Name: Instrumentación de Ovejas fetal Cerca plazo para multivariados Grabaciones no anestesiados crónicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Aprende a instrumentar ovejas fetales no anestesiadas para monitoreo fisiológico crónico mediante catéteres vasculares y electrocardiografía. Este modelo permite estudiar el desarrollo fetal durante perturbaciones fisiológicas.

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los autores agradecen el apoyo financiero de la Fundación de Investigación Perinatal Molly Towell, los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) y el Fonds de Recherche du Québec – Santé (a MGF) y la Red de Capacitación en Investigación Perinatal del CIHR-Quebec (QTNPR) (a LDD).
Los autores desean agradecer a Esther Simard, Marco Bosa, Carl Bernard y Carmen Movila por su asistencia técnica.

Cuidado de los animales a las directrices del Consejo Canadiense de los Animales y la aprobación por el Consejo de Montréal Universidad de los Animales (protocolo nº 10-Rech-1560). La información detallada sobre los materiales y métodos utilizados se proporciona en la Tabla 1. 1. Anestesia <ol><li> Insertar un catéter de un solo lumen en una vena yugular. </li><li> Sedate la oveja usando acepromacina (Atravet 10 mg / mL) 2 mg por vía intravenosa aproximadamente 30 min antes de la inducción de la anestesia con el fin de reducir el estrés asociado con el procedimiento que a su vez reduce los niveles de cortisol. </li><li> Administrar diazepam (Diazepam 5 mg / ml) 20 mg, ketamina (Ketalar 100 mg / mL) 4-5 mg / kg y propofol (Propofol 10 mg / ml) 0,5 a 1 mg / kg por vía intravenosa para inducir la anestesia general. </li><li> Inserte un catéter de intercambio de la vía aérea en la tráquea utilizando un laringoscopio con un tipo de hoja de Wisconsin (extralargas 350 mm Zurdo hoja) para ayudar con la intubación. Deslizar el tubo endotraqueal de silicio (diámetro de 9 a 12 mm Interior) fuera del catéter de cambio y de las vías respiratorias dentro de la tráquea. Esta técnica facilita el proceso de intubación. Inflar el manguito del tubo endotraqueal con cuidado para evitar la ulceración inducida por la presión de la tráquea y fijar el tubo en la cabeza de la oveja. </li><li> Conecte el tubo endotraqueal al circuito respiratorio de la máquina de anestesia y comenzar la ventilación mecánica inmediatamente. Ajustar la configuración de ventilador para mantener una P a CO 2 dentro de los límites normales de 35 a 45 mmHg. </li><li> Insertar un catéter en la arteria auricular (22 a 20 G; 1 en [0,9 x 25 mm] a 1,16 en [1,1 x 30 mm]) y conectarse a la tubería no conforme para supervisar la presión sanguínea arterial directa. </li><li> Utilice un monitor fisiológico multiparamétrico para registrar el electrocardiograma, presión arterial directa, la saturación de oxígeno (SpO 2), capnografía (PETCO2), y la temperatura cada 5 minutos. Transferir todas phdatos ysiologic a través de un cable serie a un equipo de recolección de datos fisiológicos central. Mantenga la temperatura normal del cuerpo utilizando una manta de agua circulante. </li><li> Administrar una solución de poli-iónico equilibrada a 10 ml / kg para la primera hora de la anestesia general y luego reducir a 5 mL / kg / h. </li><li> Administrar trimetoprim-sulfadoxina 5 mg / kg IV de la oveja justo antes de la incisión de la piel como la profilaxis antibiótica. </li><li> Utilizar técnicas asépticas estándar con todas las manipulaciones quirúrgicas de la oveja y el feto. </li><li> Barrera enfermera las ovejas en todo momento. Esto incluye también el personal no quirúrgicos. Esto minimizará el potencial enzoótica para, por ejemplo, Coxiella burnetii. Utilice guantes y máscaras (N-95 tipo) en todo momento. </li></ol> 2. Descripción del Procedimiento Quirúrgico <ol><li> Haga una 20 cm incisión a través de la pared abdominal inferior inmediatamente craneal a la ubre a través de la línea alba para minimizar el daño del músculo abdominal. <ol><li> Retract epiplón mayor craneal y los cuernos uterinos se palpan manualmente. Palpar cada cuerno del cuerpo del útero a la punta del cuerno notar el número de fetos y su tamaño. Si hay más de un feto, elegir el feto más grande mediante la evaluación manualmente el tamaño de la cabeza y la anchura entre las órbitas. </li><li> Sostenga la cabeza del feto elegido firmemente a través del útero parcialmente exteriorizado. Realice una histerotomía 10 cm en la gran curvatura con tijeras Metzenbaum. Poner inmediatamente sobre la cabeza de un guante quirúrgico estéril sin látex lleno con solución salina estéril como si fuera una mano. Como alternativa, utilice los 4x4 humedecidas para mantener la cabeza del feto húmedo. Asegure el útero a la pared abdominal. <ol><li> Exteriorizar los derecho e izquierdo miembros torácicos y tire suavemente el feto fuera del útero hasta el proceso xifoides. </li></ol></li><li> Inserte catéteres de polivinilo en la vena braquial derecha y la izquierda y las arterias utilizando una técnica de corte hacia abajo estándar. Inserte another de polivinilo catéter en la cavidad amniótica por fijando su extremo con el esternón del feto. <ol><li> Utilice sólo catéteres estériles. Se recomienda la esterilización de gas en su instalación estándar. Adjuntar cada catéter a una aguja y la aguja a una doble llave de paso para permitir el muestreo de sangre posterior o monitorización de la