Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar las asociaciones entre subconjuntos celulares específicos en la médula ósea. Esto se logra recolectando primero secciones criogénicas histológicas de tumores de fémures de ratón. En el segundo paso, las secciones se tiñen para el análisis inmunofluorescente y se adquieren imágenes confocal.

A continuación, las imágenes se analizan digitalmente. En última instancia, se pueden simular las posiciones de los diferentes tipos de células para calcular las tasas y la frecuencia de contacto entre las células inmunológicas específicas de interés y su microentorno. Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando estábamos analizando nichos microambientales para células plasmáticas de larga vida en la médula ósea, y necesitábamos un método para cuantificar sin ambigüedades las asociaciones celulares dentro del tejido de la médula ósea.

RA Maya le demostrará el procedimiento para criosucción de huesos femorales de un ratón adulto. En primer lugar, configure la temperatura de la muestra y de la cuchilla de un micrótomo estándar equipado con una cuchilla de tejido duro a 24 grados centígrados negativos. Después de una aclimatación de 15 minutos.

Fije un bloque de muestra al portamuestras metálico con medio de crioinclusión y ajuste la orientación del bloque según sea necesario. Recorte la muestra hasta que el hueso esté completamente abierto y la médula sea visible. A continuación, ajuste el grosor de una sección a siete micras.

A continuación, fije un trozo de cinta adhesiva kawamoto con el lado adhesivo en la parte superior de un bloque de muestra con una espátula de madera cubierta de cuero y corte la muestra y con pinzas. Gire la cinta de modo que la sección quede en la parte superior. A continuación, transfiera la cinta a un portaobjetos de microscopio de vidrio.

Fije la cinta al portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva cuando se haya recogido la última sección. Deje que las muestras se muevan durante al menos 30 minutos y almacene los portaobjetos a menos 80 grados centígrados. Dos mujeres toman imágenes de las muestras para teñir las secciones criogénicas descongeladas de acuerdo con los protocolos comunes de inmunofluorescencia.

Asegurándose de incluir una tinción nuclear para visualizar la integridad del tejido. Después de que las secciones se hayan teñido, agregue una gota de soporte de piso a cada muestra, seguida de un deslizamiento de cubierta de vidrio número uno en un microscopio confocal de escaneo láser. Seleccione la lente del objetivo de 20x y establezca una vista de campo de 708 punto 15 por 708 punto 15 micras.

A continuación, tome imágenes de las muestras una a la vez a 2048 por 2048 píxeles por imagen para mantener los resultados comparables. Grabación de las imágenes en un canal para visualizar las estructuras estromales, un canal para los núcleos y canales adicionales para las células hematopoyéticas de interés, según sea necesario. Grabe las imágenes utilizando el promedio de líneas.

Lo ideal es capturar imágenes adyacentes individuales para cubrir toda la sección femoral. A continuación, guarde las imágenes en un formato de archivo de imagen de microscopía. A continuación, exporte un archivo JPEG por canal para cada área de la que se tenga una imagen y utilice una herramienta de análisis de imágenes para realizar la cuantificación de la segmentación de imágenes de la colocalización y el análisis de vecindad antes de ejecutar las simulaciones de la celda aleatoria.

Posicionamiento en las imágenes de médula ósea analizadas para cada imagen a simular. Coloque los siguientes archivos en una sola carpeta, los archivos CSV individuales proporcionados por la herramienta de contacto de celda. Los archivos JPEG del canal DPI original y los archivos JPEG del canal estromal original para realizar simulaciones por lotes en la serie de imágenes de una sola muestra femoral para transferir todos los archivos JPEG originales y sus archivos CSV individuales correspondientes a otra carpeta en este momento también.

Cuando todos los archivos estén ensamblados, inicie la herramienta de simulación. A continuación, marque la casilla de carga automática de datos de imagen. Con esta opción marcada, los archivos CSV correspondientes a las imágenes analizadas se abren automáticamente.

