Name: Isotérmico de amplificación (LAMP) Ensayos Loop mediada para la detección específica de las especies de Eimeria Que infectan pollos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprende a detectar infecciones por Eimeria en pollos mediante LAMP, una técnica de amplificación isotérmica rápida y económica. Este método mejora el diagnóstico veterinario sin requerir equipos costosos.

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El trabajo realizado en este estudio fue apoyado en parte por el Royal Veterinary College a través del fondo de proyectos de investigación estudiantil, así como por el Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas y el Departamento de Desarrollo Internacional (número de subvención BB/H009337/2). A este manuscrito se le ha asignado la PPB_00795 de referencia por el RVC.

1. Plantilla Preparación NOTA: Cualquier plantilla de ADN genómico se sospecha que contiene ADN derivado de una de las siete especies de Eimeria que infectan a los pollos puede ser utilizado como plantilla para la identificación de especies de Eimeria basados ​​en LAMP. Muestras de tejido intestinal para el análisis de diagnóstico de campo deben recogerse durante la rutina post mortem como se describe aquí. <ol><li> Elige la sección (o secciones) de intestino para ser probado. Ver Tabla 1 para una guía para la selección del sitio de la muestra y las especies con más probabilidades de estar presente el 18 y en la Figura 1 para el rango de distribución y ubicación de los sitios de muestreo específico de la especie de Eimeria. NOTA: Esto es de vital importancia ya que Eimeria son notablemente sitio host específico. Cada especie que infecta pollos se define por la región intestinal que se dirige a 19. La decisión puede estar influenciada por la experiencia previa de la finca, el interés en una o more determinadas especies de Eimeria u otros indicadores de diagnóstico 6. </li><li> Impuestos Especiales 5 cm o longitudes más largas de la sección (s) intestinal seleccionada para la prueba de Eimeria utilizando tijeras estériles o un escalpelo. Opcionalmente, almacenar las muestras para su posterior análisis en un fijador tal como, por ejemplo, en RNAlater 18 o 95% de etanol. NOTA: Si el almacenamiento de etanol en la muestra se debe lavar a fondo en ácido etilendiaminotetraacético-tris estéril (TE) tampón antes de usar. </li><li> Cortar la muestra abierto longitudinalmente, eliminar el contenido más intestinales (si está presente) y raspar las células de la capa de la mucosa libre utilizando el borde de un portaobjetos de microscopio de vidrio estéril o un cuchilla de tijera etanol / llama esterilizado. Opcionalmente para una muestra colectiva incluir células de los cuatro sitios intestinales específicas de las especies en un solo tubo. </li><li> Ponga el material raspado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con tapa de rosca estéril que contiene 100 l de tampón TE estéril incluyendo 10% (w / v) Chelex 100 de resina. </li><li> Agitar cada muestra vigorosamente durante 1 min. Asegúrese de que la parte superior del tornillo está firmemente cerrada y luego se incuba en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. </li><li> Después de hervir permitir que cada muestra se enfríe a la temperatura ambiente durante 1-2 min. </li><li> Centrifugar cada muestra utilizando una microcentrífuga a velocidad máxima (por ejemplo, ~ 10.000 xg) durante 1 min. </li><li> Recoger 2 l del sobrenadante resultado es la plantilla en cada ensayo LAMP se vayan a realizarse. Opcionalmente, agrupar más de un sitio intestinal en un solo tubo para proporcionar un ensayo de sitio múltiple. </li></ol> 2. Eimeria LÁMPARA Preparación Primer (Pre-ensayo) <ol><li> Preparar Eimeria LÁMPARAS stocks de cebadores adecuados para 100 ensayos: <ol><li> Reconstituir cada cebador Eimeria LÁMPARA liofilizada añadiendo agua de grado molecular a una concentración de 100 mM (según lo especificado por el fabricante). Si no se especifica, calcular el volumen de agua requerido usin de grado molecularg los pesos físicas y moleculares de cada cebador. </li><li> Pipeta 60 l de agua de grado molecular