Name: Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Aprende a generar injertos vasculares de ingeniería de tejidos funcionales mediante células madre pluripotentes parcialmente inducidas y un bioreactor de flujo. Este método permite evaluar la viabilidad en modelos murinos.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Británica del Corazón y la Fundación Oak.

Realice todos los experimentos con animales de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio. 1. Preparación de Medios de Cultivo <ol><li> Hacer medios de cultivo para la línea celular de fibroblastos humanos CCL-153: F-12K mediana, suero bovino fetal al 10% (FBS) y 100 U / ml de penicilina y estreptomicina. </li><li> Hacer reprogramación de medios para la generación de PIPSC: medio de Eagle modificado de Knockout Dulbecco (DMEM) que contiene 20% suero sustitución Knockout, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM Medio Esencial Mínimo (MEM) de ácidos no esencial Amino, 10 ng / factor de crecimiento de fibroblastos básico ml 2 (bFGF-2) y 100 U / ml de penicilina y estreptomicina. Añadir bFGF-2 frescos cada vez antes de usar los medios de comunicación. </li><li> Hacer Diferenciación Media (DM) para inducir células del músculo liso (SMC) Diferenciación: α-MEM medios que contienen 10% de FBS, Factor de Crecimiento 0,1 mM β-mercaptoetanol, 100 U / penicilina y estreptomicina y 25 ml ng / ml derivado de las plaquetas(PDGF-ββ). </li><li> Hacer endotelial Diferenciación Media (EC-DM) para inducir células endoteliales (CE) Diferenciación: medios que contienen 50 ng de crecimiento endotelial medios de comunicación-2 (EGM-2) / ml factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y 100 U / ml de penicilina y estreptomicina. </li></ol> 2. Reprogramación fibroblastos humanos en células madre pluripotentes inducidas (parcialmente PIPSC) <ol><li> Cultura línea celular de fibroblastos humanos CCL-153 en 0.04% de la solución de gelatina frascos revestidos en medio de cultivo. </li><li> Células Passage cada 3 días en una proporción de 1: 6. Utilice las células antes del paso 9 para una óptima eficiencia de la generación PIPSC. Las células están listas para la transfección al llegar a 80 - 90% de confluencia. </li><li> Linealizar pCAG2LMKOSimO plásmido policistrónico que contiene 4 factores de reprogramación octamer vinculante factor de transcripción 4 (OCT4), Sox2, factor de Kruppel-like 4 (KLF4) y C-MYC (pCAG-OSKM). Digerir 5 g de plásmido con 5 unidades de enzima de restricción PvuI durante 3 horas a 37 ° C. Purificarel plásmido con un kit comercial según el protocolo del fabricante. </li><li> Transfectar 2 x 10 6 fibroblastos humanos con 4 g de plásmido pCAG-OSKM linealizado mediante electroporación con el kit de fibroblastos dérmicos humanos (NHDF) nucleofection según el protocolo del fabricante. Sembrar suavemente las células transfectadas en pre 0,04% de gelatina recubierta matraz T25 que contiene 5 ml de pre-calentado reprogramación de medios. </li><li> Después de 24 horas, cambio de medio con suplementos de 25 mg / ml de neomicina para seleccionar una población pura de células transfectadas. </li><li> Cambio de medio cada dos días hasta el día 4. Nota: Los fibroblastos humanos se convierten en PIPSC después de 4 días de reprogramación. </li></ol> 3. Diferenciación de PIPSC en células endoteliales y musculares lisas <ol><li> PIPSC Seed en platos de colágeno IV pre-recubiertos que contienen DM durante 4 días para inducir la diferenciación en las SMC. Cambio de medio cada dos días hasta el día 4. </li><li> PIPSC Semilla de colágeno IV pre-recubierto platos containing endotelial-DM durante 6 días para inducir la diferenciación en las células endoteliales. Cambie medio cada dos días hasta el día 6. </li></ol> 4. Descelularizado Aorta Preparación del injerto Nota: Todas las soluciones y equipos deben ser estériles. <ol><li> Sacrificar el ratón por dislocación cervical y fijar el ratón en una posición supina bajo microscopio de disección. </li><li> Corte a través del esternón y alrededor de la caja torácica para abrir la cavidad torácica. Quite el corazón, los pulmones y el esófago para exponer la aorta. Retire con cuidado la