presión. </li></ol></li><li> Sutura electrodos de acero inoxidable a la manubrio, apéndice xifoides y para cada punto del hombro para vigilar el electrocardiograma (ECG). </li><li> Volver al feto en el útero. Todos los catéteres y electrodos de salida a través de una pequeña incisión en el flanco izquierdo. </li><li> Cierre la incisión de laparotomía usando un cierre de tres capas. Suturar la pared abdominal con una sutura de monofilamento sintético absorbible USP 2 en una manera simple continua. Cierre el espacio subcutáneo con una sutura trenzada absorbible sintético USP 0 en una sencilla forma continua. Utilice grapas de acero inoxidable quirúrgicas para cerrar la incisión de la piel. </li></ol></li><li&gt; Descripción detallada del procedimiento quirúrgico <ol><li> Retire la lana por el afeitado el proceso xifoides a la glándula mamaria y largo del pliegue del flanco en cada lado con una hoja # 40. Limpie el abdomen ventral a continuación a fondo con un gluconato de clorhexidina al 4% y un cepillo suave durante 3 min. <ol><li> Realizar un lavado estéril estándar con gluconato de clorhexidina al 4% a partir del centro del abdomen y progresando de manera centrífuga durante 3 min. Vierta solución salina estéril en el abdomen para quitar el jabón desinfectante. Para la etapa final de la preparación quirúrgica, realizar tres pasajes alternos de solución de gluconato de clorhexidina al 2% y alcohol isopropílico al 70%. </li></ol></li><li> Asegúrese de que la profundidad de la anestesia es la adecuada antes de la incisión. Hacer una incisión de laparotomía estándar desde el ombligo hasta justo craneal a la ubre a través de la línea alba para minimizar el daño del músculo abdominal. </li><li> Inserte un largo fórceps de esponja en el abdomen a lo largo de la pared abdominal izquierda arribaal sitio de salida prevista para los catéteres en la región paracostal. <ol><li> Empuje la punta de la pinza contra la pared hasta que un asistente puede localizarlo y confirmar el lugar apropiado. Abra ligeramente (1 cm) las mandíbulas de las pinzas y dejar que el asistente crea un 2 cm incisión de espesor total. </li><li> Exteriorizar las puntas de las pinzas a través de la incisión, abrirá de nuevo, y agarre suavemente los catéteres con las pinzas que finalmente se retiró del abdomen a través de la incisión abdominal ventral. Es de destacar que algunos grupos implantan los catéteres y luego exteriorizan ellos. Esto tiene el inconveniente de que la monitorización del ECG fetal intraoperatorio no es posible. </li></ol></li><li> Palpar el útero para determinar la posición y los números fetal. Determinar el mayor feto utilizando la distancia inter-aural. Incisión en la pared uterina en la gran curvatura sobre el dorso de la cabeza, evitando los cotiledones. <ol><li> Inserte una cánula de extremo romo a través de las membranas de la placenta para obtener un ammuestra gratis por hemorragia fluido niotic. Incisión en las membranas de la placenta con unas tijeras. </li></ol></li><li> Exteriorizar la media craneal del feto a través de esta incisión. Coloque un guante quirúrgico de látex no estéril lleno de solución salina estéril a 37 ° C sobre la cabeza del feto para ayudar a mantener la normotermia. <ol><li> Durante la retirada de la parte superior del cuerpo del feto desde el útero, tienen el asistente que mantenga arriba de la Babcock para evitar la pérdida de líquido amniótico. Entonces, de nuevo utilizando fórceps Babcock, sujetar las membranas fetales y pared uterina a la piel para evitar la contaminación abdominal con líquido amniótico. </li><li> Expose sólo las partes del cuerpo fetal que necesitan ser instrumentado y mantener las partes restantes dentro del útero o cubiertos por paños estériles húmedas y calientes (37 ° C), respectivamente. </li></ol></li><li> Secuestrar a ambos miembros torácicos para facilitar la exposición a la arteria braquial y la vena bilateralmente. Una incisión a lo largo de la cara medial de ambos antebrachium y cuidadodiseccionar completamente alrededor de la arteria braquial y la vena. </li><li> Inserte catéteres de polivinilo en el derecho y las arterias braquial izquierda y el brazo izquierdo de la vena utilizando una técnica de corte hacia abajo estándar. <ol><li> Libertad para los buques que se cateterizó del tejido adyacente más de 1 cm. Ligar la porción distal del vaso con un trenzado de sutura absorbible sintética de 2-0 USP. Preplace una ligadura en el aspecto proximal del vaso pero mantenerlo no condicionada. <ol><li> Con unas tijeras Castroviejo, cortar transversalmente el recipiente a aproximadamente el 30% de su diámetro. Detenga el flujo de sangre parcialmente tirando de la sutura proximal. Insertar el catéter en una dirección proximal. </li></ol></li><li> Inserte el catéter de polivinilo hasta 8 cm proximal o hasta que se detecta la resistencia y luego tire un poco hacia atrás. Temporalmente asegurar el aspecto proximal del catéter utilizando una pinza vascular. Coloque otra sutura alrededor tanto en el aspecto proximal y distal del catéter. Un asistente está continuamente aspirating y el lavado del catéter para asegurar la permeabilidad del catéter. </li><li> Cierre la piel fetal utilizando una sutura sintética absorbible trenzada USP 2-0, con un patrón de sutura continua. </li></ol></li><li> A la derecha y el hombro izquierdo, manubrio y el proceso xifoides, fijar un electrodo de acero inoxidable aislado