Análisis de la autofagia en

El objetivo de este procedimiento es inducir y observar la autofagia en un hongo filamentoso. Esto se logra primero inoculando pequeños volúmenes de medio con nutrientes con esporas o pequeños fragmentos de micelio. En un segundo paso, se preparan almohadillas de ayuno en las cavidades de portaobjetos de vidrio, y luego se transfiere la inoculación sobre las almohadillas.

En el paso final, las placas de privación se incuban en una cámara húmeda para inducir la autofagia. Finalmente, la autofagia se puede rastrear mediante el seguimiento de la translocación de proteínas marcadoras fluorescentes de interés hacia las vacuolas utilizando microscopía fluorescente. Este método puede ayudar a estudiar cuestiones clave en el campo de la biología celular, como la identificación de nuevos compuestos que modulan el proceso de autofagia.

Para preparar un experimento de ayuno, si la cepa de interés de P cresa genum se mantiene en arroz verde, coloque primero dos o tres granos de arroz cubiertos con micelio en estado de saciedad en un tubo de microcentrífuga de 1,5 microlitros y llene el tubo con 500 microlitros de medio de crecimiento de extracto de levadura con glucosa o medio GG amplio. Luego, vortexee el tubo durante 30 segundos para que las esporas se desprendan del arroz e incube el tubo durante un día a temperatura ambiente. Al día siguiente, diluya la suspensión de esporas a una concentración de uno a 50 en agua del grifo estéril y mezcle bien si el p criógeno se mantiene en agar.

Utilice una punta de pipeta para transferir pequeñas porciones del micelio a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros que contenga 400 microlitros de agua del grifo estéril y aproximadamente 100 miligramos de perlas de vidrio. Luego, vortexee el tubo durante dos minutos para que el micelio se fragmente. Para cultivar el genum PCE en una placa de inanición, primero caliente la placa calefactora a aproximadamente 60 grados Celsius.

A continuación, caliente dos gramos de aros en 100 mililitros de agua del grifo en un microondas hasta que la solución resultante esté completamente clara, mientras el aros se enfría aproximadamente a 60 grados Celsius. Coloque un tubo microcetrífugo de 1,5 mililitros por muestra con 400 microlitros de agua del grifo estéril o solución compuesta. Luego, caliente los tubos y las laminillas microscópicas en la placa calefactora durante al menos 60 segundos.

Transfiera 400 microlitros de aros a 60 grados Celsius a todos los tubos, llevando el volumen total en cada tubo a 800 microlitros, y vortexe brevemente los tubos; luego coloque nuevamente los tubos en la placa calefactora para evitar la solidificación prematura. Ahora pipetee 140 microlitros de la solución adecuada de aros en la cavidad de cada portaobjetos microscópico. Tenga cuidado de no formar burbujas y nivele inmediatamente el aros con cubreobjetos, y luego deje reposar los portaobjetos durante aproximadamente cuatro minutos.

A temperatura ambiente, cuando las placas de aros hayan solidificado, utilice el pulgar o el dedo índice para retirar cuidadosamente las cubreobjetos y coloque las portaobjetos y las placas en una cámara húmeda. A continuación, pipetee cinco microlitros del P. ergenum previamente preparado en el centro de la placa de ayuno, y envuelva la cámara húmeda en una bolsa de plástico para mayor protección contra la desecación, teniendo cuidado de no mover demasiado la caja ni perturbar los cultivos. Luego, almacene los inóculos a temperatura ambiente durante al menos 20 horas antes de analizar las muestras.

Al día siguiente, transfiera los portaobjetos al papel de filtro seco y luego agregue 50 microlitros de agua sobre cada almohadilla de inanición. Utilice un cubreobjetos para exprimir el exceso de agua y retírelo con papel de filtro nuevo. A continuación, para cada portaobjetos, utilice un objetivo de 20 x para obtener una visión general del crecimiento del micelio.

Para evaluar la localización de la GFP en el Hy-Fi. Abra las imágenes con el objetivo de 63 x o 100 x. Finalmente, coloque nuevamente las laminillas en la cámara húmeda después de cada observación hasta el siguiente tiempo experimental.

En estas imágenes, se utilizó la cepa G-F-P-S-K-L-P Creo Genum para evaluar la degradación de peroxisomas a las 20 horas de incubación. No se observó GFP en las vacuolas, ni estaban agrandadas dichas organelas. Sin embargo, a las 40 horas de crecimiento, se pudieron visualizar vacuolas marcadas con GFP en algunos hifas, lo que indica la activación de la autofagia, con una mayor observación de fluorescencia GFP y vacuolas agrandadas a las 60 horas.

En este experimento, se utilizó un mutante delta 80 G uno de p caressa Genum como control negativo. Obsérvese la ausencia de agrandamiento de vacuolas y de GFP, incluso a las 60 horas de crecimiento. Como control positivo, se utilizó el fármaco estimulador de la autofagia rapamicina, tal como se observó con la cepa G-F-P-S-K-L no tratada. Las vacuolas marcadas con GFP se hicieron visibles tras 40 horas de crecimiento, y a las 60 horas el Hy-Fi quedó completamente lleno de grandes vacuolas que contenían GFP.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar la autofagia en hongos mentis.