Una técnica de tinción diferencial Tiempo Junto con Full Bilateral Gill Desnervación para estudiar Ionocytes en Fish

El objetivo general de este procedimiento es investigar la proliferación de citos braquiales en las branquias de peces dorados, que carecen de inervación extrínseca. Esto se logra colocando primero al pez en un baño de tinte específico para mitocondrias para teñir las mitocondrias preexistentes, los citos braquiales ricos. El segundo paso es realizar una denervación bilateral completa de las branquias.

A continuación, se sacrifica a los peces. Se cosechan las branquias. Los citos se marcan utilizando un anticuerpo contra el potasio sódico en los TPA.

Luego, el paso final es obtener imágenes y contar los citos preexistentes y recién diferenciados. En última instancia, esta técnica de tinción diferencial con denervación de gremio bilateral se utiliza para mostrar la proliferación y distribución de citos branquiales en peces dorados sin ningún aporte nervioso del sistema nervioso central. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para comprender la absorción dinámica de iones y examinar la redistribución de los citos en los epitelios gastrointestinales de los peces.

Primero, prepare una solución madre roja milimolar mitral tracker disolviendo 50 microgramos en 94 microlitros de dimetilsulfóxido y protéjala de la luz. A continuación, prepare de tres a seis cajas oscuras con un volumen máximo de 600 mililitros. Llene cada caja con 400 mililitros de agua del sistema y coloque una piedra difusora en cada una para proporcionar una fuente de oxígeno.

Coloque peces dorados que pesen de 30 a 40 gramos en las cajas. Después de 30 minutos, agregue la solución de rastreo de inglete para obtener una concentración completa de 0,1 micromolares de colorante y 0,01% de DMSO. Baña el pescado durante cuatro horas.

Después de cuatro horas, abra el flujo de agua a las cajas y deje que el tinte se elimine. Si se trata de animales control, se debe recuperar a los peces durante tres a cinco días, luego se procede a la inmunohistoquímica, de lo contrario, se procede al procedimiento de denervación bilateral completo. Primero, anestesia al pez colocándolo en un baño de agua con benzocaína aireada.

Una vez que haya cesado la respiración, coloque al pez en una mesa de cirugía e inserte un tubo en la cavidad bucal Para irrigar las branquias con una solución anestésica aireada, coloque el pez de manera que la cabeza esté ligeramente inclinada hacia abajo para permitir un mejor acceso al área detrás del cuarto arco branquial. Levante suavemente el opérculo con una pinza recta de patrón estándar, y luego colocar retractores de tejido entre el opérculo y el interior de la cabeza. Abra con cuidado los retractores de tejido para mantener el opérculo alejado de la cabeza y mantener las branquias expuestas.

Apoye las manijas del retractor junto a la cabeza para proporcionar acceso a los cuatro arcos branquiales. Verifique que la solución anestésica esté irrigando las branquias y coloque pinzas de patrón estándar curvadas o rectas entre el cuarto arco branquial y la parte posterior de la cabeza. Abra suavemente las pinzas para crear tensión en el ligamento.

Fijando el cuarto arco branquial a la cabeza con un par de pinzas número cinco. Crea una abertura de dos a tres milímetros perforando el epitelio, conectando el extremo dorsal de los arcos branquiales con la cavidad auricular. Tenga cuidado de no profundizar demasiado porque existe el riesgo de dañar un vaso sanguíneo importante.

A continuación, sostenga un pequeño bastoncillo de algodón con pinzas número cinco y úselo para expandir cuidadosamente la incisión para exponer los nervios noveno y décimo. Libera los nervios de cualquier tejido conectivo usando las pinzas del número cinco. De nuevo, teniendo cuidado de no dañar los vasos sanguíneos.

Una vez que los nervios hayan sido expuestos e identificados, use las tijeras de resorte curvo para cortar cuidadosamente los nervios mientras sostiene la incisión. Abrir con las pinzas rectas de forma estándar. Después de cortar los nervios, retraiga suavemente las pinzas curvas y retire el tejido.

No se requieren suturas retractoras porque la incisión debe cerrarse por sí sola dentro de las 24 a 48 horas. Después de repetir el procedimiento en el otro lado de la cabeza, cambie la irrigación de las branquias de anestésica a agua fresca aireada y permita que los peces se recuperen de la anestesia. Una vez que se hayan reanudado los movimientos auriculares, traslade a los peces a tanques experimentales para que se recuperen durante al menos 24 horas.