grasa peri-aorta con fórceps. </li><li> Cortar la aorta desde el extremo anterior con unas tijeras y coloque un lado del extremo con fórceps romos. Separe la aorta de la columna de la columna vertebral por detrás mediante disección roma. Cierre con cuidado todas las arterias de ramificación de la aorta por la ligadura con un electrocoagulador bipolar y el corte desde el otro extremo de la ligadura con unas tijeras. </li><li> Utilice una jeringa de 5 ml para limpiar el lumen de la aorta con 3 ml de solución salina que contiene 100 U de heparina para prevenir la formación de coágulos de sangre. </li><li> Cortar el extremo posterior de la aorta antes se ramifica en el renal. Mantener la integridad de la aorta es muy importante durante todo el procedimiento. </li><li> Enjuague el lumen de la aorta con 5 ml de dodecilsulfato de sodio (SDS) solución de 0,075% diluido en tampón fosfato salino (PBS). </li><li> Remojar la aorta torácica en solución de SDS al 0,075% en una placa de Petri de 10 cm. Coloque la placa de Petri en un agitador orbital durante 2 horas a 150 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague el lumen de la aorta con 5 ml de PBS. </li><li> Remoje la aorta en PBS en una placa de 10 cm de Petri. Coloque la placa de Petri en el agitador orbital durante 2 horas a 150 rpm a temperatura ambiente. Actualizar PBS cada 20 minutos. </li><li> Enjuague el lumen de la aorta con 5 ml de PBS. </li><li> Mantenga injerto aorta descelularizado en PBS a 4 ° C durante un máximo de una semana. </li></ol> 5. Dual Siembra de PIPSC y biorreactor acondicionado Nota: Todas solución des y el equipo deben ser estériles. Realizar todas las operaciones en una campana de cultivo de tejidos. <ol><li> Montar el circuito de flujo de biorreactor, como se ilustra en la Figura 1. Conectar cámara de incubación, depósito de medio, la bomba peristáltica y la cámara de cumplimiento de la tubería. Volumen mínimo de medio necesario para la circulación es de 40 ml. </li><li> Pre-condición del recipiente descelularizado con medio de cultivo empapando la aorta en un medio de DM en un plato de 10 cm Petri. Coloque la placa de Petri en el agitador orbital durante 1 hora a 50 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Introduzca 1 cm tubos de nylon de longitud (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm) en ambos extremos de la vasija descelularizado bajo el microscopio. Ate el recipiente y los tubos con 8-0 suturas de seda. </li><li> Montar el injerto de aorta descelularizado en la cámara de incubación mediante la conexión de los tubos de nylon con los puertos de entrada y salida (1/32 &quot;) de tubos de la pared de la cámara. Mantener cámara de incubación con 5 ml de medio cada vez. </li><li> Trypsinize PIPSC añadiendo precalentadotripsina para cubrir la placa de cultivo y el rock suavemente el plato 10 veces. Deseche la tripsina y dejar el plato en la incubadora durante 2 - 3 minutos. Añadir medio de cultivo pre-calentado en el plato y mezclar el medio con las células. </li><li> Contar el número de células usando un hemocitómetro. Centrifugar dos alícuotas de suspensiones celulares que contienen 5 x 10 5 células cada uno durante 5 min a 300 x g. Aspirar el sobrenadante por completo. </li><li> Después de aspirar el sobrenadante por completo, resuspender 1 pellet de las pepitas sedimentos celulares en 50 l de DM. Inyectar esta suspensión de células en la luz del vaso descelularizados. </li><li> A continuación, volver a suspender el sedimento celular otra pips en 100 l de Matrigel. Pipetear con cuidado la mezcla sobre el injerto de aorta descelularizado. </li><li> Espere de 10 - 15 min hasta que la mezcla se convierte en un estado similar a un gel uniformemente y se envuelve alrededor de la superficie externa del vaso. Llene la cámara de incubación con DM. </li><li> Configuración de lugar en una incubadora de CO2 al 5% todo el biorreactor a 37 ° C. Girar manualmente el injerto descelularizado 90 ° alrededor del eje longitudinal cada media hora en el primero 2 hr. </li><li> Mantenga la cultura estática durante 12 horas para permitir la adhesión celular. </li><li> Entregar DM a través del lumen por la bomba peristáltica