Isotérmico de amplificación (LAMP) Ensayos Loop mediada para la detección específica de las especies de Eimeria Que infectan pollos

El objetivo general de este procedimiento es diagnosticar la aparición de parásitos de la especie I myea en un pollo o una parvada de pollos. Esto se logra preparando primero los reactivos para la amplificación isotérmica mediada por bucle o la reacción en lámpara. A continuación, se prepara el ADN genómico total a partir de uno o más sitios intestinales post mortem.

A continuación, el ADN genómico se añade a la mezcla maestra de la lámpara y se incuba. Finalmente, se evalúa el resultado de la prueba de lámpara. En última instancia, LAMP se utiliza para determinar la presencia de especies específicas de Imiria con el fin de mejorar la gestión de las poblaciones y como herramienta para el diagnóstico de enfermedades.

Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos tradicionales como la microscopía morfológica o la PCR es que es menos subjetiva y no requiere costosas instalaciones de laboratorio. El uso de este enfoque puede mejorar la salud y el bienestar de los pollos al mejorar el diagnóstico de la infección por Arian. Para preparar la plantilla para la lámpara Erea, elija la sección del intestino que se va a analizar.

Utilice esta tabla como guía para la selección del sitio de muestreo y las especies de eria que tienen más probabilidades de estar presentes. Esto es de vital importancia, ya que cada especie que infecta a los pollos está definida por la región intestinal a la que se dirige con tijeras estériles o un bisturí. Extirpar longitudes de cinco centímetros o más de las secciones intestinales seleccionadas para realizar pruebas de detección de eria.

Corte la muestra longitudinalmente. Retire la mayor parte del contenido intestinal y use el borde de un microscopio de vidrio estéril. Deslice o esterilice la hoja de la tijera para raspar y liberar las células de la capa mucosa.

Coloque el material raspado en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros con tapa de rosca que contenga 100 microlitros de TE estéril con un 10% de peso, pero un volumen de resina de celda X 100 y atornille firmemente la parte superior. Agite las muestras vigorosamente durante un minuto, luego incube en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Después de hervir, deje que cada muestra se enfríe a temperatura ambiente durante uno o dos minutos.

Centrifugar las muestras a 10.000 veces G durante un minuto antes de recoger dos microlitros del sobrenadante por ensayo de lámpara que se utilizarán como plantilla para preparar las existencias de cebadores de lámpara de I miria adecuadas para 100 ensayos. Reconstituya cada cebador liofilizado de lámpara de I miria agregando agua de grado molecular a una concentración de 100 pipetas micromolares y 60 microlitros de agua de grado molecular en un tubo de microcentrífuga abatible de 0,5 mililitros por separado para cada especie de iria que se va a analizar. Usando el volumen que se muestra en esta tabla.

Agregue al agua cebadores, F-I-P-B-I-P-F, tres B, tres LF y LB específicos para la especie de eria objetivo. Creación de una serie de siete mezclas de cebadores específicos de cada especie. Invierta brevemente las soluciones de cebador para mezclarlas, pulsar micro fug y congelar hasta que sea necesario.

Utilizando los volúmenes enumerados en esta tabla y las pautas en el protocolo de texto, prepare una mezcla maestra de reacción en lámpara para cada especie de iria que se va a ensayar para llevar a cabo la pipeta de ensayo en lámpara de 23 microlitros de mezcla maestra de lámpara de polimerasa B-S-G-D-N-A específica de la especie IEA en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros. Añadir dos microlitros de la plantilla de ADN previamente preparada haciendo un volumen de reacción final de 25 microlitros como control positivo. Agregue dos microlitros de ADN genómico específico de la especie eria a una reacción.

Agregue dos microlitros de agua de grado molecular a una reacción como control negativo, incubando un baño de agua o un bloque de calor a 62 grados Celsius durante 30 minutos. Opcionalmente, desactive la polimerasa B-S-T-D-N-A calentándola a 80 grados centígrados durante 10 minutos. Si la reacción no se va a leer inmediatamente al final de la incubación bajo luz interior, evalúe el color de cada reacción a ojo.

Los resultados negativos aparecerán de color rosa a violeta y los resultados positivos aparecerán. Azul cielo opcionalmente. Para confirmar el resultado del ensayo de la lámpara, mezcle cinco microlitros de producto de reacción de la lámpara con un microlitro de tampón de carga de gel de ADN y ejecútelo con un gel prestain 2%ARO.

Utilice una escalera de ADN de tamaño molecular de una base asesina para determinar el tamaño del fragmento probando tres. Aves recolectadas de una granja de pollos de engorde de EE. UU. como parte de un programa de vigilancia Produjo tres conjuntos de muestras intestinales, como se muestra aquí. Aplicación dirigida de los ensayos de lámpara específicos de la especie y priorización de los sitios intestinales preferidos para cada I miria.

Las especies permitieron la identificación visual de una infección iriana en todas las aves analizadas utilizando el hidroxiazul natal como indicador. El color logrado con una reacción negativa de la lámpara cuando se usa hidroxilo puede variar de violeta a rosa, pero siempre es distinto del azul logrado por un resultado positivo. La confirmación por electroforesis en gel de aose proporcionó resultados comparables como se muestra aquí.

La preparación del ADN a partir de una muestra extraída por ave que representa el material recolectado de cada uno de los sitios intestinales específicos y probado con los siete ensayos con lámpara proporcionó el mismo resultado que cuando cada sitio intestinal se procesó por separado. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 45 minutos si se realiza correctamente siguiendo este procedimiento. También se pueden realizar otras técnicas, como la puntuación de lesiones, para evaluar la salud intestinal general.