Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica

El objetivo general de este procedimiento es aislar reactivos específicos de morfología contra la proteína de unión al ADN de alquitrán. 43 variantes presentes en un LS que utiliza una tecnología de panoramización de radio basada en FM de dos fases A. Esto se logra sometiendo primero una biblioteca de fagos diversa a múltiples rondas de paneo negativo contra antígenos fuera del objetivo utilizando tubos inmunológicos.

El paneo negativo se realiza secuencialmente contra la albúmina sérica bovina, la alfa sinucleína agregada y el tejido cerebral humano sano. El segundo paso es completar una verificación FM después de cada conjunto de paneo negativo para garantizar la eliminación exitosa de todos los fagos no deseados. En este ejemplo de panoramano negativo, el uso de fagos de alfa sinucleína agregados son visibles después de una ronda, pero están ausentes después de la décima ronda.

A continuación, las rondas de paneo negativo restantes se realizan en MICA debido a la disponibilidad limitada de muestras. Los fagos reactivos a la TDP 43 inmunoprecipitada de tejido sano y de demencia frontotemporal o DFT se eliminan secuencialmente. El paso final es aislar los fagos que se unen a la LS inmunoprecipitada.

TDP 43 utilizando fagos unidos a mica se alude utilizando células de tripsina, trietilo, amina y TG one. En última instancia, la especificidad de estos clones potenciales de LS se verifica utilizando fa eliza indirectos y dot blots homogeneizados A-L-S-F-T-D y se inmovilizan tejidos cerebrales humanos sanos en ambos ensayos. Por lo general, se detecta una mayor reactividad a un tejido LS en comparación con los otros grupos analizados.

La principal ventaja de esta técnica sobre el biopaneo convencional de fagos es el uso de protocolos exhaustivos de paneo negativo, verificados por un FM, para garantizar el aislamiento de reactivos que reconocen selectivamente variantes proteicas específicas de la enfermedad directamente a partir de muestras biológicas complejas, incluso cuando están presentes en bajas concentraciones. Aunque un FM puede proporcionar información sobre la investigación de las características biomoleculares y las interacciones, también se puede aplicar a otros sistemas, como el seguimiento del progreso de la bioescritura y la confirmación de la especificidad de las CLO individuales. Comience este procedimiento con la producción de fagos como se detalla en el protocolo de texto para realizar primero el paneo negativo contra BSA, agregue cuatro mililitros de un miligramo por mililitro.

Solución de BSA en solución salina tamponada con fosfato o PBS a 12 tubos de inmunoalimentación e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, combine las partículas de fagos de cada una de las tres bibliotecas, reservando una pequeña cantidad de esta mezcla de fagos para la verificación futura del proceso de paneo negativo. A continuación, deseche la solución de BSA del primer tubo y lave el tubo dos o tres veces con PBS para eliminar cualquier BSA no unido, añada las bibliotecas de fagos combinadas a este primer tubo, incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en el rotador antes de recoger los fagos no unidos.

Tenga en cuenta que es importante guardar una pequeña cantidad de fago después de terminar las numerosas rondas de paneo negativo contra cada objetivo para verificar el éxito del proceso de paneo y, en caso de contaminación, repita el proceso de paneo negativo con los tubos restantes de solución BSA cada vez. Utilice el fago no unido recogido después de la incubación del tubo anterior. A continuación, verifique la eliminación de todos los aglutinantes de fagos BSA utilizando el procedimiento A FM que se detalla en la siguiente sección del vídeo.

Para visualizar la unión de fagos utilizando un FM, agregue de 10 a 20 microlitros del antígeno objetivo a la mica escindida e incube durante cinco a 10 minutos. Lave la MICA cinco veces con agua, luego agregue de 10 a 20 microlitros de los fagos a la MICA e incube durante cinco a 10 minutos. Lave la mica otras cinco veces con agua y deje secar al aire.

Ejecute un proceso de imagen FM utilizando un modo de toma FM con un nano scopio tres, un controlador en el aire a temperatura ambiente. Las sondas FM de silicio a tienen una frecuencia de resonancia de 300 kilohercios y una constante de resorte de 40 newton por metro. Inserte la punta FM en el cargador de puntas.

Conecte el cargador de puntas al microscopio A FM. Coloque la muestra bajo el microscopio A FM. Utilice las perillas para alinear el láser con la punta A FM.

Establezca la velocidad de escaneo en 3,05 hercios y la resolución de escaneo en 512 muestras por línea. Ajuste automáticamente la máquina para optimizar la vibración de sílice. Frecuencia de la punta, iniciar el escaneo de la muestra.

La punta escaneará la superficie de la MICA midiendo la altura del fago unido. Los fagos son las largas líneas blancas que siguen el proceso de adquisición de las imágenes mediante el aplanamiento básico del fondo para garantizar que todos los tamaños de partícula sean comparables dentro de cada imagen. El ancho del fago puede variar de una imagen a otra debido a otros tamaños de partícula y al área de escaneo, pero nunca comprometerá la precisión de si el fago se une o no al antígeno.