en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml flip-top separado para cada especie de Eimeria a ensayar. </li><li> Añadir cebadores FIP, BIP, F3, B3, LF y LB específica a las especies de Eimeria de destino al agua usando las cantidades se muestran en la Tabla 2, la creación de una serie de mezclas específicas de especies de siete cebadores. </li><li> Vórtice brevemente mezclar la solución de imprimación, luego pulso microfuge y congelar hasta que sea necesario. </li></ol></li><li> Prepare una mezcla maestra reacción LAMP para cada especie de Eimeria a ensayar. Multiplique las cantidades se muestran en la Tabla 3 por el número de muestras y añadir tres a un control positivo, control negativo y repuesto pipeta. Pipetear en un 0,5 o 1,5 ml flip-top de tubo de microcentrífuga. </li></ol> 3. Eimeria LÁMPARA Ensayo <ol><li> Especies específicas de ADN polimerasa BST / LAMP pipeta 23 l Eimeria Mastermix en un 0.5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir plantilla de ADN 2 l (preparado en el apartado 1), por lo que un volumen final de reacción de 25 l. </li><li> Añadir ADN genómico específico de la especie de Eimeria 2 l de una reacción (control positivo). Añadir 2 l de agua de grado molecular a la reacción (control negativo). NOTA: Si el ADN genómico específico de la especie no se encuentra disponible una lámpara positiva previa o producto de PCR estándar se pueden usar en su lugar. </li><li> Incubar en un baño de agua o bloque de calor a 62 ° C durante 30 min. Opcionalmente, de-activar la ADN polimerasa Bst por calentamiento a 80 ° C durante 10 min si la reacción no va a ser leído inmediatamente. </li></ol> 4. LÁMPARA Ensayo de lectura <ol><li> Al término de la incubación evaluar el color de cada reacción por debajo de los ojos la luz interior. Los resultados negativos aparecen de color rosa y violeta, los resultados positivos aparecen cielo azul 20. </li><li> Opcionalmente, confirmar el resultado LAMP ensayo en un laboratory mezclando 5 l producto LAMP reacción con 1 l de tampón de carga en gel de ADN para la electroforesis en gel de agarosa usando un gel de agarosa al 2% en 1 x Borato EDTA tampón Tris / / (TBE), pre-teñidas utilizando un colorante de ácidos nucleicos (5 l por 50 ml de agarosa). Añadir 5 l de una escalera de ADN de 1 Kb de tamaño molecular con el carril 1 del gel para permitir el cálculo del tamaño de fragmento. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los ensayos LAMP específicos de la especie de Eimeria descritos en este documento ofrecen un nuevo conjunto de herramientas de diagnóstico en apoyo del control efectivo de los coccidios y la enfermedad coccidiosis. Los resultados de la infección por eimerian pueden incluir graves pérdidas económicas, así como un bienestar de las aves gravemente comprometido y una mayor susceptibilidad a la colonización por patógenos zoonóticos21. Las oportunidades para monitorear las parvadas para detectar la aparición de algunas o todas las especies de Eimeria pueden proporcionar una alerta temprana de una falla en la eficacia del control anticoccidial. Las ventajas clave de LAMP incluyen una especificidad de diana robusta, resultante del requisito de seis dianas de secuencia de ADN diferentes, así como una alta sensibilidad, potenciada por la inclusión de cebadores de bucle13, aunque la naturaleza cualitativa, no cuantitativa, de LAMP puede considerarse una limitación. Actualmente no es posible discriminar el escape del parásito de bajo nivel de la quimioprofilaxis de rutina o la replicación de la vacuna viva de la replicación eimeriana no controlada. No obstante, la facilidad técnica del protocolo y la lectura definitiva ofrecen una mejora considerable con respecto a los enfoques especializados existentes y frecuentemente subjetivos dirigidos por patología y morfología6,7. Cada ensayo puede completarse a un costo de ~ £ 0.75 por muestra, independientemente de los gastos de mano de obra y configuración del equipo. Por lo tanto, los ensayos LAMP también son más rentables que otros diagnósticos moleculares como la PCR, ya que requieren una incubación isotérmica sin necesidad de equipos especializados. 