para inducir la diferenciación de células musculares lisas. Iniciar la velocidad de flujo inicial en 5 ml / min y aumento escalonado a 20 ml / min durante 24 hr. </li><li> Mantener la tasa de flujo del medio circulante a 20 ml / min durante 24 horas. </li><li> Detener el flujo del medio y mover el ajuste de la incubadora biorreactor. </li><li> Re-semilla del lumen del injerto con PIPSC. Trypsinize, recuento y centrifugar 1 x 10 6 PIPSC como en los pasos 5.5 a 5.6. Resuspender las células en 50 l de medio EGM-2 que contienen 50 ng / ml de VEGF. Inyectar la mezcla de células en el lumen del injerto. </li><li> Cambiar el medio en la cámara de incubación y toda la circulación en EGM-2 medio que contiene 50 ng de VEGF / ml para inducir la diferenciación endotelial. </li><li> Mueva retrasando a th el biorreactore incubadora. Gire manualmente el injerto 90 ° cada 30 minutos en las primeras 2 horas y luego mantener una cultura estática durante 12 horas. </li><li> Iniciar la circulación de flujo de 5 ml / min y aumento escalonado a 35 ml / min. Mantener el caudal a 35 ml / min durante 5 días. Cambiar circulante y medio cámara de cada dos días. </li><li> Se recoge el injerto de ingeniería para su posterior injerto de ratón. </li></ol> 6. El injerto de doble cabeza de serie PIPSC injerto en ratones <ol><li> Uso NOD.CB17-Prkdc scid / NcrCrl ratones macho como receptores de injertos buque. Asegúrese siempre de que los ratones son alrededor de 10 semanas de edad, pesan aproximadamente 25 - 35 g, y se encuentran en buenas condiciones de salud. </li><li> Anestesie ratón receptor mediante la administración de una combinación de Hypnorm (25 mg / kg) y Hypnovel (25 mg / kg) por vía intraperitoneal. Aplicar vaselina pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Confirme anestesia eficiente, garantizando que los ratones tienen los músculos relajados y están respirando constantemente. <ol><li> Fijar el ratón en una posición supina con su cuello afeitó y extendido. Administrar sulfato de atropina (1,7 mg / kg) en combinación con los anestésicos para asegurar que las vías respiratorias del ratón sigue siendo clara. </li></ol></li><li> Preparar una incisión en la línea media de la mandíbula al esternón del ratón. Bajo un microscopio de disección con 5 a 10 veces la amplificación, levantar las glándulas salivales derecha lateralmente y eliminar el músculo esternocleido- derecho a exponer la arteria carótida común derecha. </li><li> Retire con cuidado los tejidos unidos a movilizar a la arteria carótida común derecha desde el extremo distal hacia el extremo proximal. Ligar la porción media de la arteria carótida común dos veces con una sutura de seda 8-0 y disecar entre los dos lazos. </li><li> Pasar a través de un manguito de tubo de nylon autoclavable en cada extremo del vaso y fijar cada extremo con pinzas microhemostat. </li><li> Quitar el lazo de sutura en un extremo y aplicar una gota de heparina (100 U / ml). Inmediatamente después, invertir el extremo distal del ésimoe arteria para cubrir todo el cuerpo del manguito y fijar el recipiente invertido con una sutura de seda 8-0 en el manguito. <ol><li> Repetir el mismo procedimiento para la otra porción de la arteria. Arteria Lavar con solución salina para eliminar los coágulos de sangre. </li></ol></li><li> Implantar un injerto de vaso descelularizado entre dos extremos de la arteria carótida por deslizamiento los extremos de los vasos de la descelularizados a través de los puños de la arteria y la fijación con suturas de seda 8-0. Eliminar pinzas vasculares de cualquiera de los extremos antes de evaluar la pulsación del injerto. </li><li> Coloque la glándula salival de vuelta a su posición original. Cierre de la piel en la ubicación quirúrgica con una sutura interrumpida usando una sutura de poliglactina 6-0. </li><li> Consistentemente observar los signos vitales de ratón después de que se completa el procedimiento, hasta que se reanude la conciencia. Sacrificar los ratones receptores por dislocación y de los vasos de la cosecha injertos cervicales ya sea 24 horas o 3 semanas más tarde para su posterior análisis. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.