para facilitar el seguimiento del ECG fetal. </li><li> Suturar la presión amniótico y el catéter de muestreo hasta el esternón. Este catéter está fenestrado en su extremidad. </li><li> Asegure todos los catéteres en el dorso del feto usando un material trenzado sutura sintética absorbible USP 2-0. </li><li> Antes de la sustitución del feto de nuevo en el útero, administrar clenbuterol 30 mg IV lentamente durante 15 min para evitar la hipotensión y para proporcionar relajación uterina. </li><li> Suturar las membranas fetales usando USP 4-0 material de sutura absorbible sintética trenzada con un patrón continuo. Incorporar un solo catéter o electrodo a la vez en los closure para asegurar un cierre estanco. Utilice un patrón de doble capa de Cushing respetando principios Halsted para cerrar la capa muscular del útero mediante un trenzado de material de sutura absorbible sintética USP 0. Denunciar los nudos quirúrgicos con cuidado. </li><li> El uso de un patrón de sutura en bolsa de tabaco, asegurar todos los catéteres y cables de ECG cuando se aproximan a la incisión paracostal izquierda. </li><li> El uso de un monofilamento sintético material de sutura absorbible USP 2 asegurar la línea alba con un patrón continuo. Cierre los tejidos subcutáneos utilizando USP 2-0 trenzado material de sutura absorbible sintética con un patrón continuo. Asegure la capa de la piel con grapas quirúrgicas. </li><li> Administrar 250 mg de ampicilina por vía intravenosa y de nuevo a través del catéter amniótico en la cavidad amniótica. Reemplazar los líquidos perdidos amniótico con solución salina tibia. </li><li> Coloque todos los catéteres exteriorizados y electrodos de ECG en una bolsa de lugar para mantener la esterilidad. Coloque un jersey alrededor del torso de la oveja para asegurar toda la una catéteresd electrodos en el cuerpo de la oveja. </li><li> Deje de anestesia general, y retirar la intubación la oveja vez reflejos laríngeos han vuelto a la normalidad. </li><li> Volver a la oveja a una jaula metabólica una vez que ella es estable después de la anestesia general. La oveja residirá en la jaula metabólica durante la duración del experimento. La oveja debe ser capaz de pararse, acostarse y comer a voluntad mientras se controla el feto no anestesiados sin sedante a la madre. </li><li> Para los siguientes tres días, administrar antibióticos de forma profiláctica a la oveja (Trimetoprim sulfadoxina 5 mg / kg) y el feto (250 mg de ampicilina por vía intravenosa y de nuevo a través del catéter amniótico). </li><li> Evaluar el estado metabólico de tanto oveja y el feto mediante análisis de sangre de gas. </li><li> Lave todos los catéteres con el volumen mínimo de solución salina heparinizada posible. Precaución - no exceda la dosis diaria de heparina y fluidos permisible para el feto. Es posible fluido sobrecargar el feto. Flush lentamente una vezun día ~ 5 ml de NaCl por línea después de la profilaxis antibiótica. </li></ol></li><li> Grabación y análisis de datos <ol><li> Durante la cirugía, opcionalmente registrar las tasas de ECG y del corazón de la madre y del feto, así como la presión arterial de la madre y la presión de la vía aérea (Paw) de forma continua (Figura 1). Utilice la ventana Monitor de vida para adquirir todos los datos maternos excepto ECG. Alimente estos datos en convertidor analógico-digital, junto con las señales de ECG fetal y materna; pasar ECG materno y fetal por primera vez en 1,901 mil pre-amplificador. Grabar y visualizar todos los datos en el software del fabricante. </li><li> Tomar una muestra arterial 1 ml al mismo tiempo de la oveja y el feto para el análisis de gases en sangre arterial, lactato, glucosa y basar el exceso de determinación (en el plasma) en el inicio de la cirugía fetal (inmediatamente después de insertar el primer catéter arterial) y después de cerrar el útero . </li><li> Durante la recuperación postoperatoria, tomar un 3 ml de muestra de sangre fetal para medir la IL-6 y TNF-α inflammperfiles Atory. Centrifugar el plasma a 4 ° C (4 min, 4000 xg), se decanta y almacenar el plasma a -80 ° C para la prueba de ELISA subsiguiente. Nota: A los efectos de los resultados representativos reportados, seis días después de la cirugía los animales fueron sacrificados mediante la inyección intravenosa de pentobarbital sódico 20 ml. El crecimiento fetal se evaluó por el cuerpo, el cerebro, el hígado y pesos maternas. La duración del período experimental, obviamente, varían en función del diseño elegido para la pregunta de investigación particular y puede alcanzar ~ 6 semanas. </li></ol></li><li> Análisis de citoquinas (paso opcional) <ol><li> Determinar las concentraciones de citoquinas (IL-6, TNF-alfa) en el plasma utilizando un sándwich ELISA específico ovina. Anticuerpos monoclonales anti-oveja Pre-capa de ratón (anticuerpo de captura IL-6) o anticuerpo monoclonal de ratón anti-bovina (TNF-α) a una concentración 4 g / ml en la placa de ELISA a 4 ° C para O / N, después 3 veces lavar con tampón de lavado (0,05% Tween 20 en PBS, PBST). </li><li>Bloquear las placas durante 1 h con 1% de BSA en PBST. Lavar las placas con tampón de lavado 3 veces. </li><li> Utilice proteínas recombinantes ovejas (IL-6, TNF-alfa) como estándar ELISA, se preparan unas diluciones seriadas van desde estándar de 1 de 2.000 ng / ml a nivel 7 de 31,25 pg / ml. </li><li> Carga de 50 l de estándares de proteína diluidas en