Un método para la selección de aptámeros Estructura de conmutación Aplicado a una de nanopartículas de oro ensayo colorimétrico

El objetivo general del siguiente experimento es generar apti de conmutación de estructura para su integración como elementos de reconocimiento en plataformas de detección que funcionan señalando un cambio en la confirmación de aptámeros al vincularse al objetivo. Esto se logra mediante la adición de una sonda de captura biotinilada y una biblioteca de ADN complementaria a las perlas magnéticas recubiertas de estreptococos tabin para inmovilizar la biblioteca de ADN en la superficie de la perla. A continuación, se aplica un imán a la solución para dividir las secuencias de unión de las secuencias no vinculantes que quedan en las cuentas.

A continuación, las secuencias retenidas se purifican y amplifican para la siguiente ronda de selección. Después de algunas rondas de selección, se agrega un paso de selección negativo al proceso. Después de varias rondas de selección, el aptr seleccionado demuestra un cambio estructural en la unión del objetivo basado en un ensayo de detección de objetivos de nanopartículas de oro.

La ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes, como la celda X basada en solución, es que no tenemos que inmovilizar el objetivo a un soporte sólido. Por lo tanto, las implicaciones de esta técnica están en la evaluación del riesgo del estado fisiológico de un individuo, y se debe al hecho de que el cortisol es un indicador de estrés, lo que puede llevar a la evaluación de los problemas de salud. Utilice siempre soluciones de ADN recién preparadas para este protocolo, específicamente para el objetivo y el control.

La preparación del ADN requiere una atención especial. Transfiera una alícuota de 100 microlitros de la biblioteca de ADN a un tubo termociclador y caliéntelo a 95 grados centígrados durante cinco minutos en un termomezclador. Luego transfiera el tubo a hielo hasta que sea necesario antes de usar este ADN, determine su concentración exacta en un espectrofotómetro.

A continuación, prepare las perlas magnéticas, perlas magnéticas codificadas por estrepto de vórtice y transfiera 400 microlitros de ellas a un nuevo tubo de microcentrífuga. Coloque este tubo en el imán durante dos minutos y retire el sobrenadante, luego lave las cuentas. Añade 400 microlitros de tampón aglutinante y vórtalos para completar el lavado.

Use un imán para separar las cuentas y deseche el sobrenadante. Repite este proceso de lavado tres veces. A continuación, inmovilice la sonda de captura en las perlas magnéticas.

Comience por Resus suspendiendo las perlas y 400 microlitros de tampón de unión con sonda de captura de 50 micromolares. A continuación, incubar las perlas durante 10 minutos con una suave agitación a temperatura ambiente. Para retirar la sonda de captura libre, lave las perlas tres veces más que antes, utilizando 400 microlitros de tampón aglutinante por lavado.

Después de los tres lavados, agregue otros 400 microlitros de tampón y recoja 100 microlitros de solución de perlas para los pasos restantes mientras guarda el resto a cuatro grados centígrados. El resto se puede utilizar para las siguientes rondas de selección durante un máximo de tres semanas. Cuando se necesitan más cuentas, se pueden preparar con sondas más largas para aumentar la rigurosidad en este esquema de selección.

Por ejemplo, se utilizaron sondas más largas después de la ronda 13, momento en el que se ha logrado un enriquecimiento significativo utilizando otras rigurosidades. Cuando utilice cuentas tomadas del almacenamiento, comience lavando la alícuota de trabajo dos veces, utilizando 200 microlitros de tampón aglutinante por lavado. De lo contrario, las cuentas recién hechas ya están limpias.

Ahora agregue 100 microlitros de ADN frío a las perlas y archívelas durante media hora a temperatura ambiente con una suave agitación. Después de la incubación, aísle las perlas antes de desechar el sobrenadante. Calcule la concentración de ADN que contiene para determinar la cantidad de ADN unido a las perlas.

A continuación, lave las cuentas tres veces con 200 microlitros de tampón aglutinante. Deje que el tampón aglutinante lave las cuentas con una agitación suave durante cinco minutos cada vez. A continuación, prepare la molécula objetivo en un tampón de unión a 100 micromolares y vuelva a suspender las perlas en 200 microlitros de esta preparación, la molécula objetivo.

En este caso, el cortisol suele estar muy concentrado en la primera ronda de selección. Incubar las perlas con el objetivo durante media hora con una agitación suave en condiciones ambientales. Después de la incubación, guarde el snat que contiene las secuencias objetivo aludidas.

Después de cada otra ronda de enriquecimiento, tome una muestra del sobrenadante final para monitorear el proceso. Eliminar el cortisol del sobrenadante mediante diálisis. Esto se puede omitir si la molécula objetivo no interfiere con la medición de la absorbancia del ADN a 260 nanómetros después de cada ronda, amplifique el ADN de unión al objetivo por PCR utilizando el sobrenadante recolectado del paso de selección positiva como plantilla.