El protocolo actual indica un sonido, la estrategia rápido, simple, eficiente y reproducible en la que los vasos de ingeniería tisular funcionales se pueden generar utilizando PIPSC a partir de fibroblastos humanos. Esta técnica representa una herramienta valiosa para la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos y terapia celular específica del paciente potencialmente en el futuro cercano. Los pasos críticos para garantizar la eficacia del protocolo incluyen la preparación de PIPSC, preparación de injertos aórtico...

La construcción de conductos vasculares es una estrategia fundamental para la reparación quirúrgica de los vasos dañados y heridos resultantes de enfermedades cardiovasculares. Hasta la fecha, los materiales utilizados en la cirugía de injerto biocompatible incluyen polímeros sintéticos (politetrafluoroetileno [teflón], politetrafluoroetileno expandido [ePTFE; Gore-Tex] o tereftalato de polietileno [Dacron]), aloinjertos, tejido autólogo (pericardio o vena safena) y xenoinjertos 1. Mientras que los injertos artificiales (por ejemplo, Gore-Tex y Dacron) son los más utilizados, estos materiales probablemente causan numerosas complicaciones a corto y largo plazo que incluyen la estenosis, la deposición de calcio, trombo-embolia y las infecciones. Aunque los pacientes con injertos biológicos presentes con una disminución de eventos tromboembólicos, todavía se encuentran con limitaciones, como el fracaso del injerto secundaria y durabilidad acortada debido a la degradación de la calcificación 2. Por lo tanto, a pesar de las mejoras significativas en t quirúrgicaechniques largo de los años, los investigadores y los médicos todavía están cargados con la necesidad de identificar el conducto ideal para enfermedades vasculares. Más recientemente, el campo de la investigación de la ingeniería de tejido vascular ha generado un concepto en el que las células se incorporan en estructuras biodegradables, con el objetivo de crear un entorno biomimético que personifica un recipiente funcional para injerto realizado con éxito 1. Fundamentalmente, el éxito de las construcciones vasculares depende de tres componentes esenciales; las células que componen el andamio, es decir, una capa interna de células endoteliales y una capa de células del músculo liso, un andamio que contiene la matriz extracelular apropiado para proporcionar propiedades mecánicas comparables a la vasculatura nativa, y la señalización molecular / celular que se requiere para iniciar / regulador reparación. La permeabilidad del injerto a largo plazo y el desarrollo sostenido de los neo-tejidos son altamente dependientes de la siembra de células eficaz de andamios, THereby haciendo que la decisión del tipo de célula de importancia crítica. Varios informes demuestran el uso de endoteliales maduras y las células musculares lisas de diferentes fuentes para desarrollar conductos de pequeño diámetro de 3-6. Aunque prometedores, la falta de vasos autólogos suficiente para obtener endoteliales maduras y las células musculares lisas siguen siendo una carga considerable. Más recientemente, las células madre a partir de diversas fuentes han sido explotados para aplicaciones de ingeniería de tejidos vasculares. Células mononucleares de hecho, las células madre pluripotentes una variedad de tipos de células madre, incluyendo células madre embrionarias 7, inducida (CMPI) 8,9, PIPSC 10,11, derivadas de la médula ósea 12, células madre mesenquimales 13, las células progenitoras endoteliales y la pared del vaso adulto -derivado células madre antígeno-1 (Sca-1) + células madre / progenitoras 14,15 todos se han demostrado que son capaces de diferenciarse en células endoteliales ya sea funcional o de músculo liso en respuesta a los medios de comunicación definidos ycondiciones de cultivo. Además, la capacidad ilimitada de auto renovación de las células madre a tomar mejores candidatos a diferencia endoteliales maduras y las células musculares lisas que sólo se puede dividir por un número finito de veces antes de someterse a la detención del crecimiento y la senescencia. La selección del material de andamio para generar tejido éxito recipiente diseñado para el injerto depende de varios factores tales como la biocompatibilidad, propiedades biomecánicas, y la velocidad de biodegradación. Fundamentalmente, los materiales utilizados para crear andamios para los injertos deben ser biodegradables y no se montarán las respuestas inmunes receptores innecesario. Además, debe abarcar una porosidad adecuada y la microestructura para la fijación celular y la supervivencia posterior. Hasta la fecha, los materiales más comunes usados ​​para andamios en la ingeniería de tejidos vascular incluyen polímeros de ácido poliglicólico, ácido poliláctico, y poli ε-caprolactona 16. Más recientemente, los materiales biológicos descelularizados tienenTambién ha aplicado con cierto éxito. Varios laboratorios han demostrado que la siembra de los vasos porcina humana descelularizado, canino o con células autólogas proporciona un injerto biológico que resistió la coagulación y la hiperplasia intimal 17-19. Otras estrategias de ingeniería de tejidos vascular incluyen injertos vasculares extracelulares basado proteínas de matriz por ejemplo, células de siembra en gel de fibrina 13 y generando láminas de células sin el apoyo del andamio 20, 21. El protocolo actual demuestra la diferenciación de PIPSC humano en endotelial funcional y células musculares lisas, la generación de un biorreactor que consiste en un andamio recipiente descelularizado para albergar células vasculares derivadas de PIPSC funcionales, y el injerto de los vasos de ingeniería tisular en la inmunodeficiencia combinada severa (SCID ) ratones. PIPSC son un tipo de célula óptima a utilizar para la ingeniería de tejidos de injertos de vasos ya que estas células no forman tumores en ratones o plantean ético yallo respuestas inmunes. Por otra parte, hemos demostrado que la estrategia para la generación de células musculares Pipa-células endoteliales y Pipa-lisas es eficiente y reproducible 10,11. A partir de entonces, se diseñó un recipiente de descelularizado para la siembra de las células vasculares derivadas de PIPSC para imitar las proteínas de la matriz que existe dentro de un vaso nativo, mejorando así la supervivencia de injerto y la eficacia. Además, la descelularización de los vasos antes de la siembra PIPSC previene la aparición de las respuestas inflamatorias montadas por tipos de células inmunes, tales como macrófagos. Más importante aún, este protocolo no sólo representan una metodología para generar prometiendo conductos vasculares para la traducción a los seres humanos, sino que también proporciona medios valiosos para el estudio y la comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la regeneración del tejido vascular a través de modelos de ratón.

