Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Este experimento examina bibliotecas químicas en busca de compuestos que modulen los mecanismos de control postranscripcional a través de las tres regiones principales no traducidas de las transcripciones. En primer lugar, identifique las tres regiones principales de interés no traducidas en el gen objetivo. Clone esta UTR de tres puntos primos en un plásmido reportero de control de El luciferasa para crear una transcripción quimérica de tres UTR de tres puntos primos de El Luciferasa.

Luego, de manera estable. Integre los dos plásmidos en una línea celular relevante para la enfermedad y siembre las células que llevan la transcripción quimérica en 96. Las placas de pocillos los tratan con una biblioteca de compuestos durante 24 horas y luego identifican las moléculas que afectan la actividad de la luciferasa.

Seleccione las moléculas seleccionadas para un posterior cribado de validación y, a continuación, trate tanto las células de control como las células portadoras de la transcripción quimérica UTR principal de tres estrellas de luciferasa con un subconjunto de biblioteca seleccionado. Los resultados diferenciarán si el efecto de un compuesto está mediado a través de las tres regiones principales no traducidas o a través de otras secuencias vectoriales. A diferencia de la mayoría de los ensayos de selección basados en reporteros.

Ensayos que se centran en la regulación de la transcripción, estos ensayos basados en células de informe se centran en la identificación de compuestos que modulan los niveles de transcripción del ARNm a través de tres regiones principales y traducidas. Recoja las células de neuroblastoma transfectadas de manera estable por tripsina asiática. Diluya las células a una concentración de dos veces 10 a la quinta célula por mililitro.

En RPMI que contiene 10%FBS y 1%L-glutamina para 27 placas. Prepare al menos 250 mililitros de suspensión celular, teniendo en cuenta la manipulación de líquidos, los volúmenes muertos y los pasos repetidos de pipeteo. A continuación, vierta la suspensión de la célula en un depósito estéril y colóquela en el escritorio del robot.

Cargue nueve planos blancos con código de barras. Placas inferiores de 96 pocillos y una caja de puntas de pipeta estériles de 200 microlitros en el escritorio del robot. Mezcle la suspensión celular, luego dispense 75 microlitros de células en cada pocillo de nueve placas.

Cubra las placas y permita que las células se sedimenten en el fondo del pozo durante 30 minutos para minimizar los efectos de los bordes. A continuación, coloque las nueve placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono e incube durante 24 horas. Del mismo modo, proceda con las placas restantes de nueve en nueve.

Descongele las placas de la biblioteca compuesta a temperatura ambiente. Llene un recipiente con PBS estéril y otro con 0,5% de DMSO en solución de PBS y colóquelos en el escritorio del robot. Para cada placa de la biblioteca.

Prepare y etiquete en consecuencia. Una placa de dilución. Ahora llene cada pocillo de columnas, de dos a 11 de las placas de dilución con 398 microlitros de PBS estéril.

A continuación, llene las columnas uno y 12 con 50 microlitros de 0,5% de DMSO en PBS estéril. A continuación, cargue las dos placas de dilución. Dos placas de biblioteca, dos cajas de puntas estériles de 50 microlitros y placas de seis celdas en el escritorio del robot.

Ahora destape las placas de celdas, pipetee dos microlitros de la solución madre de 10 milimolares de una de las dos placas de biblioteca en la placa de dilución correspondiente y mezcle bien. Usando el mismo conjunto de consejos. Transfiera tres microlitros de la dilución de 50 micromolares a las tres placas blancas de 96 pocillos con código de barras que contienen las células.

Reemplace el juego completo de puntas y repita las inducciones de celda para la segunda placa de biblioteca. Cubrir los cultivos e incubar durante 24 horas. A continuación, repita el proceso de dilución de compuestos e inducción celular para las placas de biblioteca restantes.

Equilibre el reactivo de luciferasa reconstituido de elección a temperatura ambiente. Coloque el depósito de luciferasa en el escritorio del robot y vierta el reactivo en él. Retire nueve placas de cultivos inducidos de la incubadora.

