Name: Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Aprende a aislar anticuerpos contra variantes de TDP-43 en ELA mediante biopanning con microscopía de fuerza atómica. Este método utiliza panning negativo exhaustivo para detectar proteínas específicas de la enfermedad en muestras biológicas complejas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada por una subvención del NIH: R21AG042066. Nos gustaría dar las gracias a Philip Schulz por sus contribuciones en la creación de los videos de captura de pantalla.

1. Los fagos Producción <ol><li> Realizar todos los procesos de producción de fagos y biopanning en un gabinete de bioseguridad. Producir fagos partículas de las diferentes bibliotecas (Tomlinson I y J bibliotecas y Hojas de biblioteca 21) para el proceso de biopanning utilizando las instrucciones del fabricante (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf). NOTA: Nosotros usamos varias bibliotecas en nuestro proceso de exploración para aumentar la diversidad de los anticuerpos disponibles. </li><li> Brevemente, las bacterias de cultivo de las existencias de las tres bibliotecas en 200 ml de 2xYT que contiene 1% de glucosa y 100 g / ml de ampicilina en un agitador a 37 ° C hasta que OD 600 es 0,4. </li><li> Añadir 8 x 10 11 de fago auxiliar KM13 a 200 ml de las bibliotecas Tomlinson I y J y 8 x 10 11 de fago auxiliar VCSM13 a 200 ml de la biblioteca Sheets. Incubar las muestras de la biblioteca con el fago auxiliar durante 30 min a 37 ° C sin agitación. </li><li> Centrifugar lacultivos a 3.000 xg durante 10 min y resuspender el sedimento celular en 200 ml de 2xYT con 0,1% de glucosa, 100 g / ml de ampicilina y 50 g / ml de kanamicina. </li><li> Incubar las culturas O / N a 30 ° C con agitación y luego girar durante 30 minutos a 3300 xg al día siguiente. </li><li> Añadir 50 ml de polietilenglicol (PEG) 8000 en NaCl 2,5 M a los 200 ml de sobrenadante de cada una de las bibliotecas e incubar en hielo durante 1 hr. Después de precipitación con PEG, girar las soluciones de nuevo durante 30 min a 3300 x g. </li><li> Añadir 1-2 ml de tampón fosfato salino (PBS) al sedimento celular (dependiendo del tamaño de la pastilla) y la transferencia a tubos de microcentrífuga. </li><li> Incubar las partículas de fago en hielo durante 1 hora a 37 ° C con mezcla ocasional antes de centrifugar durante 10 min a 11.600 x g. Recoger el sobrenadante y se almacena a -80 ° C. </li><li> Antes de congelar, transferir un pequeño volumen de las partículas de fago a partir de las tres bibliotecas a otro tubo de microcentrífuga, y titule cada bibliotecaindividualmente utilizando células TG1 para determinar la concentración. A continuación se muestra una descripción del proceso de título para una biblioteca. <ol><li> Se cultivan las células TG1 a OD 600 de 0,4. Añadir 990 l de PBS a 6 tubos de microcentrífuga. </li><li> Para el primer tubo de añadir 10 l de las partículas de fago. Después de mezclar, eliminar 10 l de tubo uno y añadir al tubo 2. Repita este paso para los 4 tubos restantes. </li><li> Añadir 200 l de células TG1 con 6 tubos y añadir 10 l de cada uno de los seis diluciones de fago a estos tubos. Permita que las partículas de fago para infectar durante 30 minutos sin agitación a 37 ° C. </li><li> Plate 100 l de las células á Luria-Bertani placas de agar con 100 g / ml de ampicilina (LBA). Incubar O / N a 37 ° C y luego determinar la pfu / ml utilizando el número de colonias visibles. </li></ol></li></ol> 2. Negativo Proceso biopanning NOTA: Evite demasiados congelación y descongelación de los fagos en todo el proceso biopanning. Identificacióneally, lo mejor es llevar a cabo ya que muchos de los pasos de panorama negativos como sea posible en un día. Después de la finalización de las rondas de cribado negativo o positivo contra cada objetivo es importante para salvar algunos de los fagos en caso de contaminación en cualquier paso. <ol><li> 12 rondas de cribado negativo contra la albúmina de suero bovino (BSA) <ol><li> Añadir 4 ml de 1 mg ml solución / BSA en PBS a 12 inmunotubos e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Combine 1 x 10 12 partículas de fago de cada una de las tres bibliotecas (dejar de lado una pequeña cantidad de esta mezcla de fagos para la futura verificación del proceso de encuadramiento negativo). </li><li> Descartar la solución de BSA desde el primer tubo y se lava el tubo de 2-3 veces con PBS para eliminar cualquier BSA no unido. </li><li> Añadir las bibliotecas de fagos combinados a este primer tubo, incubar durante 30 min a RT en el rotador y recoger los fagos no unidos. </li><li> Repita el paso 2.1.3 con la segunda inmunotubo y añadir los fagos recogidos desde el paso 2.1.4 a esta immunotube. Repita el paso 2.1.4. </li><li> Repita los pasos 2.1.3-2.1.4 con los 10 tubos restantes de la solución de BSA y el fago no unido recogido después de cada incubación. </li><li> Para verificar la eliminación de todas las carpetas de BSA fagos utilizar AFM. Añadir 10 l de fago de la etapa 2.1.2 y 10 l de fago restante después de la etapa 2.1.7 separado a 10 g / ml de BSA unidas a mica escindido. Una versión breve del proceso de AFM se describe en la sección 8. </li><li> Es importante guardar una pequeña cantidad de fagos después de terminar las numerosas rondas de cribado negativo contra cada objetivo para verificar el éxito del proceso de la panorámica. </li></ol></li><li> 10 rondas de cribado negativo contra diversas formas de alfa-sinucleína NOTA: En este proyecto, queremos eliminar los fagos que podrían unirse otras formas agregadas de proteínas como la alfa-sinucleína (monómero, dímero, trímero, etc.) y lo vamos a eliminar alguno de estos fagos (el objetivo es eliminar el mayor muchos fagos de reacción cruzada como sea posible). Permita purificada alfa-sinucleína a agregarse durante al menos 7 días, así que ambas formas monómeros y oligómeros están presentes para paneo negativo. <ol><li> Preparar 4 inmunotubos con 500 g / ml de agregados de alfa-sinucleína en PBS y 4 inmunotubos con 100 mg / ml de agregados de alfa-sinucleína e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Descartar la solución de uno de los tubos con 500 g / ml de agregado alfa-sinucleína, lavar con PBS y añadir la biblioteca de fagos recogidos después de las 12 rondas de paneo negativo con BSA. </li><li> Incubar el tubo durante 30 min a RT en el rotador y recoger los fagos no unidos. </li><li> Repetir los pasos 2.2.3 y 2.2.4 para los tubos restantes con 500 g / ml de agregado alfa-sinucleína y después los tubos con 100 g / ml de agregado alfa-sinucleína utilizando el fago no unido recogido cada vez después de la etapa 2.2.4. </li><li> Repita el paso 2.1.8 usando el fago después de la primera de paneo negativa en contra de 500 g / ml de alfa agregadasinucleína y el fago después de la octava ronda de selección negativa en contra de 100 g / ml de alfa-sinucleína. </li><li> Para eliminar todas las carpetas negativos contra la alfa-sinucleína preparar dos inmunotubos extra con 500 g / ml de agregados de alfa-sinucleína y repita los pasos 2.2.2-2.2.4. </li></ol></li><li> 10 rondas de cribado negativo contra Saludable Human Brain Tissue Homogenado <ol><li> Añadir tampón 1x STEN (50 mM Tris (pH 7,6), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 0,2% NP-40, 0,2% de BSA, 20 mM PMSF y cóctel inhibidor de proteasa) para el tejido cerebral humano 28. Homogeneizar a 24.000 rpm durante 1 min, las muestras de centrifugación a 3000 rpm y se recoge el sobrenadante. </li><li> Prepare 2 inmunotubos con 2 ml de 50 mg / ml de tejido cerebral humano en PBS y 8 inmunotubos con 10 mg / ml de tejido cerebral humano e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Repita los pasos 2.2.3-2.2.5 primero con los tubos que contienen 50 mg / ml de tejido cerebral humano y luego con aquellos que contienen 10 mg / ml de b humanatejido lluvia usando el fago no unido recogido después el panorama negativo contra la alfa-sinucleína. </li><li> Repita el paso 2.1.8 usando el fago después de la primera de paneo negativa en contra de 50 g / ml de tejido cerebral humano y el fago después de la décima ronda de selección negativa en contra de tejido cerebral humano. </li></ol></li><li> 8 rondas de cribado negativo contra Saludable Immunoprecipitated TDP-43 <ol><li> Immunoprecipitate saludable proteína TDP-43 desde sano tejido cerebral humano utilizando el protocolo descrito en la sección 9. Debido a la menor cantidad de proteína inmunoprecipitada, llevar a cabo estas rondas de cribado negativo utilizando mica. </li><li> Cleave ocho superficies de mica. </li><li> Para la primera mica añadir ~ 100 l de 5 mg / ml de la proteína inmunoprecipitada y se incuba durante 5-10 min a TA. </li><li> Lavar la mica 5 veces con 0,1% PBS con Tween 20 (PBST). </li><li> Añadir ~ 100 l de fago después el panorama negativo contra el tejido sano del cerebro y se incuba durante 5-10 min aRT. </li><li> A medio camino de la incubación del paso 2.4.5, realizar la etapa 2.4.3 usando el segundo mica. </li><li> Recoger el fago del paso 2.4.5 y lavar la mica 5 veces con 0,1% PBST. </li><li> Lave mica desde el paso 2.4.6 y añadir el fago de 2.4.7. </li><li> Repita los pasos 2.4.4 al 2.4.9 hasta que el fago se desplaza negativamente contra los ocho mica con la proteína inmunoprecipitada. Repita el paso 2.1.7 usando el fago después de una y ocho ronda de cribado negativo. </li></ol></li><li> 2 rondas de cribado negativa contra FTD Immunoprecipitated TDP-43 <ol><li> Immunoprecipitate proteína TDP-43 de los cerebros de las personas con FTD. </li><li> Cleave 2 superficies de mica. </li><li> Añadir 50 l de 10 g / ml de FTD TDP-43 a uno mica. Incubar durante 5 min a TA. </li><li> Lave la mica 5 veces con 0,1% PBST. </li><li> Añadir 50 l de fago recogido después de paneo negativa en contra de TDP-43 saludable. Incubar durante 5 min. </li><li> Recoge los