de mielina y agregan la cantidad adecuada de perlas de eliminación de mielina a cada tubo. Pipetea las soluciones hacia arriba y hacia abajo hasta que las células y las perlas estén completamente mezcladas. A continuación, incubar la muestra a cuatro grados centígrados durante 15 minutos.

Después de la incubación, lave cada muestra en cinco mililitros de tampón de eliminación de mielina mientras las células están girando, coloque una columna para cada muestra en el campo magnético de un clasificador magnético y coloque un filtro limpio de 80 micras encima de cada columna. Enjuague cada filtro y columna con un mililitro de tampón de eliminación de mielina tres veces, recogiendo todo el flujo en un contenedor de residuos. Después del enjuague final, coloque tubos de fondo redondo de poliestireno de cinco mililitros directamente debajo de cada columna para recoger el eluido.

A continuación, aspire el supernombre de las muestras y vuelva a suspender los gránulos en 500 microlitros de tampón de eliminación de mielina. Aplique inmediatamente las suspensiones celulares a las columnas, recogiendo las células en los tubos de abajo. A continuación, enjuague cada filtro y columna cuatro veces con un mililitro de eliminación de mielina, tampón por lavado.

Después del último lavado, centrifugar las células y aspirar los sobrenadantes para teñir las células y clasificarlas por citometría de flujo. Agite cada muestra durante unos dos segundos para disociar los gránulos y transferir un microlitro de células de cada tubo a tubos individuales. Para los controles de tinción, agregue inmediatamente cinco microlitros de bloque FC a cada tubo, incluidos los controles de tinción.

A continuación, vuelve a vorexizar las muestras e incubarlas a cuatro grados centígrados. Después de cinco minutos, agregue 100 microlitros del cóctel de anticuerpos primarios apropiado. Cubra los tubos para proteger los anticuerpos de la luz e incube las células a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.

Al final de la incubación, lavar las muestras en dos mililitros de tampón de lavado, luego aspirar los sobrenadantes y etiquetar cada muestra con 100 microlitros del anticuerpo secundario apropiado. Cubre los tubos y colócalos a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, lave las muestras en dos mililitros de tampón de lavado, centrifugar las muestras y, a continuación, aspirar.

Los sobrenadantes Resus, suspenden los gránulos en 250 microlitros de PBS estéril y clasifican las células aquí flujo representativo clasificadas poblaciones de células neuronales de un solo hipocampo masculino se muestran las células se cerraron primero de todos los eventos posibles en función de sus propiedades de dispersión hacia adelante y hacia los lados. A continuación, las células individuales o singletes se separaron de cualquier doblete o grupo más grande de células en función de su tamaño para permitir una clasificación precisa de los tipos de células individuales, las células individuales se clasificaron en poblaciones de células CD 11, B positivas y CD 11 B negativas con una clasificación adicional de las células CD 11 B negativas en células GT uno y TH one positivas. A continuación, se utilizó el programa de análisis para determinar el número total de eventos en cada población, así como el porcentaje de las poblaciones parentales para confirmar la pureza de las células clasificadas.

En este ejemplo en particular, se analizó la expresión génica relativa de genes específicos de un tipo de célula alternativa mediante PCR en tiempo real. Como se esperaba, estos datos confirmaron la pureza de las células clasificadas, así como identificaron algunas diferencias interesantes entre las regiones cerebrales investigadas. Tras la confirmación de la pureza del tipo, se puede medir la expresión de otros genes de interés para determinar el tipo celular específico en el que se expresan, o si su expresión se altera después del tratamiento de una manera específica para el tipo de célula.

Por ejemplo, aquí se investigó la expresión de la unión de vacas, una proteína de unión al calcio que se utiliza a menudo para identificar neuronas en el hipocampo y el cerebelo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar tipos específicos de células neuronales de interés, como la célula neuronal que se muestra aquí, utilizando anticuerpos de superficie celular apropiados.