Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar las asociaciones entre subpoblaciones celulares específicas en la médula ósea. Esto se logra primero recolectando secciones criohistológicas de tumores de fémures de ratón. En el segundo paso, las secciones se tiñen para análisis de inmunofluorescencia y se obtienen imágenes confocales.

Las imágenes se analizan luego digitalmente. En última instancia, se pueden simular las posiciones de los diferentes tipos celulares para calcular las tasas y la frecuencia de contacto entre las células inmunológicas específicas de interés y su microentorno. Tuvimos por primera vez la idea de este método al analizar nichos microambientales para células plasmáticas de larga duración en la médula ósea, y surgió la necesidad de un método que permitiera cuantificar sin ambigüedades las asociaciones celulares dentro del tejido de la médula ósea.

RA Maya demostrará el procedimiento para usted para aspirar por criogenia huesos femorales de un ratón adulto. Primero, configure la temperatura de la muestra y de la cuchilla de un microtomo estándar equipado con una cuchilla para tejidos duros a menos 24 grados Celsius. Después de un aclimatación de 15 minutos.

Fije un bloque de muestra al soporte metálico para muestras con medio de inclusión criogénico y ajuste la orientación del bloque según sea necesario. Recorte la muestra hasta que el hueso quede completamente expuesto y la médula sea visible. Luego, ajuste un grosor de corte a siete micrómetros.

A continuación, fije un trozo de cinta adhesiva de Kawamoto con el lado pegajoso hacia arriba sobre un bloque de muestra utilizando una espátula de madera recubierta de cuero. Seccione la muestra con pinzas. Gire la cinta de modo que el corte quede situado en el lado superior. Luego, transfiera la cinta a un portaobjetos de vidrio para microscopio.

Fije la cinta a la portaobjetos con cinta adhesiva cuando se haya recolectado la última sección. Deje secar las muestras durante al menos 30 minutos y almacene las portaobjetos a menos 80 grados Celsius. Dos mujeres imaginan las muestras tiñendo las secciones criogénicas descongeladas según protocolos comunes de inmunofluorescencia.

Asegurándose de incluir un colorante nuclear para visualizar la integridad del tejido. Después de teñir los cortes, añada una gota de medio de montaje para portaobjetos a cada muestra, seguida de una cubreobjetos de vidrio número uno en un microscopio confocal de barrido láser. Seleccione el objetivo de 20 x y configure un campo de visión de 708,15 por 708,15 micrones.

Luego, obtenga imágenes de las muestras una a la vez con una resolución de 2048 por 2048 píxeles por imagen para mantener los resultados comparables. Registre las imágenes en un canal para visualizar las estructuras estromales, un canal para los núcleos y canales adicionales para las células hematopoyéticas de interés según sea necesario. Adquiera las imágenes utilizando promedio de líneas.

Capturando idealmente imágenes individuales adyacentes para cubrir toda la sección femoral. Luego guarde las imágenes en un formato de archivo de imagen microscópica. A continuación, exporte un archivo JPEG por canal para cada área capturada, y utilice una herramienta de análisis de imagen para realizar la cuantificación de la segmentación de imagen, el análisis de colocalización y de vecindad antes de ejecutar las simulaciones de la célula aleatoria.

Colocación en las imágenes de médula ósea analizadas para cada imagen que se va a simular. Coloque los siguientes archivos en una sola carpeta: los archivos CSV individuales proporcionados por la herramienta de contacto celular. Los archivos JPEG originales del canal de DPI y los archivos JPEG originales del canal estromal para realizar simulaciones por lotes en la serie de imágenes provenientes de una única muestra femoral; transfiera en este momento todos los archivos JPEG originales y sus archivos CSV individuales correspondientes a otra carpeta también.

Cuando todos los archivos estén ensamblados, inicie la herramienta de simulación. Luego, marque la casilla de cargar automáticamente los datos de imagen. Al marcar esta opción, los archivos CSV correspondientes a las imágenes analizadas se abren automáticamente.