fagos no unidos. </li><li> Repeats pasos 2.5.3 a 2.5.6 con el segundo mica y el fago no unido recogida en 2.5.6. </li></ol></li></ol> 3. Desplazamiento Positivo contra Immunoprecipitated TDP-43 de las personas con ELA <ol><li> Immunoprecipitate proteína TDP-43 de los cerebros de las personas con ELA. Cleave 3 superficies de mica. Añadir 50 l de 10 g / ml de ALS TDP-43 a uno mica. Incubar durante 5 min a TA. Lave la mica 5 veces con 0,1% PBST. </li><li> Añadir 50 l de fago recogido después de paneo negativa en contra de TDP-43 saludable a la mica. Incubar durante 5 min. </li><li> Recoge los fagos no unidos. También recoge los fagos unidos usando tres métodos de elución. Es importante mantener todos los fagos recogidos en estos pasos paneo independientes. <ol><li> En primer lugar, añadir 50 l de tripsina (1 mg / ml en PBS) a cada mica e incubar durante no más de 10 min. Recoger la solución y guardar. A continuación, añadir 50 l de trietilamina 100 mM (TEA) a cada mica e incubar durante no más de 10 min. Collect la solución, añadir un volumen igual de tampón 1 M Tris-HCl pH 7,4 y guardar. </li><li> En tercer lugar, añadir 50 l de TG1 a una DO 600 de 0,4 directamente a la mica y se incuba durante 30 min a 37 ° C. También añadir los fagos recogidos de los dos métodos de elución en 3.3.1 a 100 l de TG1 en OD 600 de 0,4 y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C. </li></ol></li><li> Repita los pasos 3,1 con una segunda mica. </li><li> Tome el fago no unido recogido en el apartado 3.3.2. utilizando la primera mica con ELA TDP-43 y agregarlo a la segunda mica con ELA TDP-43. Incubar durante 5 min. </li><li> Repite todos los pasos de 3,3 segundos para estos conjuntos de mica. </li><li> Combinar las células TG1 infectadas con los fagos eluidos con tripsina de las dos ALS TDP-43 y la placa de mica en placas de LBA. Repetir el mismo proceso para el té y TG1 eluyó fagos de los dos ALS TDP-43 mica para un total de tres placas. NOTA: Debido a la participación de la TDP-43, tanto en la ELA y FTD, algunos de los clones aislados en eldos rondas de cribado positivo contra la ELA TDP-43 pueden ser específicas para este objetivo, pero algunos también pueden unirse FTD. Para aislar mejor ALS clones específicos, tomar el fago no unido recogido después de 2 rondas de cribado negativo contra FTD TDP-43 (ya que estas dos rondas de cribado negativo deberían haber eliminado cualquier objetivo que es reactivo a FTD TDP-43) y el uso de estos fagos en una ronda más de panning positiva contra la ALS TDP-43 antígeno sobre mica (ALS preparar el TDP-43 mica como se describe anteriormente en 3.3 y 3.4). </li><li> Repite todos los pasos de 3,3 con esta tercera mica ALS y la placa de las células TG1 infectadas en tres placas LBA O / N a 37 ° C. Al día siguiente, contar el número de colonias en las placas de 6 LBA con el potencial clones ALS. Debe haber un menor número de colonias en las tres placas LBA con los posibles clones ALS después de la tercera ronda de cribado positivo en comparación con las tres placas LBA después de las dos rondas de cribado positivo. </li></ol> 4. El cultivo y el fago Productoion de potenciales clones positivos contra la ELA específico TDP-43 <ol><li> Crecer cada colonia a partir de los 6 placas en placas de 96 pocillos que contienen 100 l de 2xYT con 1% de glucosa y 100 g / ml de ampicilina en un agitador a 37 ° CO / N. </li><li> La siguiente transferencia día 10 l de los pocillos que contienen los clones de las 3 placas de LBA después de la tercera ronda de selección positiva con la proteína ALS TDP-43 a tubos de microcentrífuga que contienen 1 ml de 2xYT con 1% de glucosa y 100 g / ml de ampicilina . </li><li> Añadir glicerol a todas las culturas en las placas de 96 pocillos a una concentración final de 15% y congelar las placas a -80 ° C. Permita que las culturas 1 ml crezcan durante 2-3 horas con agitación a 37 ° C. </li><li> Añadir 10 9 de fago auxiliar KM13 y permitir que el fago auxiliar para infectar durante 1 hora a 37 ° C con agitación. Centrifugar las células durante 10 minutos a 3000 xg, descartar el sobrenadante y añadir 1 ml de 2xYT con 0,1% de glucosa, 100 g / ml de ampicilina y 50 mg / ml de Kanamycin. </li><li> Cultura de las células O / N a 30 ° C con agitación. Centrifugar los tubos a 3.300 xg durante 30 min, Transferir el sobrenadante a nuevos tubos de microcentrífuga y se añaden 250 l de PEG / NaCl a cada tubo. </li><li> Incubar los tubos en hielo durante 1 hr. Centrifugar los tubos de nuevo en 3300 xg durante 30 min, descartar el sobrenadante y añadir 100 l de PBS a cada tubo. </li><li> Incubar los tubos en hielo durante 1 hr. Girar los tubos durante 10 min a 11.600 xg y transferir el sobrenadante a nuevos tubos. Guarde los fagos a -80 ° C. </li></ol> 5. La secuenciación de potenciales Clones ALS <ol><li> Repita el paso 4.2 y permite a las culturas creciendo O / N a 37 ° C con agitación. El día siguiente realizar preparaciones de plásmidos de ADN de los clones de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Secuenciar los clones usando la apropiada adelante y atrás primers. </li></ol> 6. Detección potenciales clones positivos contra la ELA específico TDP-43 Uso de ELISA indirecto <ol><li> Añadir 100 l de 2,5 mg / ml de ALS, FTD y el tejido cerebral humano sano a los pocillos de una placa de ELISA de alta unión para cada clon potencial ALS. Incubar las placas a 37 ° C durante 1 hora con agitación lenta. </li><li> Lavar las placas 3 veces con PBST 0,1%. Añadir 200 l de 2% de leche en polvo en PBS al pocillo e incubar las placas a 37 ° C durante 1 hora con agitación lenta. </li><li> Repetir la etapa de lavado y luego añadir 100 l de cada fago diluida al menos 1/100 en PBS a los pocillos. Después de la incubación y etapas de lavado, añadir 100 l de 1 / 1.000 anti-M13 HRP a cada pocillo. Lavar las placas y visualizar utilizando el kit de sustrato de quimioluminiscencia femto ELISA. </li></ol> 7. Producción scFv y de detección sistemática mediante ELISA indirecto <ol><li> Crecer HB 2151 células a OD 600 de 0,4. Añadir 5 l de las diferentes fagos para 20 l de las células HB 2151. Permita que los fagos 30 min para infectar a 37 ° C sin agitación. Divida placas LBA en las redes de maneraque aproximadamente 20 clones se pueden sembrar en cada uno. </li><li> Añadir 5-10 l de cada uno de fagos infectados bacterias en la placa e incubar O / N a 37 ° C. Al día siguiente añadir colonias individuales a 1 ml de 2xYT con 0,1% de glucosa y 100 g / ml de ampicilina y agitar a 37 ° C durante 3-4 horas hasta que OD 600 es de 0,6. </li><li> Añadir 1 l de 1 M isopropiltiogalactósido (IPTG) a cada tubo y se incuba O / N a 30 ° C con agitación. Girar los tubos a 11.600 xg durante 10 min y cosechar el sobrenadante para la prueba de ELISA. </li><li> Para la prueba ELISA seguir los mismos procedimientos en la sección 6, excepto que en lugar de fagos en 6,5 añadir el scFv sin diluir y el 6,6 añadir 100 l de 1/1000 9E10 HRP. </li></ol> 8. Proceso AFM <ol><li> Añadir 10-20 l de antígeno diana a mica escindido y se incuba durante 5-10 min. Lavar la mica 5 veces con agua. Añadir 10 a 20 l de los fagos a la mica e incubar durante 5 a 10 min. </li><li> Lave la mica 5 veces wi nuevoª agua y deje que la mica se seque al aire. Visualizar fago de unión utilizando AFM 1. Ejecutar el proceso de formación de imágenes AFM utilizando el modo tapping AFM con un controlador Nanoscope IIIa en el aire a temperatura ambiente 29. Las sondas de AFM de silicio tienen una frecuencia de resonancia de 300 kHz y una constante de resorte de 40 N / m. Utilice una velocidad de barrido de 3,05 Hz y una resolución de escaneo de 512 muestras / línea. </li><li> Procesar las imágenes por aplanamiento básica del fondo para asegurar que todos los tamaños de partícula son comparables dentro de cada imagen. Ancho de Fago (no la longitud) puede variar de una imagen a otra debido a otros tamaños de partículas y el área de exploración, pero nunca va a comprometer la precisión de si o no fago se une al antígeno. </li><li> Si durante la verificación de AFM para cada conjunto de fagos de panning negativos son visibles en la mica, realizar rondas de adición hasta que no se detectan los fagos antes de proceder a la siguiente serie de panning negativo. </li></ol> 9. La inmunoprecipitación de Target Antígeno <ol><li> Para Isolate el antígeno diana (TDP-43), añadir 250 g de tejido homogeneizar cerebro (de corteza motora), 100 l de dilución 1/100 de la anti-TDP 43 anticuerpo policlonal y 1x STEN búfer a 700 l volumen total a un Eppendorf tubo 28. </li><li> Incubar O / N a 4 ° C en un rotador. Lavar A / G cuentas de agarosa con el 1x STEN amortiguan 2-3 veces y añadir 25 ml de la mezcla de tejidos. Se incuba a 4 ° C durante 1,5 horas en un rotor y centrifugar a 2.000-4.000 rpm durante 1 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento una vez con tampón 1x STEN y 5 veces con PBS. Añadir 40-60 l de tampón 1x STEN al sedimento y hervir durante 5 min. Después de que las muestras son frescas, centrifuga y se recoge el sobrenadante. Utilice SDS-PAGE y transferencia Western para verificar el éxito del proceso de inmunoprecipitación 30. </li></ol> 10. Dot Blot Analysis <ol><li> Cortar papel de nitrocelulosa en pequeños rectángulos para cada clon que se pondrá a prueba. Dot 2 l de ALS, FTD y muestras de tejido cerebral humanos sanos hasta el papel de nitrocelulosa y deje que se seque por completo. </li><li> Añadir 1-2 ml de 5% de leche en polvo en PBS y se deja agitar durante 1 hora a RT. Añadir 1 ml de dilución 1/100 de cada fago y se deja agitar O / N a 4 ° C. Lavar la membrana 3 veces durante 10 min cada uno con 0,5% PBST. </li><li> Añadir 1 ml de 1 / 1.000 dilución de anti-M13 HRP y se deja agitar durante 1 hora a RT. Repita el procedimiento de lavado y se visualizaron utilizando la solución de quimioluminiscencia occidental. </li></ol>