<table><tbody><tr><td>Fibroblastos humanos CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>Fibroblastos embrionarios humanos prenatales</td></tr><tr><td>ATCC F-12K Medio (Modificación de Kaighn del medio F-12 de Ham)</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Medio DMEM knockout optimizado para células madre embrionarias</td><td>Life technologies (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Human Basic FGF-2&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>medio alpha-MEM</td><td>Tecnologías de vida (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>PDGF humano</td><td>R& D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>Solución de gelatina 2%</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td><td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Enzima de restricción PvuI</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Nucelofection Kit (NHDF Kit)</td><td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, Iluminación para microscopía estereoscópica</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>Iluminación de luz fría para microscopía</td></tr> <tr><td>estereoscópicaNikon Zoom Esterommicroscopio SMZ800</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sal sódica</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS Solución madre Reactivo de biología molecular</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (10 mg / ml)</td> <td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Agitador IKA Vibrax con plataforma de agitación VX 7&nbsp;</td><td>Jepson Bolton's, Janke& Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Accionamiento de bomba digital</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Cabezal de bomba de cartucho de 6 canales y 6 rodillos</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S cartuchos grandes para cabezal de bomba</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex tubo de bomba de silicona curada con platino, L/S 14, 25 pies</td><td>Cole-Parmer&nbsp;</td><td>WZ-96410-14</td><td>El tubo pasa a través de la bomba peristáltica</td></tr><tr><td>Tubo de silicona de 0,5 mm de diámetro interior, 0,8 mm de diámetro exterior</td><td>Los tubos SILEX</td><td>N / A</td><td>conectan la cámara de incubación, el depósito de medios y la cámara de cumplimiento&nbsp;</td></tr><tr><td>Racor Reductor 0.5 a 1.6, polipropileno natural</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>Adaptador conectar por encima de dos tipos de tubos Tubo de</td></tr><tr><td>1/32", ID 0.01" (250&micro; m) Material: PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>Tubería a través de la pared de la cámara de incubación que conecta el injerto con la tubería exterior</td></tr><tr><td>Accesorios de una pieza&nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>Fije los tubos anteriores a través de la pared de la cámara de incubación</td></tr><tr><td>Tubos de nailon (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm) &nbsp;</td>Los tubos <td>de Smiths Medical N/A</td> se <td>insertan en dos extremos del injerto de aorta</td><td></td></tr> <tr><td>NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl ratón</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suturas quirúrgicas, 8-0&nbsp; seda</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Neuroleptanalgésico para uso en ratones</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>Inducción de la anestesia</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de nylon</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>0,65 mm de diámetro y 1 mm de longitud; para hacer manguito arterial</td></tr><tr><td>Electrocoagulador</td><td>Martin&nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>Ligadura de ramas de arteria en la aorta</td></tr><tr><td>Pinza de microhemostático bipolar</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>Fijación de los extremos de los vasos</td></tr><tr><td>Dilatador de vasos</td><td>S& T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>Dilatador de recipiente</td><td>S& T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>Dilatador</td> de <td>recipiente S& T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>Mini aplicador&nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>Micro pinzas hemostáticas</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Suturas quirúrgicas, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

