Name: PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende métodos de PCR en tiempo real basados en sondas para cuantificar microRNAs en plasma y suero. Esta técnica permite descubrir biomarcadores para cáncer y diabetes con alta sensibilidad.

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Todos los autores reconocen el apoyo a la infraestructura de la CTC NHMRC, Universidad de Sydney, la Fundación de Investigación de Diabetes Juvenil (JDRF), Australia y la Fundación Rebecca Cooper, Australia. Esta investigación fue financiada por subvenciones del Consejo Australiano de Investigación (FT110100254) y la JDRF, Australia (CRN201314) a AAH WW, RJF y MVJ lleva a cabo toda la experimentación laboratorio húmedo, ASJ llevó a cabo el análisis de datos. WW escribió el primer borrador. AAH previsto el estudio y analizó los datos. Todos los autores leído y coincidieron en la versión final del manuscrito, figuras y hojas de trabajo presentados para su publicación.

<ol><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+animal+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li>
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<li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet-specific+microRNAs+in+pancreas+development%2C+regeneration+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes.</a> Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).</li>
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<li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+islet-specific+microRNAs+during+human+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development.</a> Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).</li>
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<li>Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+breast+cancer+and+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects.</a> BMC Res Notes. 2, 89(2009).</li>
<li>Zhu, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+suitable+reference+genes+for+qRT-PCR+analysis+of+circulating+microRNAs+in+hepatitis+B+virus-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients.</a> Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).</li>
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<li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+developing+and+regenerating+pancreas+reveal+post-transcriptional+regulation+of+neurogenin3%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3.</a> Dev Biol. 311, 603-612 (2007).</li>
<li>Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+understanding+the+limits+for+quantitative+measurement+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR.</a> J Am Heart Assoc. 3, e000792(2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+Prognostic+Implications+of+a+Serum+miRNA+Panel+in+Oesophageal+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma.</a> PLoS One. 9, e92292(2014).</li>
<li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+microRNA+profiling+of+exosomes+derived+from+blood+and+culture+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media.</a> J Vis Exp. , e50294(2013).</li>
<li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li>
<li>Genda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA+changes+in+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+of+rats+with+chronic+constriction+injury%3A+A+TaqMan%28R%29+Low+Density+Array+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study.</a> Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+three+microRNA+profiling+platforms%3A+microarray%2C+beads+array%2C+and+quantitative+real-time+PCR+array%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array.</a> PLoS One. 6, e17167(2011).</li>
<li>Cuk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+plasma+as+early+detection+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer.</a> Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).</li>
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	 <a target="_blank" href="http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html">http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html</a> (2014).</li>
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</ol>

Los costos de procesamiento / publicación Artículo estaban cubiertos por Life Technologies, tras la aceptación de este manuscrito para su publicación.