<ol><li>Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+recombinant+antibodies+against+specific+protein+morphologies+using+atomic+force+microscopy+and+phage+display+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies.</a> Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).</li>
<li>Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+Human+Single+Chain+Antibody+Fragment+Against+Oligomeric+%CE%B1-Synuclein+that+Inhibits+Aggregation+and+Prevents+%CE%B1-Synuclein-induced+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity.</a> Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).</li>
<li>Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Morphologically+Distinct+Oligomeric+Forms+of+%CE%B1-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).</li>
<li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+specific+for+oligomeric+beta-amyloid+stabilizes+nontoxic+form%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form.</a> Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).</li>
<li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+antibody+fragments+selective+for+specific+protein+morphologies+from+nanogram+antigen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples.</a> Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).</li>
<li>Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-oligomeric+A%CE%B2+Single-chain+Variable+Domain+Antibody+Blocks+A%CE%B2-induced+Toxicity+Against+Human+Neuroblastoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells.</a> Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).</li>
<li>Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+%CE%B2-Secretase+Activity+in+Alzheimer%27s+Disease+Cell+Models+with+Single-Chain+Antibodies+Specifically+Targeting+APP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP.</a> Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).</li>
<li>Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+Tandem+Single+Chain+Antibody+Simultaneously+Inhibits+%CE%B2-Secretase+and+Promotes+%CE%B1-Secretase+Processing+of+A%CE%B2PP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).</li>
<li>Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Single-Chain+Fv+Intrabody+Blocks+Aberrant+Cellular+Effects+of+Overexpressed+%5Balpha%5D-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein.</a> Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43-mediated+neurodegeneration%3A+towards+a+loss-of-function+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).</li>
<li>Akamatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+mouse+model+for+investigating+the+properties+of+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+protein+TDP-43%2C+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation.</a> Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).</li>
<li>Keage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+in+the+Population%3A+Prevalence+and+Associations+with+Dementia+and+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).</li>
<li>Honda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ALS%2FFTLD-related+RNA-binding+proteins+TDP-43+and+FUS+have+common+downstream+RNA+targets+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons.</a> FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).</li>
<li>Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43%3A+the+relationship+between+protein+aggregation+and+neurodegeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration.</a> FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).</li>
<li>Ling, S. -C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).</li>
<li>Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+subcellular+localization+of+TDP-43+immunoreactivity+in+the+anterior+horns+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).</li>
<li>Robertson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+TDP-43+abnormalities+in+mutant+SOD1+transgenic+mice+shows+disparity+with+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS.</a> Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).</li>
<li>Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mislocalization+of+TDP-43+in+the+G93A+mutant+SOD1+transgenic+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS.</a> Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).</li>
<li>Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+abnormal+processing+of+TDP-43+is+not+an+upstream+event+of+reduced+ADAR2+activity+in+ALS+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons.</a> Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+abolishes+mutant+TDP-43+induced+excitability+in+a+motoneuron-like+cellular+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS.</a> Neuroscience. 272, 141-153 (2014).</li>
<li>Sheets, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+a+large+nonimmune+phage+antibody+library%3A+The+production+of+high-affinity+human+single-chain+antibodies+to+protein+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).</li>
<li>Hairul Bahara, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+antibodies+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Phage display antibodies for diagnostic applications.</a> Biologicals. 41, 209-216 (2013).</li>
<li>Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+technology%3A+clinical+applications+and+recent+innovations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+single-chain+antibodies+from+a+human+synthetic+phage+display+library+for+detection+of+Bacillus+thuringiensis+%28Bt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cry1B+toxin.+Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt).</a> Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+characterization+of+single-chain+recombinant+antibodies+against+spring+viraemia+of+carp+virus+from+mouse+phage+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library.</a> Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).</li>
<li>Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+salivary-pellicle-binding+peptide+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display.</a> Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).</li>
<li>Adamson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single+chain+antibodies+to+the+prion+protein+identified+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display.</a> Virology. 358, 166-177 (2007).</li>
<li>Hebron, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+Ubiquitinates+Tar-DNA+Binding+Protein-43+%28TDP-43%29+and+Promotes+Its+Cytosolic+Accumulation+via+Interaction+with+Histone+Deacetylase+6+%28HDAC6%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6).</a> Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).</li>
<li>Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Antibody+Specificity+to+Different+Protein+Morphologies+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM.</a> Langmuir. 25, 912-918 (2008).</li>
<li>Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+brain-reactive+autoantibodies+and+behavioral+deficits+in+the+MRL+model+of+CNS+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus.</a> Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).</li>
<li>Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+external+factors+on+bacteriophages%E2%80%94review%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The influence of external factors on bacteriophages—review.</a> Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).</li>
<li>Hammers, C. M., Stanley, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Phage+Display%3A+Technique+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Antibody Phage Display: Technique and Applications.</a> J Invest Dermatol. 134, e17(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se ha demostrado que las variantes de proteínas están involucradas en la progresión de muchas enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, el Parkinson, la ELA y la FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. El aislamiento de anticuerpos que pueden reconocer selectivamente estos diferentes objetivos de variantes de proteínas puede ser reactivos efectivos para estudiar, diagnosticar y potencialmente tratar tales dolencias. Para generar estos anticuerpos específicos de variantes, hemos desarrollado un novedoso proceso ...