Preliminarmente, siempre ejecute una pequeña prueba de PCR para determinar el número óptimo de amplificaciones. Tome muestras de 10 microlitros después de cada ciclo y compare las muestras con una escalera de 25 pares de bases. Aquí, la biblioteca debe ejecutarse a 85 pares de bases sobre productos amplificados que se ven después del décimo ciclo, por lo que se deben usar menos ciclos.

Este resultado puede variar de una ronda a otra, por lo que siempre es necesaria una prueba. A continuación, realice una PCR a gran escala utilizando el número seleccionado de ciclos utilizando ocho tubos de tira. Amplifique de seis a ocho mililitros de mezcla de reacción para obtener la cantidad requerida de amplicón para la siguiente ronda de selección, que es entre uno y 2,5 nanomoles de ADN.

Verifique una muestra de los productos de PCR con un gel. A continuación, convierta la mayor parte de los productos en ADN monocatenario utilizando perlas recubiertas de estreptococos no magnéticos. Cargue 300 microlitros de perlas en una pequeña columna bloqueada por fritz.

Luego, con una jeringa de bloqueo de señuelo, lave suavemente las cuentas con cinco mililitros de tampón aglutinante. Al cambiar la solución para lavar la columna, retire la jeringa de la columna y retire el émbolo de la jeringa. Esto evita la alteración innecesaria de las cuentas.

Cree y lave suficientes columnas de cuentas para un mililitro de producto PCR por columna. Pase un producto de PCR a través de las columnas con una presión suave. Los productos de ADN serán retenidos por las perlas unidas por sus hebras antisentido.

A continuación, lavar las columnas unidas al ADN con cinco mililitros de tampón de unión para eliminar todos los componentes de la PCR, dejando sólo el grupo de unión al ADN para deshibridar el ADN de la columna y añadir 0,5 mililitros de hidróxido de sodio 0,2 molar. A continuación, desala el ADN monocatenario en el eit utilizando una columna de desalinización preparada con agua libre de nucleasas. Deseche los 0,5 mililitros iniciales de flujo.

A continuación, pase un mililitro de agua libre de nucleasas a través de la columna para recoger el ADN desalado. Mida la absorbancia del ADN recolectado y prepárelo para la siguiente ronda de selección. Como se describe en el protocolo de texto, el ADN monocatenario recolectado ahora se agrega nuevamente a una alícuota de cuentas recién preparadas con sonda de captura.

La segunda ronda de selección es similar a la primera con una menor concentración de cortisol empleada. Sin embargo, a partir de la tercera ronda, incorpore un paso de selección negativa antes de la selección positiva. Para la primera ronda de selección negativa, agregue 200 microlitros de un micromolar de progesterona en tampón de unión a las cuentas.

Es estructuralmente similar pero distinto del cortisol. En las rondas siguientes, aumente la concentración de progesterona después de agitar suavemente la mezcla durante media hora a temperatura ambiente. Deseche el supinato y lave las perlas dos veces con 200 microlitros del tampón aglutinante.

A continuación, proceda con la selección positiva. Como se describió anteriormente, a medida que avanzan las rondas, la concentración del sustrato varió para afectar la rigurosidad del proceso de selección. Los detalles se discuten en el protocolo de texto.

A continuación, siga el protocolo de texto para realizar el ensayo de nanopartículas de oro para la detección de cortisol. Esta lectura métrica de color rápida y sencilla se basa en un cambio estructural del aptámero al encuadernar el objetivo. Por lo tanto, proporciona una métrica para evaluar la capacidad del método para seleccionar abers con propiedades de cambio de estructura.

Otra ventaja del ensayo de nanopartículas de oro es que amplifica una señal tal que un aptámero de afinidad micromolar común a moléculas pequeñas se puede detectar a niveles de órdenes de magnitud más bajos que la constante de disociación. Se utilizó el siguiente protocolo de selección para aislar los abers específicos de cortisol. La diálisis y el monitoreo del enriquecimiento se utilizaron para mostrar un aumento de la elución de la molécula diana después de etapas posteriores de selección.

Se observó una disminución en la elución cuando se utilizaron menos moléculas objetivo y sondas de captura más largas en los pasos finales. Se utilizó la secuenciación de próxima generación para analizar el ADN eludido después de varias rondas diferentes. Al principio de la sexta ronda de selección, un bajo porcentaje de las secuencias había aumentado el número de copias, que se clasificó en 20 contenedores después de 13 rondas.

Un porcentaje mucho mayor de los abers tenían un alto número de copias. Luego, haciendo más estricto el proceso de selección. En las rondas 14 y 15, casi la mitad de los abers seleccionados estaban en el primer rango de frecuencia de número de copias.

Había alrededor de 3000 secuencias únicas en 30.000 ejecuciones en este punto. El AP seleccionado se incubó con nanopartículas de oro, seguido de la adición de sustratos objetivo o, para comparación, de control. Este ensayo mostró que el PA tenía más especificidad para el cortisol que para el ácido cólico o para el ácido cólico.

Es importante controlar la rigurosidad de la selección en cada ronda, así como optimizar el número de ciclos de PCR. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo seleccionar un AP de conmutación de estructura y realizar un ensayo de detección de nanopartículas de oro.