Los pasos críticos dentro de los protocolos de qPCR basados ​​en sondas para obtener resultados exactos y reproducibles son para asegurarse de que 1) el mismo volumen y concentración de RT-producto se carga en cada reacción qPCR, 2) las proporciones correctas y los volúmenes de los componentes necesarios para qPCR reacción se preparó y se mezcló bien, 3) los volúmenes correctos y consistentes se añaden a cada reacción qPCR, y 4) la preparación y la carga de cada muestra y se mezcla de reacción se completa en el menor tiempo posible, mientras que todavía consciente de los pasos críticos antes mencionados antes. Las tarjetas de matriz microfluídica necesitan centrífuga adecuada y cubos específicos. Cada cubo puede contener hasta 3 tarjetas (cargado / vacío). Asegúrese siempre de que los 3 slots de un cubo son ocupados y el cubo se equilibra mediante la colocación de cubo similar (este cubo debe contener también 3 cartas, vacíos o llenos) en la ranura opuesto de la centrífuga. Al colocar la tarjeta en la bucket titular, asegúrese de que los 8 embalses proyectan hacia arriba y pocillos de reacción frente a la pared exterior de la centrífuga. Haga girar las tarjetas en 331 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente. Después de la primera vuelta, abrir la centrífuga y asegurar visualmente la mezcla de reacción se ha dispensado a través de los 384 pozos. Repita el lanzamiento en la misma configuración para 1 hora más. Retire la tarjeta de la cubeta y asegúrese de que el nivel de mezcla de reacción en cada uno de los 8 embalses es uniforme. Cualquier inconsistencia en los volúmenes de líquido que quedan en los embalses hacen la tarjeta inapropiado utilizar más. Para tener la misma concentración del producto RT, se añadió misma concentración de entrada de ARN en cada reacción de RT. La concentración de ARN total se mide utilizando un micro-volumespectrophotometer. La relación observada 260/280 puede ser tan baja como 1,3 para el ARN aislado a partir de plasma / suero; esto no parece tener un efecto en proceso relacionado qPCR-aguas abajo o datos generados 30. Del mismo modo, la relación 260/280 delas muestras de RNA ensayadas en el presente documento fueron entre 1.3 a 1.7 sin efectos anormales en el qPCR observados. Cuando se utilizan muestras de contenido de ARN bajos, tales como los de biofluidos, puede ser difícil de cuantificar ARN antes del procesamiento. Recomendamos el uso de sintéticos pico-in en el aislamiento de ARN, así como las etapas de transcripción inversa. En nuestra experiencia, los candidatos Arabidopsis thaliana miARN (ath-miR-159a y ath-miR-172a) son preferibles a Caenorhabditis elegans miRNAs (como cel-miR-39 o cel-miR-54), que en nuestra experiencia puede tener mayor homología que los de A. thaliana. El uso de tal etapa específica de espiga-en puede dar cuenta de la normalización de los datos a través de múltiples genes miARN muestras ensayadas en diferentes momentos. El uso de un volumen de entrada fija de ARN para la reacción de síntesis de ADNc también se recomienda 32,33. Los tres protocolos basados ​​en sondas para miARN cuantificación describen aquí requieren cantidades variablesde entrada de ARN total, los diferentes flujos de trabajo y los costos. Cada uno de los flujos de trabajo están diseñados para atender a los diferentes caudales en función del número de genes miARN objetivos y el número de muestras a analizar. Con el aumento de rendimiento (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), el coste por reacción disminuye con un aumento en la cantidad de datos obtenidos durante una unidad de tiempo. Dado que todas estas plataformas utilizan la química TaqMan, la calidad de los datos obtenidos se puede esperar a ser similares. TaqMan qPCR es un método bien establecido para la identificación de la abundancia de miRNAs en muestras de suero / plasma 9,11,27. Aunque las tres plataformas discutidos aquí comparten la misma química, una disminución en el volumen de reacción conduce a una disminución en el rango dinámico de detección de la transcripción (Farr RJ et al., Datos no publicados). La plataforma qPCR 96 pocillos es un rendimiento más bajo, pero la plataforma de alta sensibilidad y en nuestra opinión, el &quot;estándar de oro&quot; para todos (o tinte a base) basada en sondeos plataformas de PCR. Sin embargo, esto puedeno ser la plataforma más económica o eficiente si varios cientos o miles de muestras están siendo analizadas y para múltiples microRNAs. Microfluídica (TLDA) y nanofluidos (OA) plataformas son plataformas de alto rendimiento / contenidos diseñados para permitir la adquisición de datos más grandes en un tiempo más corto. Aunque las diferencias de proceso por lotes se han observado en las tarjetas de TLDA, esto puede ser minimizado mediante la solicitud de TLDA tarjetas del mismo lote. Observamos que la plataforma TLDA (Figura 3) mostró una variación significativa en el 17% de las medianas - miRNAs baja abundancia cuando se prueba utilizando la misma muestra en diferentes lotes de TLDA tarjetas. Por lo tanto, recomendamos el uso de los mismos números de lote para el análisis utilizando TLDA tarjetas. Esta variación también podría ser debido a la variabilidad técnica incluyendo cualquier potenciales errores de carga y de pipeteo. Sin embargo, se recomienda ordenar / solicitar el mismo lote de TLDA tarjetas. Ninguna variación lote significativa se observó en la plataforma de OA. A pesar de esto, TaqMan experimentalmente basadotal qPCR se acerca ofrecen facilidad para medir la abundancia de miRNAs en muestras de plasma / suero. Los bajo, medio y alto rendimiento enfoques discutidos aquí ofrecen la flexibilidad para analizar una serie de muestras y miRNAs utilizando una (bajo nivel de ruido de fondo) química altamente eficiente, reproducible y limpio.