La presencia de variantes de la proteína ha sido implicado como un factor en la progresión de muchas enfermedades, incluyendo enfermedades neurodegenerativas tales como Alzheimer, Parkinson, ALS y la demencia frontotemporal (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Formas oligoméricas de las proteínas beta-amiloide y la alfa-sinucleína se cree que son las especies tóxicas responsables de la enfermedad de Alzheimer y el Parkinson, respectivamente 2,3,4,5. Agregados de la TAR DNA-proteína de unión 43 (TDP-43) se han relacionado con ALS y FTD 12,13,14. Por lo tanto los reactivos como los anticuerpos que se dirigen selectivamente las diferentes variantes de la proteína pueden ser herramientas poderosas para servir como marcadores de diagnóstico y terapéuticos potenciales. En este estudio, se centró en el desarrollo de reactivos que se unen selectivamente variantes de la proteína TDP-43 implicados en la ELA, sin embargo, la técnica descrita en este documento debe ser aplicable al aislamiento de los reactivos frente a una amplia gama de protein variantes. La agregación citoplásmica de TDP-43 ha sido identificada como una característica patológica en la ELA 15,16,17,18,19. Típicamente TDP-43 se encuentra en el núcleo de todas las células de un individuo normal, aunque tiende a desplazarse entre el citosol y el núcleo 15,17. Formas Sin embargo, en ALS agregados de TDP-43 se detectan en el citoplasma de neuronas y glia seleccione con concentraciones más bajas se encuentran en el núcleo lo que sugiere el movimiento de TDP-43 desde el núcleo hasta el citoplasma durante la progresión de la enfermedad 16,20. Mientras la agregación de TDP-43 se encuentra en la mayoría de los casos de ELA, que no tiene en cuenta todos los casos desde el 1% -2% de los casos de ELA total (o 15% -20% de los casos de ELA familiar) están vinculados a mutaciones en el superóxido dismutasa 1 (SOD1) 15,17 gen. Debido a la importancia del papel de TDP-43 en la gran mayoría de los casos de ELA, aquí nos centramos en el desarrollo de reactivos de anticuerpos basados ​​que pueden unirse selectivamente a TDP-43 variantes que sonpresente en el tejido cerebral ALS humana utilizando nuestras técnicas biopanning basado novela AFM. Inicialmente tenemos un repertorio diverso de los dominios de unión a anticuerpos. Se combinaron los tres (scFv) bibliotecas de fragmentos diferentes de presentación de fagos de cadena único dominio variable de anticuerpo, (Tomlinson I y J y Hojas de bibliotecas 21). El proceso de toma panorámica se divide en fases de panorama negativo y positivo. Los fagos de las bibliotecas son primero sometidos al proceso de panning negativo durante el cual los fagos reactivo a múltiples antígenos están excluidos desviado. Después de la finalización de cada ronda de selección negativa contra cada antígeno fuera del objetivo, el proceso se controla por imágenes de AFM para asegurar que toda fago de unión a los antígenos fuera de objetivo se han eliminado. Sólo después de verificar por AFM de imágenes que se eliminan todos los fagos reactivos Qué podemos hacer para el próximo objetivo. Para aislar reactivos contra TDP-43 variantes implicadas en la ELA hemos utilizado los siguientes antígenos paneo negativos:<html> 1) BSA para eliminar los fagos que se unen débilmente o no específicamente a las proteínas; 2) agregada alfa-sinucleína para eliminar los fagos que se unen a elementos estructurales genéricas de agregados de proteínas; 3) homogeneizados de tejido cerebral humano para eliminar los fagos que se unen a cualquiera de las proteínas u otros componentes presentes en las muestras post-mortem del tejido cerebral humano sano; 4) inmunoprecipitada TDP-43 a partir de cerebro humano sano para eliminar los fagos que se unen a todos TDP-43 formularios relacionados con el cerebro humano sano; y 5) inmunoprecipita TDP-43 aislada de homogeneizados de cerebro FTD para eliminar los fagos que se unen TDP-43 variantes asociadas con la no-ELA patología. Después de la eliminación de todos fago reactivo a todos los antígenos fuera de objetivo, se procedió entonces a la fase de panning positivo durante el cual se aíslan fragmentos de anticuerpos que se unen al antígeno de interés, en este caso TDP-43 inmunoprecipitada a partir de tejido cerebral ALS humana. Estos anticuerpos aislados pueden ser reactivos a las formas de TDP-43 agregados o modificados. &quot;&gt; Biopanning fago convencional se centra principalmente en la fase de panning positivo 22,23. Por lo general, la diana de interés se inmoviliza, la biblioteca de fagos añadió y los fagos unidos se eluyó. Los fagos se amplifican y se añade a la meta de nuevo. Este proceso de amplificación y la incubación por lo general se repite varias veces para aumentar el porcentaje de fagos de unión positiva. Si bien las variaciones de este proceso se han utilizado ampliamente para aislar reactivos de anticuerpos contra una amplia gama de antígenos diana, por lo general requiere grandes cantidades de antígeno diana purificada 24,25,26, 27, mientras que nuestro proceso sólo requiere pequeñas cantidades de antígeno diana. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para aislar reactivos que se unen selectivamente a antígenos diana que están presentes en concentraciones muy bajas, sin la necesidad de purificación y la panoramización se pueden realizar directamente contra antígeno presente en muestras de tejidos complejos. El uso de protocolos de panning negativos exhaustivos que se han verificadopor AFM asegura que los clones aislados contra el antígeno positivo deben unirse selectivamente el objetivo incluso cuando no purificada o enriquecida. Kasturirangan y colaboradores (2003) han llevado a cabo un proceso biopanning negativa y positiva similar para aislar anticuerpos reactivos a oligomérica beta-amiloide mediante la concentración de nanogramos del objetivo 5. Aquí ampliar este proceso para permitir la generación de reactivos que se unen selectivamente a la proteína específica de la enfermedad variantes directamente a partir de muestras de tejidos humanos. En estudios futuros se pretende investigar más a fondo no sólo el valor de diagnóstico de los reactivos aislados aquí, sino también evaluar su relevancia terapéutica para el tratamiento de ALS. En general, nuestra nueva tecnología basada biopanning AFM debe ser aplicable al aislamiento de cualquier variante de proteína específica de la enfermedad en cualquier material biológico sin la necesidad de purificación de proteínas o modificación, incluso cuando el antígeno diana concentrations son extremadamente bajos.