serie y muestras por pocillo e incubar durante 2 horas a RT, se lavan las placas 3 veces. Ejecutar todos los estándares y las muestras por duplicado. </li><li> Aplicar 50 l de anticuerpos policlonales de conejo anti-oveja (anticuerpo de detección IL-6) o anticuerpo policlonal de conejo anti-bovina (TNF-a) a una dilución de 1: 250 en pocillos e incubar durante 30 min a TA. Lavar las placas con tampón de lavado 5 veces. </li><li> Añadir 50 l de la cabra anti-IgG de conejo conjugado con HRP (dilución 1: 5000) durante 30 min. </li><li> Incubar con 50 l de solución de sustrato TMB por pocillo. </li><li> Detener la reacción desarrollo de color a tiempo deseado con 25 l de 2 N de ácido sulfúrico. </li><li> Lea la plates en ELISA lector de placas a 450 nm, con una corrección de longitud de onda 570 nm. Nota: En nuestros ensayos, la sensibilidad de IL-6 ELISA fue de 16 pg / ml, la sensibilidad de TNF-ELISA fue de 13,9 pg / ml, respectivamente. Para todos los ensayos, los intra-ensayo e inter-ensayo coeficientes de variación fue &lt;5% y &lt;10%, respectivamente. </li></ol></li><li> Análisis estadístico Nota: Los métodos estadísticos exactos dependerán de la pregunta de investigación. Aquí mostramos los métodos utilizados para la prueba de diferencias significativas en los gases en sangre reportados en la Tabla 2. <ol><li> Pon a prueba la distribución normal de datos mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov, seguido de pruebas paramétricas o no paramétricas con ajuste para comparaciones múltiples, según corresponda. </li><li> Use K-means análisis de conglomerados para identificar los fetos en la cohorte que eran espontáneamente hipóxica y determinar los respectivos valores de pO 2 y O 2 Sab (considere pO2 &lt;20 mmHg o O 2 sáb &lt;55% como fetal hipoxia). 44-48 de </li><li> Utilice el software estadístico como SPSS para el análisis. </li><li> Los datos actuales como media ± SD con diferencias estadísticas en p &lt;0,05 consideró significativo. </li></ol></li></ol>

No se han hecho divulgaciones.

El anestésico y los procedimientos quirúrgicos se presentan que son necesarios para el establecimiento de un modelo animal para el estudio de la fisiología y la fisiopatología fetal: la oveja fetal no anestesiado instrumentado crónicamente. Cuatro pasos críticos en el protocolo debe hacerse hincapié. En primer lugar, pasar los catéteres y electrodos a través del flanco materna: es importante que esto se hace a la vez para evitar cualquier lesión de órganos internos. En segundo lugar, fijar e...

Una variedad de modelos animales existe para el estudio de ambos embarazos normales y comprometidos, incluyendo roedores de laboratorio, primates no humanos y los rumiantes domésticos. 1,2,3,4,5 El ovejas gestantes instrumentado crónicamente ha sido ampliamente utilizado durante 50 años como un modelo de desarrollo fetal humano y las respuestas a los estímulos fisiopatológicos tales como lipopolisacárido (LPS). 10.06 Las lesiones después de la exposición LPS imitan exactamente lo que se ve en los recién nacidos prematuros con leucomalacia periventricular, que se debe a un perfil de maduración similar de ambas especies. 11, 12 Otras complicaciones del embarazo también se han estudiado con gran detalle, como el descubrimiento de que los glucocorticoides prenatales promueven el desarrollo pulmonar 13-15 y comprender el impacto de la restricción del crecimiento intrauterino (RCIU) en el feto 16,17. El uso extensivo del modelo de oveja fetal se debe a la unique amenability de la oveja fetal no anestesiado a la colocación y el mantenimiento de catéteres y electrodos quirúrgica, lo que permite el muestreo de sangre repetitivo, registro de la actividad bioeléctrica, la aplicación de la estimulación eléctrica y en imágenes del cerebro vivo. 18 de telemetría también es posible, aunque se usa con menos frecuencia sin embargo, debido a la sofisticación más alta para establecer, así como el coste inicial y de mantenimiento. 19 Por otra parte, el modelo de oveja fetal es muy versátil ya que son posibles muchas variaciones de la instrumentación en función de las medidas de interés. Por ejemplo, es posible grabar más de días a semanas señales multivariados en tiempo real tales como los movimientos fetales de respiración, la actividad eléctrica cerebral, respuestas cardiovasculares, electrocardiograma, el flujo sanguíneo regional a una serie de órganos usando sondas de flujo o microesferas, etc. Gracias a esta versatilidad, se han llevado a cabo una amplia gama de estudios que incluye el desarrollo de la cardisistema medades 20,21, (HPA) del eje hipotálamo-pituitario-adrenal 22, el desarrollo del cerebro y el desarrollo de 23 estados del sueño, en particular, de 24 años, los efectos de la hipoxia / asfixia 25, la hipotermia terapéutica 26, inflamación 6-11, combinación de ambos de 27 años, los glucocorticoides 28,29, antidepresivos 30, displasia broncopulmonar (DBP) 31,32, la programación fetal 33,34,35,36,37,38,39 o el desarrollo de modalidades de monitoreo fetal novela antes y durante el parto, por nombrar sólo pocas áreas de investigación. 40,41,42,43 El objetivo general del método presentado es mostrar la aplicación básica de este modelo versátil. Permite establecer una amplia variedad de protocolos experimentales agudos y crónicos que estudian la fisiología y la fisiopatología fetal en el integrador, órgano, los niveles celular y molecular.