Finalmente, realice un procedimiento simulado en un grupo separado de peces perforando el epitelio detrás del cuarto arco branquial sin cortar los nervios antes de sacrificar al pez. Coloque de tres a cuatro mililitros de PFA al 4% en un vial de centelleo. Use un vial por arco branquial.

Además, tome un pequeño bote de suero y llénelo con un XPBS. Esto se usará para lavar el tejido después de que se haya extirpado. Mantenga todas las soluciones en hielo.

Después de sacrificar al pez con una sobredosis de benzocaína, use pinzas romas para levantar la permanente en un lado de la cabeza y tijeras curvas para cortar cada extremo de la canasta braquial braquial. A continuación, use pinzas romas para recoger cuidadosamente la branquia por los Rackers y sacarla de la cavidad auricular. Lave inmediatamente la branquia con un XPBS helado para eliminar el exceso de benceno y sangre y coloque la branquia extirpada en un vial lleno de 4%PFA, fije todas las branquias extirpadas durante la noche a cuatro grados centígrados después de la fijación.

Lave X-S-P-F-A en un XPBS y coloque el pañuelo en un tubo de bala de dos mililitros lleno de 1,5 mililitros de Tritton x al 1%. Coloque los tubos de bala en una coctelera durante seis horas a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Para perforar el tejido, prepare una dilución de uno a 250 de cada anticuerpo primario agregando cuatro microlitros de los anticuerpos primarios NKA y ZN 12 en 992 microlitros de un XPBS.

Asegúrese de que ambos anticuerpos primarios se hayan generado en el mismo huésped. Aspirar la solución de Triton X y sin lavar primero el tejido y la solución de anticuerpos primarios e incubar en un agitador durante seis horas a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, aspire la solución de anticuerpo primario y lave el anticuerpo primario tres veces durante tres minutos cada una.

Usando un XPBS. Prepare el anticuerpo secundario en una dilución de uno a 200 mezclando cinco microlitros de anticuerpo secundario en 995 microlitros de un XPBS. Después de aspirar el PBS del último lavado, aplique el anticuerpo secundario e incube durante seis horas a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados en un agitador.

Finalmente, elimine cualquier exceso de anticuerpo secundario lavando el tejido tres veces durante cinco minutos cada una como antes, después de los lavados, monte el tejido colocando primero una branquia en una gota de 200 microlitros de un XPBS en un portaobjetos de microscopio plano. Para asegurar que el tejido no se desece. Separe el hemi branquial Brinks con micro tijeras curvas.

A continuación, coloque una gota de un XPBS y una gota de medio de montaje en la depresión de una corredera cóncava. Coloque las hemiocoras separadas en el portaobjetos cóncavo con el borde delantero del filamento hacia arriba y cubra con un cubreobjetos frote los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. Para evitar que el cubreobjetos se mueva y desplace el tejido, deje que el tejido se asiente en el fondo del portaobjetos cóncavo durante 10 a 15 minutos antes de tomar la imagen.

Para cada arco branquial, seleccione seis filamentos branquiales al azar para obtener imágenes produciendo seis imágenes por arco branquial. Utilice la microscopía confocal convencional para obtener imágenes del tejido tomando cortes ópticos de uno a tres micrómetros en las siguientes imágenes, los citos indicados por puntas de flecha se tiñeron con el anticuerpo alfa cinco y los nervios indicados por flechas se tiñeron con el anticuerpo ZN 12. Esta imagen confocal de un filamento branquial de un pez control muestra inervación extrínseca con una extensa ramificación laminar de un haz de nervios centrales, presumiblemente originado en los nervios noveno y décimo, como se ve en la imagen del recuadro.

Algunos de los citos indicados también están inervados. Esta imagen muestra un filamento branquial dos días después de la denervación bilateral completa. Había una reducción del haz de nervios centrales, mientras que la inervación laminar parecía prácticamente intacta.

Aquí, un filamento branquial mostrado cinco días después de la denervación bilateral completa demuestra que la inervación extrínseca está ahora en gran medida ausente. El análisis cualitativo sugiere que la denervación bilateral completa causa la degradación de la inervación branquial extrínseca mientras se mantienen los nervios con cuerpos celulares dentro del filamento branquial, creando una red de nervios a través del filamento y hacia el cojo. Este procedimiento puede combinarse con otros métodos, como la medición de flujos iónicos, utilizando iones radiactivos como el sodio 22 para responder a preguntas de investigación adicionales.