<table><tbody><tr><td>Tomlinson I y J Libraries</td><td>MRC (Cambridge, Inglaterra)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sheets Library</td><td>MRC (Cambridge, Inglaterra)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>BD Sciences</td><td>244020</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Amresco</td><td>0188-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>KM13 Fago Auxiliar</td><td>MRC (Cambridge, Inglaterra)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>OmniPur</td><td>5880</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol irritante 8000</td><td>OmniPur</td><td>6510</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td> irritante <td>Macron</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio Dibásico</td><td>Amresco</td><td>0404-1KG</td><td>Cloruro de potasio irritante</td></tr><tr><td></td><td>EMD</td><td>PX1405-1</td><td>Potasio</td></tr><tr><td>irritante Fosfato Monobásico</td><td>Amresco</td><td>0781-500G</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>Células TG1 MRC</td><td>(Cambridge, Inglaterra)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani Agar</td><td>EMD</td><td>1.10283.0500</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Suero Bovino</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tampón STEN</td><td>Crystalgen Inc.</td><td></td><td></td>33429775</tr><tr><td>Immunotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>470319</td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Abeto Pino Mica</td><td>24365</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>EMD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T-0303</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Sigma</td><td>T-0886</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol Inflamable</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>Kit de preparación de plásmidos de ADN</td><td>qiagen</td><td>27106</td> Leche en polvo <td>irritante</td></tr><tr><td>descremada</td><td>Clavel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 96 pocillos Placa ELISA de alta unión</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>Anti-M13 HRP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-9421-01</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Femto Kit de sustrato de quimioluminiscencia</td><td>Thermo Scientific</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti-TDP 43</td><td>ProteinTech</td><td>10782-2-AP</td><td></td></tr><tr><td>A/G Agarose Beads</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>HB 2151 Cells</td><td>MRC (Cambridge, Inglaterra)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropiltiogalactósido</td><td>Teknova</td><td>13325</td><td></td></tr><tr><td>9e10 HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td> inflamable <td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall RC 6+</td><td></td></tr><tr><td>Nanoscope IIIa Microscopio de fuerza atómica</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM</td><td>Sondas VistaProbes</td><td>T300R-10</td><td></td></tr></tbody></table>