Durante muchos años, el acceso al ADN genómico de Eimeria como plantilla ha limitado el desarrollo y la aplicación de diagnósticos de campo molecular. El ooquiste es la fase más fácilmente accesible del ciclo de vida del eiméreo, pero la extracción de ADN de rutina requiere instalaciones de laboratorio22. Otras etapas del ciclo de vida intestinal más lábiles requieren una purificación previa a la preparación del ADN para evitar la inhibición de la PCR y la consiguiente pérdida de sensibilidad23,24. La capacidad de extraer ADN eimeriano de una calidad adecuada para LAMP utilizando equipos no más especializados que una microcentrífuga y un baño de agua, complementados con adsorción de inhibidores utilizando resina de quelex, ahora promueve un uso más amplio de la biología molecular en el diagnóstico eiméreo. Curiosamente, la detección informada de ADN de Eimeria medible por PCR cuantitativa en el tejido intestinal 20 días después del inicio de la infección por parásitos, 11 días después de la última salida detectable de ooquistes, plantea la sugerencia de que LAMP puede usarse para detectar la exposición resuelta al parásito, así como la infección en curso, incluso después de que se hayan resuelto las lesiones visibles25. 
El costo relativamente bajo y los bajos requisitos técnicos de los diagnósticos de LAMP Eimeria pueden promover su aplicación en el mundo en desarrollo, donde otros enfoques más establecidos pueden no estar disponibles o no ser apropiados. Para que esto sea aplicable, cada ensayo debe ser capaz de detectar todas las cepas que puedan estar circulando dentro de cada región. Si bien la comprensión de la diversidad genética que prevalece entre las especies de Eimeria es limitada26, el uso de secuencias diana previamente validadas para su uso en PCR cuantitativa con cepas de África, Asia, Europa y América del Sur proporciona alguna evidencia de conservación, lo que respalda la utilidad de estos ensayos LAMP en todo el mundo10.

La producción mundial de pollo se ha multiplicado por diez en los últimos 50 años, con el mundo en desarrollo al acoger a casi cuatro veces la expansión presenciado en el mundo desarrollado <a href="http://www.faostat.org">(www.faostat.org)</a> . Como la importancia de la producción de pollo a la seguridad alimentaria mundial ha crecido también lo ha hecho el perfil de los agentes patógenos que pueden causar enfermedades graves en los pollos. Un buen ejemplo son las especies de Eimeria, parásitos protozoarios omnipresentes que pueden causar la coccidiosis enfermedad entérica 1. Dondequiera que se crían pollos son propensos a ser común 2-4 una o más especies de Eimeria. En el mundo desarrollado Eimeria son controlados principalmente por la quimioprofilaxis, empleando programas de transporte o de rotación para minimizar el impacto de la resistencia 5. Las vacunas vivas también se utilizan en sistemas en los que el valor de aves es suficiente para justificar el costo (por ejemplo, reproductores, capas y algunos pollos de engorde 5). Como result de estas medidas coccidiosis clínica a menudo se controla bien, aunque la infección subclínica es común 5. En el mundo en desarrollo la vacunación es rara y la aplicación del fármaco con frecuencia menos informados. Como consecuencia coccidiosis subclínica y clínica es más común y ejerce un impacto económico significativo 3. El diagnóstico de infección Eimerian ha dependido tradicionalmente de lesión anotando post mortem, aunque incluso los autores del sistema de puntuación más utilizados comentaron que para algunas especies &quot;, parece dudoso que tal procedimiento se debe intentar en ningún pero moderadamente graves infecciones&quot; 6. Evidencia complementaria puede ser obtenida a través de detección microscópica de la etapa del ciclo de vida de ooquistes resistentes al medio ambiente en las muestras fecales o de basura, aunque la morfología de la superposición puede confundir a todos, pero el experto en 6,7. Alternativas moleculares utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificatio azarn de ADN polimórfico PCR (RAPD-PCR) y las tecnologías de PCR cuantitativa han estado disponibles por hasta 20 años 8-10, pero hasta la fecha no han llegado a ser populares. Gasto relativo y el requisito de que el equipo de laboratorio especializado o procesamiento han limitado su aceptación, a pesar de la naturaleza a menudo subjetiva y técnicamente exigente de la Patología mayor y microscopía basada aproxima a 10,11. Estas limitaciones pueden ser exagerados en muchas de las regiones más pobres del mundo, como el sudeste de Asia, donde el impacto de la coccidiosis en la pobreza puede ser proporcionalmente mayor 12. En respuesta