<table><tbody><tr><td>ACE Fuente de luz</td><td>Schott-Fostec</td><td>A20500</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060 - 11</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección en ángulo</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006 - 09</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003 - 12</td><td>herramienta de disección alterna</td></tr><tr><td>Hojas de bisturí curvadas #12</td><td>Fine Science Tools</td><td>10012 - 00</td><td>herramienta de disección alterna</td></tr><tr><td>Tijeras para huesos</td><td>Fine Science Tools</td><td>16044 - 10</td><td></td></tr><tr><td>S & Pinza de atado de sutura en T</td><td>Fine Science Tools</td><td>00272 - 13</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Dumont SS - angulada</td><td>Fine Science Tools</td><td>11203 - 25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de seda trenzada tamaño 6-0</td><td>Teleflex Medical</td><td>07 - 30&nbsp; - 10</td><td></td></tr><tr><td>Cinta Médica</td><td>transpore</td><td>3M</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina 100 mg/ml</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409 - 2051 - 05</td><td>Final Does es de 80 mg/kg</td></tr><tr><td>Tranqui Ved Injection (xilacina 100 mg/ml)</td><td>Vecdo</td><td>NDC 50989 - 234 - 11</td><td>Final Does es de 10 mg/kg</td></tr><tr><td>Naranja reactivo 14</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R - 8254</td><td></td></tr><tr><td>Ringers Componentes de</td><td></td><td></td> la solución <td>La solución está equilibrada con gas 95% O2 y 5% Co2, pH final 7.4</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7653</td><td>Concentración final: 118 mM</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217 - 3</td><td>Concentración final: 4.7 mM</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79 - 500</td><td>Concentración final: 2,5 mM</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>P -285</td><td>Concentración final: 1,2 mM</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>J.T. Baker</td><td>Ene-00</td><td>Concentración final: 0,57 mM</td></tr><tr><td>4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico ácido (HEPES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 310 - 500</td><td>Concentración final: 5,95 g/L</td></tr><tr><td>glucosa</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G8270</td><td>Concentración final: 5,5</td></tr><tr><td>mM LifeWindow</td><td>Digicare Biomedical Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidades de bioamplificador y ADC</td><td>Cambridge Electronic Design Limited, Unit 4, Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 0FE INGLATERRA.</td><td>Bioamp: 1902; ADC: micro1401; Software de adquisición de datos: Spike 2, V7.13</td><td></td></tr><tr><td>Bioamplificador de señal analógica Neurolog</td><td>Digitimer Ltd 37 Hydeway Welwyn Garden City Hertfordshire, AL7 3BE, Inglaterra</td><td>NL108A</td><td></td></tr><tr><td>ABL800Flex</td><td>Radiometer Canadá; 200 Aberdeen Dr, Londres, ON N5V 4N2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5804R Eppendorf</td><td>Canadá; 2810 Argentia Road, #2 Mississauga, Ontario, L5N 8L2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Set de cateterismo yugular Arrow</td><td>Arrow International, Inc., 2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 EE. UU</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>Atravet</td><td></td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Diazepam</td><td></td><td></td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Ketalar</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Propofol</td><td></td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>SurgiVeT</td><td>Tubos Endotraqueales; Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catéter de intercambio de vías respiratorias de Cook con adaptadores RAPI-FIT</td><td>Cook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 EE. UU</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>Ventilador Dispomed</td><td>Dispomed Ltd., 745 Nazaire-Laurin, Joliette, Quebec J6E 0L6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte-W</td><td>Becton Dickinson, Infusion Therapy Systems Inc., 9450 S State St, Sandy Utah 84070 EE. UU.</td><td></td><td>de 22 a 20 g; 0,9 x 25 mm [1,1 pulg.] a 1,16 pulg. [1,1 x 30 mm]</td></tr><tr><td>Edwards Lifesciences Ref: PX272 Kit de control de presión con presión</td><td></td><td></td><td></td>desechable TruWave</tr><tr><td>LifeWindow LW6000</td><td>Digicare Biomedical Technology 107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 EE. UU</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>Catéteres</td> de polivinilo Gaymar <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Babcock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>SCI (Scientific Commodities Inc.)</td><td></td><td>2 metros</td></tr><tr><td>2-0 Vicryl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo tijeras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>electrocardiograma (ECG)</td><td>LIFYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlín, Alemania</td><td></td><td>cuatro electrodos de cobre en una sola vaina, 2 metros</td></tr><tr><td>2-O Vicryl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-0 Vicryl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDS II USP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trimetoprim sulfadoxina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stopcock</td><td>Argon Medical, Cat&nbsp; 041220001A</td><td></td><td>Llave de paso doble de 4 vías con bloqueo Luer macho</td></tr><tr><td>Agujas Tyco</td><td>Healthcare 8881202389</td><td></td><td>Monoject Agujas romas de buje de aluminio, 22Gx, 0,7 mm x 38,1 mm: para catéteres fetales arteriales y venosos</td></tr><tr><td>Agujas</td><td>Tyco Healthcare 8881202322</td><td></td><td>Monoject Agujas romas de buje de aluminio, 16Gx, 1,6 mm x 38,1 mm: para catéteres amnióticos</td></tr></tbody></table>