La imagen se aplana en una imagen 2D y las regiones mal fotografiadas causadas por la contaminación por PEG se resaltan para su eliminación en futuros análisis de datos. Precipitado inmunológico de la proteína TDP 43 saludable a partir de tejido cerebral humano sano, como se describe en el protocolo de texto, debido a la menor cantidad de proteína inmunoprecipitada. Lleve a cabo estas rondas de paneo negativo utilizando MICA primero: Corte ocho superficies de MICA a la primera MICA a aproximadamente 100 microlitros de la proteína inmunoprecipitada e incube durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente después de la incubación.

Lave la MICA cinco veces con solución salina tamponada con fosfato al 0,1 % con PBST abreviado tween 20. A continuación, añada aproximadamente 100 microlitros de fago después del paneo negativo contra el tejido cerebral humano sano e incube durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. A mitad de la incubación, agregue la proteína inmunoprecipitada a la segunda mica.

Recoja el fago de la primera MICA antes de lavarla cinco veces con 0,1% de PBST. Después de lavar la segunda mica, agregue el fago recolectado anteriormente. Repita todo el proceso hasta que el fago se panee negativamente contra las ocho micas con la proteína inmunoprecipitada.

Verifique el éxito del proceso de paneo utilizando el fago después de la primera y ocho rondas de paneo negativo con un FM para comenzar el precipitado inmunológico de la proteína TDP 43 de los cerebros de individuos con un LS como se describe en el protocolo de texto, escinda tres superficies MICA. A continuación, añada 50 microlitros de A LS TDP 43 a la primera MICA tras una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente. Lave la MICA cinco veces con 0.1% PBST.

A continuación, añada 50 microlitros del fago recogido después de la panorámica negativa contra el TDP 43 sano a la MICA e incube durante cinco minutos. Recoge los fagos libres. Es importante mantener separados todos los fagos recolectados en estos pasos de paneo.

A continuación, recoja los fagos unidos utilizando tres métodos elucianos. Primero, agregue 50 microlitros de tripsina a cada MICA e incube durante no más de 10 minutos. Recoja la solución y guarde.

A continuación, agregue 50 microlitros de trietilamina de 100 milimolares a cada MICA e incube durante no más de 10 minutos. Recoja la solución a un volumen igual de un molar tris HCL tampón pH 7.4 y guarde el tercero, agregue 50 microlitros de células TG one directamente a la MICA e incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Además, agregue los fagos recolectados de los dos primeros métodos elucianos a 100 microlitros de células TG one a la misma concentración e incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados.

A continuación, repite este proceso con una segunda mica. Tome el fago no unido recolectado con la primera MICA con A LST DP 43 y añádalo a la segunda MICA con A-A-L-S-T-D-P 43 incube durante cinco minutos. Combine las células TG one infectadas con los fagos, aludidos con tripsina de cada A LST DP 43 MICA y placa en todas las placas de barrena de luria burani con ampicilina o placa LBA.

Repita el mismo proceso para los fagos aludidos a la trietilamina y TG uno de los dos conjuntos de A LS TDP 43 MICA para un total de tres placas. Repita todos los pasos con una tercera mica A LS, sin embargo, en este caso, use el fago recolectado después de dos rondas de paneo negativo contra la demencia frontotemporal. T DP 43 coloca una placa en las células TG 1 infectadas en tres placas LBA e incuba durante la noche a 37 grados centígrados.

Al día siguiente. Cuente el número de colonias en las seis placas LBA con un potencial clones de a LS. Debería haber menos colonias en las tres placas de LBA de la tercera A LS MICA en comparación con las tres placas de LBA después de las dos rondas de paneo positivo utilizando el fago, después de que el paneo negativo contra TDP 43 sano produzca fagos y fragmentos solubles de anticuerpos de dominio variable de cadena única o s cvs de estos clones y se analice utilizando diferentes inmunoensayos para verificar la especificidad de un tejido LS.

Se utiliza una imagen FM para supervisar los pasos de panorámica negativa con respecto a los distintos objetivos para garantizar que se eliminen todos los fagos reactivos. Los resultados de una FM mostraron una unión de fagos después de una ronda de paneo negativo contra la alfa sinucleína agregada y ninguna unión después de ocho rondas. Se realizó un paneo negativo contra tejido cerebral humano sano para eliminar la unión de fagos a los muchos antígenos presentes en el homogeneizado del cerebro humano sano.

Aquí se muestra la unión de fagos al tejido sano después de una ronda de paneo negativo y no queda ningún fago unido después de 10 rondas de paneo negativo. Después de preparar tanto el fago como el SCFE soluble a partir de clones potenciales, se probaron en Eliza indirecto para determinar su especificidad con respecto a un tejido LS. Casi todos los fagos mostraron una preferencia por un tejido LS sobre el tejido sano.

Se obtienen resultados similares al comparar la unión de fagos a un LS con la demencia frontotemporal o el tejido de FTD. La comparación de la unión del SCFV a un tejido LS tanto en tejido sano como en tejido FTD mostró una vez más la unión selectiva a un tejido LS en casi todos los clones. El inmunoensayo dot blot se utilizó para verificar aún más la unión a un tejido LS y también para determinar qué clones son reactivos en otras aplicaciones inmunológicas.

Aquí, se muestra el clon dos a la unión a un tejido LS. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aplicar un paneo de biop basado en FM para aislar reactivos contra enfermedades, objetivos específicos de intereses, reactivos, que pueden servir como posibles herramientas diagnósticas o terapéuticas.