generación y acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

La construcción de conductos vasculares es una estrategia fundamental para la reparación quirúrgica de vasos dañados y lesionados como resultado de enfermedades cardiovasculares. El protocolo actual presenta una estrategia eficiente y reproducible en la que se pueden generar injertos de vasos de ingeniería tisular funcional utilizando células madre pluripotentes parcialmente inducidas (PiPSC) a partir de fibroblastos humanos. Diseñamos un biorreactor de andamio de vaso descelularizado, que imita de cerca la estructura de la proteína de la matriz y el flujo sanguíneo que existe dentro de un vaso nativo, para la siembra de células endoteliales de PiPSC o células de músculo liso antes del injerto en ratones. Este enfoque demostró ser ventajoso porque los ratones inmunodeficientes injertados con los injertos derivados de PiPSC presentaron una tasa de supervivencia marcadamente mayor 3 semanas después de la cirugía. Este protocolo representa una herramienta valiosa para la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos y la terapia celular potencialmente específica del paciente en un futuro próximo.

La generación exitosa de PIPSC fue confirmado 4 días después nucleofecting fibroblastos humanos con un plásmido linealizado pCAG2LMKOSimO llevar 4 factores de transcripción, Oct4, SOX2, KLF4 y c-myc (OSKM). PIPSC muestra un fenotipo notablemente distinta en comparación con fibroblastos (Figura 2A) y expresó los 4 factores de reprogramación en el mRNA (Figura 2B) y los niveles de proteína (Figura 2C) 10. La eficacia de un injerto vascular a base de PIPSC es al...

A continuación, presentamos un protocolo para generar ingeniería tisular injertos de vasos que son funcionales para el injerto en ratones por doble siembra de células madre pluripotentes inducidas parcialmente (PIPSC) - deriva células musculares lisas y PIPSC - células endoteliales derivadas de un biorreactor andamio buque descelularizado.

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

El objetivo general de este procedimiento es generar injertos de vasos diseñados mediante ingeniería tisular que sean funcionales para su injerto en ratones. Esto se logra primero reprogramando fibroblastos humanos en células madre pluripotentes parcialmente inducidas in vitro, las cuales son capaces de diferenciarse en células endoteliales y células musculares lisas. Luego, se extrae una aorta de un ratón sacrificado y se descelulariza con solución de dodecilsulfato de sodio o SDS para preparar los injertos de aorta descelularizados.A continuación, se configura el circuito de flujo del biorreactor para la siembra dual de células madre pluripotentes parcialmente inducidas. El paso final consiste en el injerto del tejido de células madre pluripotentes parcialmente inducidas con siembra doble en ratones. En última instancia, el análisis de las tasas de mortalidad en ratones a las tres semanas posteriores al injerto se utiliza para demostrar la funcionalidad de los injertos de vasos diseñados mediante ingeniería tisular.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades cardiovasculares porque se ha demostrado que genera con éxito vasos sanguíneos funciona

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se describe una técnica en la que se trasplanta una sección de la aorta abdominal de un ratón ortotópicamente a justo por debajo de las arterias renales en un receptor alogénico o singénico. Esta técnica puede ser útil en estudios en que se considera el trasplante de las grandes arterias de tamaño uniforme ventajosa.

El trasplante ortotópico aórtica en los ratones para el Estudio de la Enfermedad Vascular

Se describen protocolos para nuestros arteriosclerois de injerto de ratón (GA) modelos que implican la interposición de un segmento de vaso del ratón en un receptor de la misma cepa endogámica. Por retrocruzamiento de cambios genéticos adicionales en el recipiente de donante, el modelo se puede evaluar el efecto de los genes específicos en GA.