novela microscopía de fuerza atómica based biopanning para el aislamiento de morfología reactivos específicos contra la tdp-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Debido variantes de proteínas juegan un papel crítico en muchas enfermedades incluyendo TDP-43 en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la alfa-sinucleína en la enfermedad y el beta-amiloide y tau en la enfermedad de Alzheimer, es de vital importancia para el desarrollo de reactivos específicos morfología que pueden dirigirse selectivamente Parkinson estas proteínas específica de la enfermedad variantes para estudiar el papel de estas variantes en la patología de la enfermedad y para posibles aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Hemos desarrollado nuevos microscopía de fuerza atómica (AFM) técnicas biopanning base que permiten el aislamiento de los reactivos que reconocen selectivamente variantes de proteínas específicas de la enfermedad. Hay dos fases clave implicados en el proceso, las fases de panning negativos y positivos. Durante la fase de panning negativo, los fagos que son reactivos a los antígenos fuera de objetivo se eliminan a través de múltiples rondas de cribado sustractiva utilizando una serie de antígenos cuidadosamente seleccionados fuera de objetivo. Una característica clave de la negativafase de la panorámica es la utilización de imágenes de AFM para vigilar el proceso y confirmar que se eliminan todas las partículas de fago no deseados. Para la fase de panning positivo, el antígeno diana de interés se fija sobre una superficie de mica y fagos unidos se eluyen y se tamiza para identificar los fagos que se unen selectivamente al antígeno diana. La variante de proteína diana no necesita ser purificado proporcionando los controles negativos apropiados de panning se han utilizado. Incluso objetivo variantes de proteínas que sólo están presentes en concentraciones muy bajas en el material biológico complejo se puede utilizar en la etapa de panning positivo. A través de la aplicación de esta tecnología, hemos adquirido anticuerpos contra proteínas variantes de TDP-43 que se encuentran de forma selectiva en el tejido cerebral ALS humana. Esperamos que este protocolo debe ser aplicable a la generación de reactivos que se unen selectivamente variantes de proteínas presentes en una amplia variedad de diferentes procesos biológicos y enfermedades.

En la Figura 1, el esquema muestra el proceso paneo negativo por el cual hemos eliminado fago de unión fuera de objetivo antígenos de nuestra biblioteca utilizando inmunotubos. Inicialmente Empezamos con BSA ya que este es un agente de bloqueo común y cualquier fagos que reaccionan de forma no específica con este objetivo sería problemático en inmunoensayos futuras. A continuación, hemos eliminado aglutinantes a agregados de alfa-sinucleína para eliminar los fagos que son reactivos con estructuras genér...

Utilizando microscopía de fuerza atómica en combinación con la tecnología de biopanning, creamos un sistema de biopanning negativo y positivo para adquirir anticuerpos contra variantes de proteínas específicas de enfermedades presentes en cualquier material biológico, incluso a bajas concentraciones. Tuvimos éxito en la obtención de anticuerpos contra las variantes de la proteína TDP-43 implicadas en la esclerosis lateral amiotrófica.

Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar reactivos específicos de la morfología frente a la proteína de unión al ADN de la alquitrán. 43 variantes presentes en un LS utilizando una tecnología de selección radiométrica basada en AFM en dos fases. Esto se logra primero sometiendo una biblioteca diversa de fagos a múltiples rondas de selección negativa frente a antígenos ajenos utilizando tubos inmunológicos.El tamizado negativo se realiza secuencialmente contra albúmina sérica bovina, alfa-sinucleína agregada y tejido cerebral humano sano. El segundo paso consiste en completar una verificación de FM después de cada serie de tamizado negativo para asegurar la eliminación exitosa de todos los fagos no deseados. En este ejemplo de tamizado negativo, utilizando alfa-sinucleína agregada, los fagos son visibles tras una ronda, pero están ausentes tras la décima ronda.A continuación, debido a la disponibilidad limitada de muestras, se realizan las rondas restantes de selección negativa sobre MICA. Los fagos que reaccionan con la TDP-43 inmunoprecipitada de tejido sano y de demencia frontotemporal o FTD se eliminan de forma secuencial. El paso final consiste en aislar los fagos que se unen a la inmunoprecipitación de a LS.Se eluyen los fagos unidos a mica que utilizan TDP-43 mediante tripsina, trietilamina y TG en células. Finalmente, se verifica la especificidad de estos posibles clones a LS mediante ELISA indirecta y blot de puntos, en los que se inmovilizan tejidos cerebrales humanos homogeneizados de A-L-S-F-T-D y de cerebros humanos sanos. Habitualmente se detecta una mayor reactividad frente al tejido de ALS en comparación con los otros grupos analizados.La principal ventaja de esta técnica frente al bioenriquecimiento convencional con fagos es el uso de protocolos de enriquecimiento negativo exhaustivos, verificados mediante un MF, para garantizar el aislamiento de reactivos que reconozcan selectivamente variantes proteicas específicas de la enfermedad directamente a partir de muestras biológicas complejas, incluso cuando están presentes en bajas concentraciones. Aunque un MF puede proporcionar información útil para investigar características biomoleculares e interacciones, también puede aplicarse a otros sistemas, como el seguimiento del progreso del bioenriquecimiento y la confirmación de la especificidad de CLO individuales. Inicie este procedimiento con la producción de fagos según se detalla en el protocolo escrito, realizando primero el enriquecimiento negativo frente a BSA, añadiendo cuatro mililitros de una concentración de un miligramo por mililitro.Solución de BSA en solución salina tamponada con fosfato o PBS en 12 tubos inmuno e incubar durante la noche a cuatro grados Celsius. A continuación, combinar las partículas de fago de cada una de las tres bibliotecas, reservando una pequeña cantidad de esta mezcla de fagos para la verificación futura del proceso de panning negativo. Luego desechar la solución de BSA del primer tubo y lavar el tubo de dos a tres veces con PBS para eliminar cualquier BSA no unida, agregar las bibliotecas de fagos combinadas a este primer tubo, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en el rotador antes de recolectar los fagos no unidos.Tenga en cuenta que es importante guardar una pequeña cantidad de fagos tras completar las numerosas rondas de panning negativo frente a cada blanco, para verificar el éxito del proceso de panning y, en caso de contaminación, repetir el proceso de panning negativo con los tubos restantes de solución de BSA cada vez. Utilice los fagos no ligados recolectados tras la incubación del tubo anterior. Luego, verifique la eliminación de todos los fagos que se unen a la BSA mediante el procedimiento de A FM detallado en la siguiente sección del video.Para visualizar la unión de fagos mediante microscopía de fuerza, agregue de 10 a 20 microlitros del antígeno diana a la mica dividida e incube durante cinco a 10 minutos. Lave la MICA cinco veces con agua, luego agregue de 10 a 20 microlitros de los fagos a la MICA e incube durante cinco a 10 minutos. Lave la mica otras cinco veces con agua y deje secar al aire.Realice un proceso de imagenología de FM utilizando un modo de tanteo de FM con un nanoscopio tres, un controlador en aire a temperatura ambiente. Las sondas de FM de silicio tienen una frecuencia de resonancia de 300 kilohercios y una constante elástica de 40 newtons por metro. Inserte la punta de FM en el cargador de puntas.Coloque el cargador de puntas en el microscopio de FM-A. Coloque la muestra bajo el microscopio de FM-A. Utilice los controles para alinear el láser sobre la punta de FM-A.Establezca la velocidad de barrido en 3,05 hercios y la resolución de barrido en 512 muestras por línea. Ajuste automático del equipo para optimizar la vibración de la sílice. Frecuencia de la punta, inicie el barrido de la muestra.La punta escaneará la superficie de la mica midiendo la altura del fago unido. Los fagos son las líneas blancas largas que siguen al proceso de adquisición de las imágenes mediante un aplanamiento básico del fondo para asegurar que todos los tamaños de partículas sean comparables dentro de cada imagen. El ancho del fago puede variar de una imagen a otra debido a otros tamaños de partículas y al área de escaneo, pero nunca comprometerá la precisión sobre si el fago se une o no al antígeno.La imagen se aplana en una imagen 2D y se resaltan las regiones mal imaginadas causadas por la contaminación con PEG para su eliminación en futuros análisis de datos. Inmuno precipitar la proteína TDP-43 sana de tejido cerebral humano sano según se describe en el protocolo del texto, debido a la menor cantidad de proteína inmuno precipitada. Realizar estas rondas de panning negativo utilizando primero MICA, escindir ocho superficies de MICA a la primera MICA con aproximadamente 100 microlitros de la proteína inmuno precipitada e incubar durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente tras la incubación.Lave la MICA cinco veces con solución salina tamponada con fosfato al 0,1 % con tween 20, abreviada como PBST. Luego, agregue aproximadamente 100 microlitros de fago después del panning negativo frente a tejido cerebral humano sano e incube de cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. A la mitad del tiempo de incubación, añada la proteína inmunoprecipitada a la segunda mica.Recopile el fago de la primera mica antes de lavar la mica cinco veces con PBST al 0,1 %. Después de lavar la segunda mica, agregue el fago recopilado previamente. Repita todo el proceso hasta que el fago sea sometido a panning negativo frente a las ocho micas con la proteína inmunoprecipitada.Verifique el éxito del proceso de selección utilizando el fago tras la primera y octava ronda de selección negativa con un FM para comenzar la inmunoprecipitación de la proteína TDP 43 a partir de cerebros de individuos con una LS según se describe en el protocolo del texto, escinde tres superficies MICA. A continuación, añada 50 microlitros de TDP 43 de LS A a la primera MICA tras una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente. Lave la MICA cinco veces con PBST al 0,1 %.A continuación, agregue 50 microlitros del fago recolectado tras el panning negativo frente a TDP 43 sano a la MICA e incube durante cinco minutos. Recolecte los fagos no unidos. Es importante mantener separados todos los fagos recolectados en estos pasos de panning.A continuación, recolecte los fagos unidos utilizando tres métodos de elución. Primero, agregue 50 microlitros de tripsina a cada MICA e incube durante no más de 10 minutos. Recoja la solución y guárdela.A continuación, agregue 50 microlitros de trietilamina 100 milimolar a cada MICA e incube durante no más de 10 minutos. Recopile la solución en un volumen igual de tampón tris HCl 1 molar pH 7,4 y guarde. En tercer lugar, agregue 50 microlitros de TG una células directamente a la MICA e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Además, agregue los fagos recopilados a partir de los dos primeros métodos de elución a 100 microlitros de TG una células en la misma concentración e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius.A continuación, repita este proceso con una segunda mica. Tome el fago no unido recolectado utilizando la primera MICA con A LST DP 43 y añádalo a la segunda MICA con A-A-L-S-T-D-P 43; incube durante cinco minutos. Combine las células TG una infectadas con los fagos, eluidas con tripsina de cada MICA de A LST DP 43, y siembre en una placa de agar luria con ampicilina o placa LBA.Repita el mismo proceso con la trietilamina y los fagos TG uno obtenidos de los dos conjuntos de A LS TDP 43 MICA, para un total de tres placas. Repita todos los pasos con una tercera A LS mica, pero en este caso utilice fagos recolectados tras dos rondas de panning negativo frente a la demencia frontotemporal. Plaque las células TG uno infectadas en tres placas de LBA e incube durante la noche a 37 grados Celsius.Al día siguiente, cuente el número de colonias en las seis placas de LBA con posibles clones a LS. Debe haber menos colonias en las tres placas de LBA procedentes del tercer A LS MICA en comparación con las tres placas de LBA tras las dos rondas de inmunoprecipitación positiva utilizando el fago tras la inmunoprecipitación negativa frente al TDP 43 sano. Produzca fagos y fragmentos solubles de dominio variable de cadena sencilla de anticuerpos o s cvs a partir de estos clones y analícelos mediante diferentes inmunoensayos para verificar la especificidad frente al tejido a LS.Se utiliza una imagen de FM para supervisar los pasos de panning negativo frente a los diversos objetivos y asegurar que se eliminen todos los fagos reactivos. Los resultados de FM mostraron unión de fagos tras una ronda de panning negativo frente a la alfa-sinucleína agregada y ausencia de unión tras ocho rondas. Se realizó un panning negativo frente a tejido cerebral humano sano para eliminar los fagos que se unen a los muchos antígenos presentes en el homogenato de cerebro humano sano.Se muestra aquí la unión de fagos al tejido sano tras una ronda de panning negativo y ninguna unión de fagos restante tras 10 rondas de panning negativo. Después de preparar tanto los fagos como el SCFE soluble a partir de clones potenciales, se evaluaron mediante ELISA indirecta para determinar su especificidad hacia un tejido LS. Casi todos los fagos mostraron preferencia por el tejido LS frente al tejido sano.Se obtienen resultados similares al comparar la unión de fagos a un LS con tejido de demencia frontotemporal o FTD. La comparación de la unión de SCFV a tejido de LS en tejido sano y en tejido FTD mostró nuevamente unión selectiva al tejido de LS en casi todos los clones. Se utilizó el inmunoensayo por inmunotransferencia en punto para verificar aún más la unión al tejido de LS y también para determinar qué clones son reactivos en otras aplicaciones inmunológicas.Aquí se muestra el clon dos a un tejido LS. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar un biopanning basado en FM para aislar reactivos frente a enfermedades, objetivos específicos de interés, reactivos que podrían servir como herramientas diagnósticas y/o terapéuticas potenciales.