A continuación, ingrese la etiqueta común para los archivos CSV y el número de conjuntos de imágenes que se utilizarán para la simulación en modo por lotes. Luego cargue el archivo JPEG generado a partir del canal S estroma con un nombre de archivo que finalice en tres para generar la máscara para el canal DPI. Marque la casilla aplicar máscara y establezca el umbral para convertir la imagen DPI en una máscara binaria en 0,10.

Marque las casillas de ocho bits y dilatación, y establezca el grado de dilatación en cinco píxeles. Luego, marque la casilla de erosión de ancho. A continuación, introduzca el valor deseado para el radio de vecindad utilizado en el análisis de las imágenes simuladas, y marque la casilla usar OSU para emplear el algoritmo OSU en la detección automática de las estructuras estromales de las células hematopoyéticas.

Simuladas como formas circulares. Mida la distribución del tamaño celular de los tipos celulares analizados con cualquier software de análisis de imágenes que incluya funciones adecuadas de segmentación de objetos, y determine la sigma para todos los tipos hematopoyéticos a partir de estas mediciones. Puede determinarse el umbral de tamaño celular, que es el diámetro en píxeles que describe el objeto más pequeño aún reconocido como célula completa por la herramienta de análisis de imágenes.

Luego ingrese el valor umbral de tamaño celular y la sigma en píxeles para la simulación de la distribución de tamaño de células para las células rojas, verdes y azules. A continuación, en la pestaña de células y máscara, marque la casilla de eliminación para permitir que el programa elija una nueva posición para una célula si se superpone con al menos un píxel dentro de un área prohibida de la máscara. En la pestaña de exclusión celular, active también la opción de evitar superposición de células.

Luego, ingrese la distancia mínima permitida entre los centros de dos células en píxeles. Si el solapamiento se define por la distancia mínima desde el centro de una célula hasta el centro de otra, establezca el área máxima de solapamiento en 100 %. A continuación, configure la herramienta de simulación en 1000 repeticiones. Luego, marque la casilla de auto guardado para guardar las coordenadas de los objetos simulados para todas las repeticiones de cada imagen del lote como archivos de texto en formato de texto sin formato.

Introduzca también una etiqueta común para los archivos guardados. Finalmente, haga clic en ejecutar la simulación y determine las frecuencias promedio de contacto y proximidad de los conjuntos de 1000 imágenes simuladas correspondientes a cada imagen registrada. Para ello, divida los recuentos promedio de contacto y proximidad por el número de células registradas por imagen, y compare las frecuencias con los resultados del análisis automatizado de colocalización de la imagen registrada.

En esta figura, se presenta un análisis de localización de eosinófilos, células plasmáticas y células B con el microentorno de células estromales mediante médula ósea quimérica fluorescente. Los archivos CSV generados por las herramientas de contacto celular y proximidad contienen el recuento de células y el área total para cada población celular en píxeles, así como los recuentos de contacto o proximidad. Antes de realizar una simulación del posicionamiento celular aleatorio, es necesario determinar los parámetros que describen la distribución del tamaño celular como una distribución gaussiana; en esta simulación, se mantuvieron los valores relativos de la sigma medidos para las tres poblaciones celulares.

Aunque los valores de Sigma definidos en píxeles se ajustaron para que coincidieran con la apariencia visual de las células registradas y así definir las áreas donde pueden ubicarse las células, se generó una máscara a partir del canal DAPI. Luego, se determinó que un valor de 10 era el umbral de densidad óptimo para generar las imágenes binarias. A continuación, se evaluó la relevancia de los contactos de las células plasmáticas, eosinófilos o células B con las células estromales, tal como se esperaba.

Estos análisis revelaron tasas de contacto significativamente más altas en las imágenes registradas en comparación con la simulación para las células plasmáticas y las células B. En contraste, no se observó una diferencia clara en el contacto entre eosinófilos y células estromales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en cualquier campo que requiera el análisis de la estructura tisular compleja de la médula ósea, como la inmunología, la hematología, la patología o la biología de células madre.