hay una clara demanda de nuevo, los ensayos de diagnóstico específicos de las especies de Eimeria sencillo y sensible, pero rentable. Loop mediada amplificación isotérmica (LAMP) es una técnica fácil de preparar polimerasa impulsado ADN que es capaz de amplificar grandes cantidades de ADN. Lo más importante, LAMP utiliza una Polymera DNA BstSE en lugar de la ADN polimerasa Taq comúnmente utilizado en la PCR, lo que facilita la amplificación de ADN a una única temperatura constante sin el requisito de ciclos térmicos 13,14. Lámpara puede ser susceptible de aplicación en el laboratorio incluso más rudimentario o en el campo. Caracterizado por resistencia relativa a muchos inhibidores de la PCR, una alta sensibilidad y especificidad, los ensayos de LAMP se han desarrollado para una amplia gama de patógenos, incluyendo virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, Clostridium perfringens y Cryptosporidium 15-17. En respuesta a la demanda de nuevos diagnósticos de cada especie de Eimeria rentables un panel de ensayos de LAMP específicas para cada una de las siete especies de Eimeria que infectan los pollos se ha desarrollado 18. Las solicitudes de los nuevos ensayos incluyen monitoreo aparición de parásitos, de especial valor dada la asociación de especies como máximos Eimeria o Eimeria necatrix con mala pe económicarformance 3,4. Otras aplicaciones incluyen la evaluación de la eficacia de la estrategia anticoccidial de una granja, el diagnóstico de la infección subclínica o enfermedad clínica y la evaluación de riesgo planteado por Eimeria a una granja.

<table><tbody><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7024</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.321</td><td>Atención, altamente inflamable</td></tr><tr><td>100 x Concentrado tampón Tris-EDTA (TE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>Resina Chelex 100</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1253</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado molecular</td><td>Invitrogen</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>E. acervulina F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCTAACATTTCGCTTCACGGAC</td></tr><tr><td>E. acervulina B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ATGAGCAAGTGGAACACCTTG</td></tr><tr><td>E. acervulina FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*AGAGCAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT</td></tr><tr><td>E. acervulina BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG</td></tr><tr><td>E. acervulina LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TAAGGTTACACCCGTGGAGG</td></tr><tr><td>E. acervulina LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCATGCACAAAGCGACTT</td></tr><tr><td>E. brunetti F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GGCCATCAAGTTCCATGAGC</td></tr><tr><td>E. brunetti B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TCAACCTCCTGAGTGTGTTT</td></tr><tr><td>E. brunetti FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT</td></tr><tr><td>E. brunetti BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>VC00021*TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC</td></tr><tr><td>E. brunetti LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>VC00021*GAAACGCTCGAACATGGC</td></tr><tr><td>E. brunetti LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CTTCTCCACAGACCCAGAGGT</td></tr><tr><td>E. maxima F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* ACTACGGAAAAGTGGGTAGCT</td></tr><tr><td>E. maxima B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>VC00021*CCTTCCTCCCTTCTCTGAAAACTG</td></tr><tr><td>E. maxima FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>VC00021*GAGTCACTGCTGATGTACCAAA AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG</td></tr><tr><td>E. maxima BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA</td></tr><tr><td>E. maxima LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* CAAGCCTACGCGGACATC</td></tr><tr><td>E. maxima LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TTATGCAGCTGGGTCAACG</td></tr><tr><td>E. mitis F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ACGATAGCCAAGACACGTAAGG</td></tr><tr><td>E. mitis B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA</td></tr><tr><td>E. mitis FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT</td></tr><tr><td>E. mitis BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG</td></tr><tr><td>E. mitis LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>VC00021*TCCATGCATCCCCTTGTT</td></tr><tr><td>E. mitis LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGTGGGCACAGATTGATTC</td></tr><tr><td>E. necatrix