instrumentación de ovejas fetal cerca plazo para multivariados grabaciones no anestesiados crónicas

Instrumentation of Near-term Fetal Sheep for Multivariate Chronic Non-anesthetized Recordings

La oveja preñada instrumentada crónicamente se ha utilizado como modelo del desarrollo fetal humano y de las respuestas a estímulos fisiopatológicos como endotoxinas, bacterias, oclusiones del cordón umbilical, hipoxia y diversos tratamientos farmacológicos. En este modelo se han desarrollado las prácticas clínicas que salvan vidas del tratamiento con glucocorticoides en fetos con riesgo de parto prematuro y la hipotermia terapéutica. Esto se debe a la singular facilidad de las ovejas fetales no anestesiadas para la colocación quirúrgica y el mantenimiento de catéteres y electrodos, lo que permite la toma de muestras de sangre repetitivas, la inyección de sustancias, el registro de la actividad bioeléctrica, la aplicación de estimulación eléctrica y la obtención de imágenes de órganos in vivo. En este trabajo describimos el procedimiento de instrumentación quirúrgica necesario para lograr un modelo de oveja fetal no anestesiado estable y crónicamente instrumentado, incluyendo la caracterización de la recuperación postoperatoria desde el punto de vista gasometral, metabólico e inflamatorio.

38 ovejas con plazos de fecha embarazadas fueron instrumentados a 128 ± 2 días de gestación (DGA, ~ 0,88 gestación, plazo 145 DGA) con arterial, venosa y catéteres amniótico y el electrocardiograma (ECG) electrodos con una técnica estéril bajo anestesia general (tanto oveja y el feto ). En caso de embarazo gemelar feto grande fue elegido en base a la palpación y estimar el diámetro intertemporal; alternativamente, el feto a ser instrumentada puede ser seleccionado al azar para evitar cualquier sesgo potencial o ambos fe...

El modelo de oveja fetal no anestesiado instrumentado crónicamente se utiliza para estudiar el desarrollo del feto humano en la salud y la enfermedad, ya que permite la colocación quirúrgica y el mantenimiento de los catéteres y electrodos, muestreo de sangre repetitivo, la inyección de sustancias, registro de la actividad bioeléctrica, y de imágenes in vivo. Se describen los procedimientos necesarios para establecer este modelo.

Instrumentación de Ovejas fetal Cerca plazo para multivariados Grabaciones no anestesiados crónicas

The chronically instrumented pregnant sheep has been used as a model of human fetal development and responses to pathophysiologic stimuli such as ...

El objetivo general de este procedimiento es describir la instrumentación del feto OV para la monitorización fisiológica a largo plazo en respuesta a cualquier perturbación fisiológica; este modelo de investigación permite el acceso vascular y la monitorización electrocardiográfica y de otras señales bioeléctricas del feto no anestesiado in utero. Esto nos proporciona información sobre los cambios que ocurren durante una perturbación fisiológica, como una oclusión vascular o la inyección de un mediador proinflamatorio. Este modelo es clínicamente relevante para comprender el desarrollo fetal en estados sanos y patológicos.Todos los procedimientos con animales descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Ética para el uso de animales de la Universidad de Montreal y siguieron las directrices establecidas por el Consejo Canadiense para el Cuidado de los Animales. Este es un experimento no superviviente. El protocolo anestésico descrito aquí tiene efectos mínimos sobre la respuesta inflamatoria.La adición de una pequeña dosis de propofol reduce los reflejos laríngeos, facilitando así la intubación. Se utiliza un monitor fisiológico multiparamétrico durante todo el período anestésico. Aquí se pueden ver todos los parámetros fisiológicos maternos medidos.El electrocardiograma, la presión arterial directa, la presión de las vías respiratorias, la pulsioximetría, la capnografía, el nivel de anestésico espirado, la temperatura y el análisis de gases en sangre arterial se conectan al monitor materno mediante un dispositivo de adquisición de datos de diseño electrónico Cambridge. El uso de un cable de interfaz personalizado permite la visualización sincronizada de los datos fisiológicos maternos y fetales. El abdomen de la U se prepara utilizando técnicas asepsia estándar.La U está inclinada ligeramente hacia la derecha para permitir la salida de los catéteres vasculares y del cable de ECG antes y durante la cirugía. La profundidad de la anestesia se evalúa mediante varios reflejos neurológicos, como la posición del ojo, el reflejo palpebral, el tono mandibular y la respuesta a la estimulación quirúrgica. Se realiza una incisión media utilizando una hoja de bisturí.Las técnicas de hemostasia utilizadas en este estudio consistieron en la ligadura de los vasos o en compresión simple. Se realiza la ligadura de la vena abdominal subcutánea media. Se realiza una disección neta de la grasa subcutánea hasta que el ligamento elíptico queda