novel-atomic-force-microscopy-based-biopanning-for-isolation

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

A modo de aprovechar microscopio de fuerza atómica (AFM) el método para la visualización de ADN plásmido, proteínas citoplasmáticas, y los complejos ADN-proteína se describe. El método incluye los enfoques alternativos para la preparación de muestras para el AFM imágenes después de la manipulación bioquímica. ADN que contiene regiones específicas que interactúan las proteínas se observan en las condiciones de amortiguación casi fisiológico.

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

Fuente: Lunelli, L., et. al. Observando los polisomas cerebrales con microscopía de fuerza atómica. J. Vis. Exp.(2016). Este video muestra la obtención de imágenes de polisomas utilizando microscopía de fuerza atómica. Una lámina de mica recubierta de iones de níquel ancla el ARN con ribosomas unidos. La muestra se lava, se seca y se monta en la platina del microscopio. La punta en voladizo escanea la superficie de la muestra, registrando las desviaciones del láser para mapear la topología. El...

 Obtención de imágenes de polisomas aislados del cerebro de un ratón mediante microscopía de fuerza atómica

situ (ISH) &gt; 'jove_content permite la visualización de ARN en células y tejidos. Aquí mostramos cómo la combinación de RNAscope ISH con inmunohistoquímica o colorantes histológicos se puede utilizar con éxito para detectar ARNm localizados en axones en secciones de cerebros humanos y de ratones.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

Presentamos un protocolo para funcionalizar los voladizos del microscopio de fuerza atómica (AFM) con una sola célula T y partícula de cuentas para estudios inmunológicos. Se muestran los procedimientos para sondear la unión de células T de un solo par por AFM y para monitorear la respuesta celular en tiempo real de los macrófagos a una sola partícula sólida por AFM con imágenes de fluorescencia.

Funcionalización de voladizos de microscopio de fuerza atómica con células de una t o de una sola partícula para espectroscopia de fuerza de una sola célula inmunológica

Describimos la aplicación de nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica de alta resolución para visualizar el proceso de autoensamblaje de proteínas en agregados oligoméricos y fibrillas amiloideas, que está estrechamente asociada con el inicio y desarrollo de una amplia gama de trastornos neurodegenerativos humanos.

Caracterización de agregados de proteínas individuales por nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica

Los biomarcadores basados en la sangre para enfermedades neurodegenerativas son esenciales para la implementación de estudios clínicos a gran escala. Un análisis de sangre confiable y validado debe requerir un pequeño volumen de muestra, así como ser un método de muestreo menos invasivo, asequible y reproducible. Este artículo demuestra que el inmunoensayo de electroforesis capilar de alto rendimiento satisface los criterios para el desarrollo potencial de biomarcadores.

Uso del inmunoensayo de electroforesis capilar para buscar biomarcadores potenciales de la esclerosis lateral amiotrófica en plaquetas humanas

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

Describimos un protocolo para inducir la transición de fase de la proteína 43 de unión al ADN TAR (TDP-43) por la luz en las neuronas motoras espinales utilizando el pez cebra como modelo.

Transición de fase optogenética de TDP-43 en neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra

Este estudio describe métodos experimentales para caracterizar bioquímicamente el GFAP y sus mutaciones causantes de enfermedades, centrándose en el ensamblaje, agregación y modificación postraduccional de filamentos. Se analizaron proteínas GFAP de alta pureza, lo que reveló conocimientos sobre los mecanismos de la enfermedad de Alexander que podrían proporcionar un marco para estudiar posibles objetivos terapéuticos y comprender las mutaciones y trastornos relacionados con GFAP.

Enfoques experimentales para el análisis bioquímico de la proteína ácida fibrilar glial y sus variantes asociadas a enfermedades

Aprende a aislar anticuerpos contra variantes de TDP-43 en ELA mediante biopanning con microscopía de fuerza atómica. Este método utiliza panning negativo exhaustivo para detectar proteínas específicas de la enfermedad en muestras biológicas complejas.

Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica (Video) | JoVE Journal

Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica

Explorar más videos