A continuación, introduzca la etiqueta común para los archivos CSV y el número de conjuntos de imágenes que se deben utilizar para la simulación en modo por lotes. A continuación, cargue el archivo J peg generado a partir del canal S stroma con un nombre de archivo que termine en tres para generar la máscara para el canal DPI. Marque la casilla aplicar máscara y establezca el umbral para convertir la imagen PPP en una máscara binaria en 10.

Marque las casillas de ocho bits y dilatación y establezca el grado de dilatación en cinco píxeles. A continuación, marque la casilla de erosión de la anchura. A continuación, introduzca el valor deseado para el radio de vecindad utilizado para el análisis de las imágenes simuladas y marque la casilla Usar OSU para utilizar el algoritmo OSU para la detección automática de las estructuras estromales de las células hematopoyéticas.

Simuladas como formas circulares. Mida la distribución del tamaño de celda de los tipos de células analizados con cualquier software de análisis de imágenes que incluya las funciones de segmentación de objetos adecuadas y determine el sigma para todos los tipos hematopoyéticos a partir de estas mediciones. Se puede determinar el límite del tamaño de celda, es decir, el diámetro en píxeles que describe el objeto más pequeño que la herramienta de análisis de imágenes aún reconoce como la celda completa.

A continuación, introduzca el límite del tamaño de celda y el sigma en píxeles para la simulación de la distribución del tamaño de celda para las celdas roja, verde y azul. A continuación, en la pestaña celdas y máscara, marque la casilla Eliminar para permitir que el programa elija una nueva posición para una celda si se superpone con al menos un píxel dentro de un área prohibida de la máscara. En la pestaña Exclusión de celdas, marque también la casilla Evitar superposición de celdas.

A continuación, introduzca la distancia mínima permitida entre los centros de dos celdas en píxeles. Si la superposición está definida por la distancia mínima desde el centro de una celda hasta el centro de otra, establezca el área máxima de superposición en 100%Luego establezca la herramienta de simulación en 1000 repeticiones. A continuación, marque la casilla de ventas de guardado automático para guardar las coordenadas de los objetos simulados para todas las repeticiones de cada imagen del lote como archivos destruidos en formato de texto.

Introduzca también una etiqueta común para los archivos guardados. Por último, haga clic en ejecutar simulación y determine las frecuencias medias de contacto y proximidad de los conjuntos de 1000 imágenes simuladas correspondientes a cada imagen grabada. Para esta división, el contacto promedio y la proximidad se cuenta por el recuento de células registradas por imagen, y compara las frecuencias con los resultados del análisis de colocalización automatizado de la imagen grabada.

En esta figura, se presenta un análisis de localización de eosinófilos, células plasmáticas y células B con el microambiente de células estromales con médula ósea quimérica fluorescente. Los archivos CSV generados por las herramientas de contacto de celda y vecindad contienen el recuento de celdas y el área total de cada población de celdas en píxeles, así como los recuentos de contactos o proximidades. Antes de realizar una simulación del posicionamiento aleatorio de celdas, se deben determinar los parámetros que describen la distribución del tamaño de las celdas como una distribución gaussiana, en esta simulación se mantuvieron los valores relativos del sigma medido para las tres poblaciones de celdas.

Mientras que los valores Sigma definidos en píxeles se establecieron para que coincidieran con la apariencia visual de las celdas registradas para definir las áreas donde se pueden colocar las celdas, se generó una máscara a partir del canal DAPI. A continuación, se determinó que un valor de 10 era el umbral de densidad óptimo para generar las imágenes binarias. A continuación, se comprobó la relevancia de los contactos de las células plasmáticas, eosinófilos o células B con las células estromales, como se esperaba.

Estos análisis revelaron tasas de contacto significativamente más altas en las imágenes grabadas en comparación con la simulación para las células plasmáticas y las células B. Por el contrario, no se observaron diferencias claras en el contacto de las células estromales eosinófilas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en cualquier campo que requiera el análisis de la compleja estructura tisular de la médula ósea, como la inmunología, la hematología, la patología o la biología de las células madre.