claramente identificado.Se realiza una incisión cuidadosa a nivel del ombligo. Luego se introduce un dedo a través de esta pequeña incisión para asegurarse de que no haya adherencias ni estructuras vitales inmediatamente debajo de ella. Se puede utilizar el mango de la pinza de Nason Brown para proteger el borde cortante de la hoja del bisturí durante la incisión, protegiendo así las estructuras anatómicas subyacentes.Inicialmente, se palpa el útero para identificar los dos cuernos uterinos y contar el número de fetos presentes. Es posible tener trillizos, y la probabilidad de completar con éxito el tratamiento es menor. Por lo tanto, no recomendamos utilizar trillizos.Se selecciona el feto más grande utilizando la distancia interoral devuelta al abdomen para permitir la inserción de los catéteres vasculares y la esponja de cable de ECG; se insertan fórceps en la parte izquierda de la cavidad abdominal a lo largo de la pared abdominal, donde se empujan contra el flanco izquierdo. Se realiza una pequeña incisión sobre estos fórceps. Luego, los catéteres vasculares y el cable de ECG se pasan a través de esta incisión y salen por la incisión abdominal.Es importante verificar que se tienen todos los catéteres vasculares y el cable de ECG antes de comenzar el resto de la cirugía. Se exterioriza la cabeza del feto y se identifica un área del útero, que está libre de cotiledones. Se identifican las derivaciones a lo largo de la curvatura mayor.Primero se realiza una pequeña incisión utilizando una hoja de bisturí. Luego, esta incisión puede ampliarse sobre la cabeza del feto usando tijeras, con cuidado de mantener intacto el amnios para minimizar el riesgo de lesión. El líquido amniótico se toma mediante un catéter de extremo romo antes de abrir el amnios, con el fin de minimizar la contaminación con sangre.Esta muestra puede utilizarse para detectar la presencia de cambios inflamatorios. La cabeza se separa de las membranas fetales y se coloca inmediatamente dentro de un guante quirúrgico. El guante se llena con agua tibia para ayudar a mantener la normotermia. Se colocan fórceps de Babcock sobre las membranas fetales, el útero y la piel para ayudar a reducir la pérdida de líquido amniótico y el daño al tono placentario debido a la manipulación quirúrgica.El campo quirúrgico se aísla utilizando campos estériles. El primer paso de la instrumentación fetal es la inserción de un catéter arterial. Se realiza una incisión a lo largo de la cara medial del húmero.En el punto medio del húmero, se realiza una disección roma de la arteria braquial desde el interior, entre los vientres musculares. Luego se pasa un bucle de material de sutura absorbible por debajo de la arteria. A continuación, se corta el bucle y se tiran de las dos piezas de material de sutura hacia cada extremo de la arteria.El extremo distal de la arteria se liga. Se hace un lazo alrededor del extremo proximal y se utiliza para ejercer tracción sobre la arteria, facilitando así la creación de una pequeña incisión en la arteria mediante tijeras RS. Se inserta un catéter de vinilo de grado médico micro en la arteria utilizando fórceps.Una alternativa a la pinza es el uso de un dilatador de vasos. La punta de un dispositivo dilatador de vasos puede insertarse en la incisión para facilitar la inserción del catéter. Las marcas graduadas en el catéter ayudarán a garantizar que se inserte una longitud adecuada del catéter.Se coloca un clamp vascular en el catéter entre la ligadura proximal y el sitio de inserción para prevenir la fuga de sangre. Luego, se asegura la ligadura proximal alrededor del vaso y el catéter. Ahora se puede retirar el clamp vascular.Se coloca una segunda ligadura alrededor de la porción proximal. Los extremos libres de la ligadura distal se aseguran alrededor del catéter. Durante todo este proceso, un asistente aspira y perfunde continuamente el catéter para garantizar su permeabilidad y para verificar que las ligaduras no estén demasiado apretadas alrededor del catéter.Es importante minimizar el volumen de suero salino inyectado para evitar la sobrecarga de líquidos en el feto. Ahora se puede realizar un análisis de gasometría sanguínea fetal para evaluar el estado de salud del feto. Se puede colocar un catéter venoso utilizando exactamente la misma técnica.La vena cefálica puede localizarse en la parte proximal de la incisión. La vena se estabiliza utilizando dos ligaduras alrededor de la vena. La ligadura proximal no se anuda hasta que el catéter se inserta en la vena.Nuevamente, utilizando nuestras tijeras, se hace un pequeño orificio en el vaso. Se inserta el catéter y se asegura tanto proximal como distalmente al punto de inserción. La ubicación exacta de la colocación de estos catéteres vasculares dependerá de las necesidades del modelo de investigación y de los órganos diana que se estén estudiando.Tanto el catéter venoso como el arterial salen del mismo sitio de incisión. La incisión cutánea se cierra entonces mediante un patrón de sutura continua simple en una sola capa. Los catéteres se fijan al antebrazo en varios puntos para permitir la flexión de la extremidad.En una posición normal, los catéteres se fijan al hombro y luego entre los omóplatos. Se coloca un segundo catéter arterial en el lado contralateral como respaldo, para poder obtener mediciones de la presión arterial y muestras sanguíneas arteriales durante el período posoperatorio. Se conectan cuatro cables electrocardiográficos utilizando