Modelos de ratón para Arteriosclerosis Graft

El modelo de trasplante de corazón murino de cuello uterino es muy adecuado para inmunológica así como estudios de la lesión de reperfusión de isquemia. Hemos modificado el procedimiento utilizando una técnica de manguito no sutura y realizado más de 1.000 trasplantes de éxito con este enfoque.  En esto, proporcionamos detalles adicionales de esta técnica para complementar el vídeo.

Murino Cervical Trasplante Cardiaco Modelo Usando una técnica de Cuff Modificado

Para mejorar nuestro conocimiento de la formación de neotejido celular y molecular, un modelo murino de la TEVG fue desarrollado recientemente. Los injertos fueron implantados como injertos de interposición de la vena cava infrarrenal en ratones C57BL / 6. Este modelo logra resultados similares a los obtenidos en nuestra investigación clínica, pero durante un transcurso de tiempo mucho más corto.

Implantación de la vena cava inferior interposición del injerto en modelo de ratón

Un protocolo de paso a paso para la colocación inter-posicional de ingeniería tisular buques (TEV) en la arteria carótida de una oveja mediante anastomosis de extremo a extremo y la evaluación digital en tiempo real en vivo hasta el sacrificio de animales.

Técnica quirúrgica para la implantación de la ingeniería tisular injertos vasculares y posterior<em&gt; En Vivo</em&gt; Monitoreo

Para estudiar el alotrasplante combinado de órganos sólidos y compuesto vascularizado, describimos un nuevo modelo heterotópico de trasplante de pared torácica, timo y corazón heterotópico en bloque en ratones utilizando una técnica de manguito cervical sin sutura.

Un microquirúrgica Modelo Novela de heterotópico, en bloque, pared torácica, el timo y el trasplante cardiaco en ratones

Presentamos un modelo de aórtica trasplante ortotópico utilizando la técnica de la manga en ratones. Es un método muy rápido de la anastomosis, que puede emplearse en estudios de enfermedad vascular.

Utilizando la técnica de la manga en un modelo murino de trasplante aórtico - un Video instructivo

Estenosis del injerto constituye un obstáculo fundamental en ingeniería tisular de la vía aérea recambio. Para investigar los mecanismos celulares subyacentes estenosis, utilizamos un modelo murino de reemplazo traqueal ingeniería tisular con células mononucleares de médula ósea (BM-MNC). Aquí detallamos nuestro protocolo, incluyendo fabricación de andamio, BM-MNC aislamiento, siembra del injerto y la implantación.

Siembra e implantación de un injerto traqueal tejido-dirigida biosintético en un modelo murino

Los modelos de trasplante cardíaco de ratón representan valiosas herramientas de investigación para estudiar la inmunología del trasplante. El presente protocolo detalla el trasplante cardíaco cervical heterotópico de ratón que implica la colocación de manguitos en la arteria carótida común del receptor y el tronco de la arteria pulmonar del donante para permitir el flujo sanguíneo laminar.

Trasplante cardíaco cervical heterotópico de ratón utilizando manguitos vasculares

Aquí, se presenta un protocolo para la implantación de un injerto vascular de ingeniería tisular en la arteria carótida del ratón utilizando la técnica del manguito, proporcionando un modelo animal adecuado para investigar los mecanismos de regeneración del tejido vascular.

Implantación de un injerto vascular de ingeniería tisular en la arteria carótida de ratón mediante la técnica del manguito

Este estudio presenta un modelo porcino para la evaluación de injertos de pequeño diámetro en arterias femorales. El modelo imita la dinámica vascular humana y evalúa de forma exhaustiva la permeabilidad del injerto, la hemodinámica y la remodelación vascular. Ofrece una valiosa plataforma para la prueba de injertos vasculares y su seguimiento con ecografía Doppler y angiografía.

Implante de injerto vascular femoral en un modelo porcino para probar injertos vasculares de pequeño diámetro

Aprende a generar injertos vasculares de ingeniería de tejidos funcionales mediante células madre pluripotentes parcialmente inducidas y un bioreactor de flujo. Este método permite evaluar la viabilidad en modelos murinos.

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

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