F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TGGCTTTCCCGCGTACC</td></tr><tr><td>E. necatrix B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGGCCCAACACAAAGACTG</td></tr><tr><td>E. necatrix FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA</td></tr><tr><td>E. necatrix BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC</td></tr><tr><td>E. necatrix LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTCTGTAACTTGGGACGTTGT</td></tr><tr><td>E. necatrix LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAACAGCCGGAGCCTCTC</td></tr><tr><td>E. praecox F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCCTTGTATGTTGGTGTGTCTCTCT</td></tr><tr><td>E. praecox B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCGCACGAATCTGAATCACAC</td></tr><tr><td>E. praecox FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG</td></tr><tr><td>E. praecox BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT</td></tr><tr><td>E. praecox LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>VC00021*GAATAGCATTGCCAGGTGG</td></tr><tr><td>E. praecox LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>VC00021*GTCCACTGTCATTAATATTGC TGC</td></tr><tr><td>E. tenella F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCTTGTGAAGGTCAGCGTG</td></tr><tr><td>E. tenella B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* GCTGAGTCCATACGTACTTCCT</td></tr><tr><td>E. tenella FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCACTGCTATGGAAAGTCAC AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT</td></tr><tr><td>E. tenella BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT</td></tr><tr><td>E. tenella LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCATGTGCAGTTGAAGACA</td></tr><tr><td>E. tenella LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCAAATGTATCTGCTAGTTATA TTAACAAG</td></tr><tr><td>10 x Tampón de reacción ThermoPol</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1330</td><td></td></tr><tr><td>Solución de betaína (5 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td></td></tr><tr><td>Bst polimerasa</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs</td><td>M0275S Azul de</td><td></td></tr><tr><td>hidroxinaftol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33936</td><td>Disuelto en agua de grado molecular.</td></tr><tr><td>UltraPure agarosa</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>10 x Tampón Tris/Borato/EDTA (TBE)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Azul/Naranja Colorante de carga de ADN (x6)</td><td>Promega</td><td>G1881</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1Kb</td> escalera de ADN <td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>SafeView tinción de ácido nucleico</td><td>NBS Biologicals</td><td>NBS-SV</td><td></td></tr></tbody></table>

isotérmico de amplificación (lamp) ensayos loop mediada para la detección específica de las especies de<em&gt; eimeria</em&gt; que infectan pollos

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parásitos, protozoos que causan la enfermedad entérica coccidiosis, representan una seria amenaza para la producción y el bienestar de los pollos. En ausencia de un control efectivo, la coccidiosis clínica puede ser devastadora. La resistencia a los quimioprofilácticos frecuentemente utilizados para el control de Eimeria es común y la infección subclínica está muy extendida, lo que influye en los índices de conversión alimenticia y la susceptibilidad a otros patógenos como Clostridium perfringens. A pesar de la disponibilidad de herramientas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el diagnóstico de la infección por Eimeria todavía se basa casi por completo en enfoques tradicionales como la puntuación de las lesiones y la morfología de los ooquistes, pero ninguno de los dos es sencillo. Las limitaciones de las herramientas moleculares existentes incluyen la necesidad de equipos especializados y las dificultades para acceder al ADN como plantilla. En respuesta, se ha desarrollado un protocolo sencillo de preparación de ADN de campo y un panel de ensayos de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) específicos de cada especie para las siete Eimeria que se reconoce que infectan al pollo. Ahora proporcionamos un protocolo detallado que describe la preparación del ADN genómico a partir de tejido intestinal recogido post-mortem, seguido de la configuración y lectura de los ensayos LAMP. El LAMP específico de la especie de Eimeria puede utilizarse para controlar la aparición de parásitos, evaluar la eficacia de la estrategia anticoccidial de una granja, y para diagnosticar infecciones subclínicas o enfermedades clínicas de particular valor cuando no se dispone de una vigilancia experta.