una aguja de calibre 16, que se pasa subcutáneamente.Observe la sección desnuda del alambre, que finalmente se posiciona subcutáneamente, y el alambre se inserta a través del bisel de la aguja. La aguja se retira, dejando el alambre subcutáneamente. Se utilizan dos nudos cuadrados para asegurar el alambre.Después de esto, se aplica también pegamento de cianoacrilato a cada uno de los nudos. Se coloca un cable en cada articulación del hombro, el manubrio y el proceso xifoides. Se fija un catéter fenestrado al esternón para permitir la medición de la presión intrauterina y el muestreo repetido del líquido amniótico antes de devolver el feto al útero.30 microgramos de clenbuterol. Un agonista beta dos se administra lentamente por vía intravenosa para lograr relajación uterina. El clenbuterol también reduce la posible molestia abdominal debida a la manipulación del útero.Las cuatro patas se posicionan cuidadosamente nuevamente dentro del útero o los catéteres vasculares y el cable de ECG se pasan hacia la cara dorsal del cuello, donde se suturan a la piel durante toda la cirugía. Es importante bañar al feto con solución salina tibia para prevenir el secado de los tejidos expuestos y mantener al feto caliente. El guante quirúrgico se retira en el último momento y la cabeza se vuelve a colocar dentro del útero.El cierre del útero comienza ahora. En primer lugar, se retiran las pinzas de Babcock de la incisión uterina. Se utiliza un patrón de sutura continua simple para cerrar las membranas fetales con un material de sutura sintético multifilamento absorbible del tamaño cuatro-0.Cada uno de los catéteres y el cable de ECG se incorporan por separado en el cierre. Esto permite un cierre más ajustado, evitando así cualquier fuga. Se realiza un cierre en doble capa del tejido sérico-muscular utilizando un patrón de sutura de Cushing con material de sutura sintético multifilamento absorbible de tamaño 0.Este patrón de sutura invertida ayuda así a minimizar la formación de adherencias y las fugas. Una vez más, los catéteres y el cable de ECG se incorporan por separado al cierre. Una vez cerrado el útero, se infunde suero salino en el útero a través del catéter amniótico para reemplazar el líquido amniótico perdido.Durante la cirugía. El cierre uterino se cubre luego con el epiplón mayor. Se utiliza un material de sutura de polidioxanona para cerrar el corte lineal del codo.Se utiliza un patrón continuo sencillo. Es importante asegurarse de que la vaina rectal abdominal se incorpore en cada pasada de la aguja, como se observa. Aquí, el cirujano ha decidido cerrar el defecto lineal en dos etapas.Un patrón continuo sencillo también se utiliza para cerrar los tejidos subcutáneos. En esta etapa, el cirujano asistente colocará una sutura en bolsa de aro alrededor de los catéteres vasculares y del cable de ECG mientras salen por el flanco izquierdo. Se utilizan grapas quirúrgicas para el cierre de la piel, lo que acelerará el tiempo de cierre.Las heridas quirúrgicas se limpian y se coloca un vendaje no oclusivo sobre los sitios. Se coloca una venda de red tipo stock sobre el torso del U. Dentro de la primera hora tras la cirugía, el U está de pie, caminando y comenzando a comer nuevamente de manera tranquila y con actitud inquisitiva. Se administra terapia con buprenorfina y analgésicos durante este periodo y a lo largo del periodo quirúrgico.Los parámetros fisiológicos maternos se registraron utilizando un monitor fisiológico multiparamétrico. El ECG materno y la presión de la vía aérea se sincronizaron con los datos fisiológicos fetales mediante un cable personalizado que se conecta al monitor de diseño electrónico de Cambridge. A partir de estos datos se pueden derivar las variabilidades del ritmo cardíaco fetal y materno.Se muestra aquí un ejemplo de los datos fisiológicos registrados. Se obtuvieron muestras pareadas de gasometría arterial materna y fetal en momentos predeterminados durante los períodos quirúrgico y posoperatorio para garantizar su estado de salud. Los ajustes en la ventilación mecánica, la terapia de fluidos y la perfusión de dopamina se realizaron según estos resultados para asegurar una ventilación y perfusión adecuadas tanto de la madre como del feto, y se instituyó terapia de oxígeno nasal.Una vez que se extubó a la U, se continuó la terapia de fluidos. Si se detectaba alguna alteración ácido-base o electrolítica, nuestra hipótesis era que la causa de la acidosis metabólica leve transitoria observada en el feto se debía a la reducción de la perfusión uterina asociada con el uso de anestesia suave.Para obtener más información sobre los resultados, consulte el artículo escrito. En resumen, este modelo describe la implantación quirúrgica básica de dos catéteres arteriales, un catéter venoso, la colocación de cables de ECG y un catéter amniótico. Estos permitirán el monitoreo del electrocardiograma, el muestreo de la presión arterial, la obtención de muestras de sangre arterial y venosa, y el seguimiento de la presión hidrostática intrauterina.Deseamos reconocer a las siguientes personas por su valiosa asistencia con este intensivo proyecto de investigación. También agradecemos a los Institutos Canadienses de Investigación en Salud. Lafon realiza investigaciones en Quebec sobre Santi y la Fundación de Investigación Perinatal Twell por su apoyo financiero a este proyecto.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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