Colóquelos en el escritorio del robot, descúbralos y equilibre a temperatura ambiente. A continuación, añada 50 microlitros del reactivo de luciferasa por pocillo entre las placas. Introduzca un retardo igual al tiempo de lectura de luminiscencia de una placa.

Después de una incubación de 30 minutos. Primero registre el código de barras de la placa para asociarlo con el archivo de datos correspondiente. A continuación, coloque la primera placa en el luminómetro y mida la luminiscencia.

Después de un breve paso de agitación, repita las lecturas de luminiscencia para todas las placas de inducción. Luego recoge el reactivo de raza Lucifer restante y guárdalo a menos 20 grados centígrados. Una vez procesados los datos experimentales del cribado primario, se seleccionan los aciertos para confirmar la especificidad del compuesto mediante un contracribado de cerezas.

Elija los resultados seleccionados y cree un diseño para la nueva placa de cribado, incluidas las posiciones de los controles. A continuación, a partir de las alícuotas almacenadas en tubos individuales con códigos de barras 2D, cree nuevas placas HIIT. Seguir el mismo protocolo es para la detección.

Prepare 3 placas de 96 pocillos de cada línea celular estable por alta placa. Al día siguiente, trate las células con compuestos de biblioteca. Utilice cada placa alta para tratar tres placas de CHP 1 34 micken, tres UTR de primera calidad y tres placas con células de control a una concentración de trabajo de dos micromolares en 24 horas.

Mida la actividad de la luciferasa en todas las placas CHP 1 34, los tres conjuntos principales no traducidos y de control. Al igual que con el análisis de datos en el cribado primario, normalice los datos experimentales de los pocillos tratados con el promedio de los controles tratados en el vehículo en placa. A continuación, calcule la media y la desviación estándar de las réplicas para cada cálculo compuesto probado.

El cambio de pliegue de la actividad de la luciferasa en CHP 1 34 McIn tres UTR principales frente a CHP 1 34. Las celdas de control seleccionan valores límite de cambio completo arbitrarios de mayor que 1,5 y valores de P de significación de menos de 0,01. Este experimento examinó una biblioteca de compuestos del año 2000 en busca de posibles moduladores de los mecanismos de control postranscripcional ejercidos a través de las tres UTR principales del micrófono y el oncogén, los resultados de las señales de luciferasa de una sola de las 25 placas de la biblioteca representativas se muestran como un porcentaje del vehículo tratado.

Los controles muestran que la mayoría de los compuestos no provocaron ningún efecto aparente sobre las tres UTR principales. Se seleccionaron los aciertos donde se calcularon el valor medio y la desviación estándar en todos los valores del ensayo: los compuestos que reducen la actividad de la luciferasa por debajo del 20% son probablemente indicativos de una toxicidad celular pronunciada del compuesto. Este gráfico muestra resultados representativos para el contracribado de cuatro compuestos seleccionados designados WX, Y y Z. Ambos compuestos W y X dan lugar a un aumento de la expresión de luciferasa a partir del oncogén, tres indicadores principales de UTR, como lo indican la diferencia de cambio de pliegue y la prueba T. Tenga en cuenta que, mientras que los efectos de ambos compuestos W y X dependen realmente de tres compuestos principales de UTR, W no tiene un efecto significativo en la viabilidad celular.

Mientras que el compuesto X muestra cierta actividad citotóxica como lo indica la señal de luciferasa normalizada en las células de control CHP 1 34, ni el compuesto Y ni el compuesto Z a dos concentraciones micromolares muestran un efecto dependiente de UTR de tres puntos principales en los niveles de luciferasa. La disminución de la actividad de la luciferasa detectada en el cribado primario tras el tratamiento con el compuesto Y es más bien una consecuencia de la citotoxicidad. En el caso del compuesto Z, el aumento de la actividad de la luciferasa se debe a la inespecífica en términos de la activación de tres UTR principales del promotor viral.

Dado que se observa una regulación positiva equivalente tanto en los conjuntos de control como en los no traducidos En este ensayo de alto rendimiento, recuerde que la validación del calor primario en las celdas de control es fundamental para la discriminación de los compuestos que actúan verdaderamente a través de las tres regiones primarias no traducidas de aquellos compuestos que operan a través de un promotor.