Validación del ensayo Durante la validación cada ensayo LAMP-específica de la especie Eimeria se ensayó usando un panel de muestras de ADN puro que representan todas las siete especies de Eimeria que infectan el pollo, así como ADN genómico de pollo como un control host. Electroforesis en gel de agarosa se ​​utilizó para resolver cada ensayo y demostró la especificidad de especie absoluta sin anfitrión reactividad cruzada 18. A continuación, una serie de diez veces la dilución en serie preparó usando tenella purificado Eimeria ADN genómico reveló un límite de sensibilidad del ensayo de entre uno y diez copias del genoma 18. No hay límite superior se determinó con resultados positivos alcanzados hasta e incluyendo la concentración más alta (100.000 copias del genoma) 18. Aplicación con muestras de campo Las muestras recogidas para las pruebas de Eimeria es probable que se deriva de pollos encontrados muertos, sacrificados como consecuencia de poor salud o sacrificadas para la vigilancia centinela de la salud, lo que indica un tamaño de muestra probable de entre uno y tres, cuando parte de una rutina. Prueba de tres aves recogidas de una granja de pollos de Estados Unidos como parte de un programa de vigilancia produjo tres series de muestras intestinales. Aplicación de los ensayos de LAMP específicas de la especie objetivo, dar prioridad a los sitios intestinales preferidos para cada especie de Eimeria (Tabla 1), permitió la identificación visual de la infección Eimerian en todas las aves a prueba utilizando azul hidroxinaftol como un indicador (Figura 2). El color conseguido con una reacción LAMP negativo al usar azul hidroxinaftol puede oscilar desde el violeta al rosa, pero siempre es distinto del azul alcanzado por un resultado positivo. Confirmación por electroforesis en gel de agarosa proporcionó resultados comparables (Figura 2B). Durante la aplicación de campo el usuario puede optar por aplicar la pantalla completa contra las siete especies, o de destino sólo aquellas especies priorizadas comoimportante o conocido que circulan en la granja o alrededores. El fracaso de los enfoques basados ​​en la PCR para establecerse como diagnóstico para la ocurrencia de Eimeria hace hincapié en la necesidad de simplicidad en cualquier nueva prueba. Mientras que la lámpara ofrece una preparación simple y procesamiento de PCR, la obligación de probar múltiples sitios intestinales por ave sigue siendo desalentador. Producción de una sola muestra de ADN agrupado por ave, que luego puede ser probado con uno o más ensayos de LAMP, es probable que sea más atractivo. Procesamiento de una muestra conjunta por ave, el material recogido de cada uno de los sitios intestinales específicos descritos en la Tabla 1 y se agruparon antes de la preparación de ADN, para las pruebas con los siete ensayos de LAMP representa siempre el mismo resultado que cuando cada sitio intestinal se procesó por separado (Figura 2 en comparación con la Figura 3). <img alt="Figura 1" src=&quot;/files/ftp_upload/52552/52552fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. sitios de muestreo intestinales para la detección LÁMPARA de Eimeria parásitos de especies que infectan a los pollos. Las regiones intestinales dirigidos por cada especie de Eimeria se destaca por las líneas de color, con los sitios preferidos de muestreo indicado por el número entre las líneas negras punteadas (E. acervulina: amarillo / 1, E. Brunetti: rosa / 2, E. maxima: azul / 3, E. mitis: naranja / 4, E. necatrix: rojo / 5, E. praecox: verde / 6 y E. tenella: gris / 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52552/52552fig2.jpg" /> Figura 2. LÁMPARA diagnóstico de infección Eimerian from tres pollos de engorde comerciales. LAMP reacciones resuelven utilizando (A) hidroxinaftol azul, donde un azul cielo reacción fue positiva y una violeta a la reacción de color rosa fue negativa, y la electroforesis en gel (B) de agarosa. Los sitios muestreados intestinales fueron como se muestra en la Tabla 1 para cada especie del parásito. A = E. acervulina, B = E. Brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox y T = E. tenella. El carril 1 contiene la escalera del ADN 1Kb GeneRuler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52552/52552fig3.jpg" /> Figura 3. LÁMPARA diagnóstico de infección Eimerian utilizando reac LÁMPARAS muestras agrupados de tres pollos de engorde comerciales separados.ciones resolver utilizando azul hidroxinaftol, donde un azul cielo reacción fue positiva y violeta a la reacción de color rosa fue negativo. A = E. acervulina, B = E. Brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox y T = E. tenella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Sitio de la muestra </td><td> Ensayo de especies de Eimeria (lo más probable) </td></tr><tr><td> Duodeno (D) </td><td> E. acervulina, E. praecox </td></tr><tr><td> Yeyuno / ileon * (J / I) </td><td> E. maxima, E. necatrix </td></tr><tr><td> Ciegos (C) </td><td> E. necatrix, E. tenella </td></tr><tr><td> Íleon terminal (TI) </td><td> E. Brunetti, E. mitis </td></tr&gt; <tr><td> Muestra conjunta (P) </td><td> E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox, E. tenella </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Intestinal selección específica de la región de ensayos de especies de Eimeria candidato. La elección de la región a muestrear varía para cada especie de Eimeria como se ilustra en la Figura 1. Las muestras combinadas incluyen material recogido de los cuatro sitios específicos que a continuación se combinaron para la preparación de ADN. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Primer * </td><td> Stock concentración (M) </td><td> Volumen (l) </td></tr><tr><td> Agua </td><td> - </td><td> 60 </td></tr><tr><td> Delantero Interior Primer (FIP) </td><td> 100 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Backward Pri Interiormer (BIP) </td><td> 100 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Delantero exterior Primer (F3) </td><td> 100 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Backward Outer Primer (B3) </td><td> 100 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Loop Forward (LF) </td><td> 100 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Loop Backward (LB) </td><td> 100 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Total </td><td></td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Preparación de una premezcla de imprimación LAMP. Los componentes y proporciones requeridas para preparar una premezcla cebador para LAMP. Los volúmenes que se muestran son para 100 LAMP reacciones. * Primer identidades como se muestra en los Materiales y Barkway et al (2011) 18. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Stock conc n </td><td> Reacción final conc n </td><td> Volumen por reacción (l) </td></tr><tr><td> DDW </td><td> - </td><td> - </td><td> 10.1 </td></tr><tr><td> Tampón ThermoPol </td><td> 10 x </td><td> 1 x </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 100 mM </td><td> 2 mM </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Mezcla de cebadores * </td><td colspan="2"> Tabla 2 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> 25 mM </td><td> 400 uM </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> La betaína </td><td> 5 M </td><td> 1 M </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Azul de hidroxinaftol </td><td> 3 mM </td><td> 120 mM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ADN polimerasa Bst </td><td> 8000 U / ml </td><td> 8 U </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Total </td><td></td><td></td><td> 23 </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Preparación de un LAMMastermix reacción P. * Específico de la especie de Eimeria.

El diagnóstico de la infección por Eimeria en pollos sigue siendo exigente. Los enfoques basados en la morfología de los parásitos y la patología del huésped suelen no ser concluyentes, mientras que los enfoques moleculares basados en la PCR han demostrado ser exigentes en cuanto a coste y experiencia. El objetivo de este protocolo es establecer la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) como un diagnóstico molecular sencillo para la infección eimeriana.

Isotérmico de amplificación (LAMP) Ensayos Loop mediada para la detección específica de las especies de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectan pollos

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

El objetivo general de este procedimiento es diagnosticar la aparición de parásitos de la especie I myea en un pollo o una parvada de pollos. Esto se logra preparando primero los reactivos para la amplificación isotérmica mediada por bucle o la reacción en lámpara. A continuación, se prepara el ADN genómico total a partir de uno o más sitios intestinales post mortem.A continuación, el ADN genómico se añade a la mezcla maestra de la lámpara y se incuba. Finalmente, se evalúa el resultado de la prueba de lámpara. En última instancia, LAMP se utiliza para determinar la presencia de especies específicas de Imiria con el fin de mejorar la gestión de las poblaciones y como herramienta para el diagnóstico de enfermedades.Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos tradicionales como la microscopía morfológica o la PCR es que es menos subjetiva y no requiere costosas instalaciones de laboratorio. El uso de este enfoque puede mejorar la salud y el bienestar de los pollos al mejorar el diagnóstico de la infección por Arian. Para preparar la plantilla para la lámpara Erea, elija la sección del intestino que se va a analizar.Utilice esta tabla como guía para la selección del sitio de muestreo y las especies de eria que tienen más probabilidades de estar presentes. Esto es de vital importancia, ya que cada especie que infecta a los pollos está definida por la región intestinal a la que se dirige con tijeras estériles o un bisturí. Extirpar longitudes de cinco centímetros o más de las secciones intestinales seleccionadas para realizar pruebas de detección de eria.Corte la muestra longitudinalmente. Retire la mayor parte del contenido intestinal y use el borde de un microscopio de vidrio estéril. Deslice o esterilice la hoja de la tijera para raspar y liberar las células de la capa mucosa.Coloque el material raspado en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros con tapa de rosca que contenga 100 microlitros de TE estéril con un 10% de peso, pero un volumen de resina de celda X 100 y atornille firmemente la parte superior. Agite las muestras vigorosamente durante un minuto, luego incube en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Después de hervir, deje que cada muestra se enfríe a temperatura ambiente durante uno o dos minutos.Centrifugar las muestras a 10.000 veces G durante un minuto antes de recoger dos microlitros del sobrenadante por ensayo de lámpara que se utilizarán como plantilla para preparar las existencias de cebadores de lámpara de I miria adecuadas para 100 ensayos. Reconstituya cada cebador liofilizado de lámpara de I miria agregando agua de grado molecular a una concentración de 100 pipetas micromolares y 60 microlitros de agua de grado molecular en un tubo de microcentrífuga abatible de 0,5 mililitros por separado para cada especie de iria que se va a analizar. Usando el volumen que se muestra en esta tabla.Agregue al agua cebadores, F-I-P-B-I-P-F, tres B, tres LF y LB específicos para la especie de eria objetivo. Creación de una serie de siete mezclas de cebadores específicos de cada especie. Invierta brevemente las soluciones de cebador para mezclarlas, pulsar micro fug y congelar hasta que sea necesario.Utilizando los volúmenes enumerados en esta tabla y las pautas en el protocolo de texto, prepare una mezcla maestra de reacción en lámpara para cada especie de iria que se va a ensayar para llevar a cabo la pipeta de ensayo en lámpara de 23 microlitros de mezcla maestra de lámpara de polimerasa B-S-G-D-N-A específica de la especie IEA en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros. Añadir dos microlitros de la plantilla de ADN previamente preparada haciendo un volumen de reacción final de 25 microlitros como control positivo. Agregue dos microlitros de ADN genómico específico de la especie eria a una reacción.Agregue dos microlitros de agua de grado molecular a una reacción como control negativo, incubando un baño de agua o un bloque de calor a 62 grados Celsius durante 30 minutos. Opcionalmente, desactive la polimerasa B-S-T-D-N-A calentándola a 80 grados centígrados durante 10 minutos. Si la reacción no se va a leer inmediatamente al final de la incubación bajo luz interior, evalúe el color de cada reacción a ojo.Los resultados negativos aparecerán de color rosa a violeta y los resultados positivos aparecerán. Azul cielo opcionalmente. Para confirmar el resultado del ensayo de la lámpara, mezcle cinco microlitros de producto de reacción de la lámpara con un microlitro de tampón de carga de gel de ADN y ejecútelo con un gel prestain 2%ARO.Utilice una escalera de ADN de tamaño molecular de una base asesina para determinar el tamaño del fragmento probando tres. Aves recolectadas de una granja de pollos de engorde de EE. UU. como parte de un programa de vigilancia Produjo tres conjuntos de muestras intestinales, como se muestra aquí. Aplicación dirigida de los ensayos de lámpara específicos de la especie y priorización de los sitios intestinales preferidos para cada I miria.Las especies permitieron la identificación visual de una infección iriana en todas las aves analizadas utilizando el hidroxiazul natal como indicador. El color logrado con una reacción negativa de la lámpara cuando se usa hidroxilo puede variar de violeta a rosa, pero siempre es distinto del azul logrado por un resultado positivo. La confirmación por electroforesis en gel de aose proporcionó resultados comparables como se muestra aquí.La preparación del ADN a partir de una muestra extraída por ave que representa el material recolectado de cada uno de los sitios intestinales específicos y probado con los siete ensayos con lámpara proporcionó el mismo resultado que cuando cada sitio intestinal se procesó por separado. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 45 minutos si se realiza correctamente siguiendo este procedimiento. También se pueden realizar otras técnicas, como la puntuación de lesiones, para evaluar la salud intestinal general.

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Investigación

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