Los microARN (miRNA) son ~ 22 nucleótidos no codificante (nc) RNAs, funcionando como reguladores de la expresión génica 3.1. La mayoría de los miRNAs en animales funcionan a través de la secuencia específica de emparejamiento de bases con un ARNm, apuntando a la 3 &#39;UTR, que conduce a la regulación negativa de la expresión del gen 2-4. Esto ocurre generalmente a través de la inhibición de la traducción de ARNm o ribosomal de entrega. miRNAs en circulación han sido demostrado ser nuevos biomarcadores en la investigación y campos clínicos para una variedad de enfermedades, como la diabetes 5-7, 8 de ovario, de próstata y cáncer de mama 9 10,11, hepatitis B 12 y otras enfermedades autoinmunes 13. Se han realizado investigaciones para identificar abundantes miRNAs en diferentes células o tejidos, así como en la circulación del plasma humano y las muestras de suero, que es más accesible y menos invasivo 9,11-15. Diferentes métodos de cuantificación miRNA han sido eEstablecido el uso de múltiples plataformas, como la plataforma estándar de placas de 96 pocillos 4,12,16-18, la plataforma de tarjetas de microfluidos 12,18-23 y la plataforma nanofluidos matriz 17,24. Cuantitativo en tiempo real PCR (qPCR) ofrece la posibilidad de medir los números relativos o absolutos de las transcripciones utilizando químicas múltiples (basados ​​en sondas de tinte o). En tiempo real la química basada en PCR-Probe ofrece el beneficio de baja fluorescencia de fondo y alta sensibilidad para detectar una sola copia transcripción. Es relativamente es rentable, fácil de usar y altamente reproducible, por lo que es un método preferido para la cuantificación y determinación de la expresión de miRNA 25. Método qPCR basada en sondeos generalmente implica dos pasos: la transcripción (RT) y qPCR 4,26,27 revertir. RT es donde el cebador de tallo-bucle RT se hibrida a una molécula de miARN maduro o primaria y se convierte en (c) ADN complementario. Cuantificación del producto de ADNc se lleva a cabo entonces usando cebadores de PCR específicos de los genes miARN-26-28. El principio de qPCR basado sonda se basa en la detección de extensión complementaria hebra en tiempo real, lo que implica la hidrólisis de la sonda-marcado con fluorescencia. Estas sondas están diseñadas para contener un reportero fluorescente y un inhibidor de la fluorescencia que son sólo de separación para permitir FRET (Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente). La detección de la emisión de la fluorescencia reportero (emisor) está enmascarado por la estrecha proximidad de la molécula de extintor. Cuando Taq polimerasa (pol) se extiende desde el cebador aguas arriba y llega a un tenedor (el extremo 5 &#39;de la sonda), la actividad exonucleasa pol Taq hidroliza la sonda, que conduce a una disociación física / separación del emisor fluorescente del extintor. Esta versión de una sola molécula de emisor de fluorescencia es registrado por el detector y se presenta como un aumento incremental en la señal de fluorescencia de ese pozo / reacción. El aumento de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de producto de PCR generado, lo que permite una precisa quantification de la 26,28 diana amplificado. Con el aumento de la demanda en miARN cuantificación, a medio y tecnologías de alto rendimiento se han desarrollado para permitir que un mayor número de muestras a procesar en un corto período de tiempo. TaqMan Low Density Arrays (TLDA) es un medio de rendimiento de diseño microfluídico innovador basado en la química qPCR basada en sonda que ofrece un aumento en el número de miRNAs analizados en un plato. TLDA implica el uso de una piscina predefinido de RT-cebadores que se utilizan para sintetizar el ADNc. Estos ADNc se centrifugaron en una tarjeta bien personalizado 384 micro-fluidos para determinar la expresión de múltiples miRNAs utilizando qPCR 22,26,29. Cada pocillo de la tarjeta contiene cebadores y sondas se seca para amplificar miRNA específico (s), por lo tanto, hasta 384 reacciones pueden ser procesados ​​en una sola tarjeta TLDA 26. La matriz nanofluidos es una plataforma de alto rendimiento que se utiliza para la detección de transcritos de genes <sup&gt; 24 usando la misma química basada en sondeos. Se utiliza una matriz patentada que ofrece interacciones hidrofóbicas hidrófilo para facilitar la carga fácil de la mezcla de reacción 33 nanolitros en una matriz de 3.072 orificios pasantes en una diapositiva de acero inoxidable 24. Este artículo se centra en la demostración de cómo se llevan a cabo estos métodos para cuantificar miRNAs en suero / plasma y los factores críticos que deben ser considerados al realizar e interpretar estos datos. Llevado a cuenta, sus beneficios individuales y limitaciones serán discutidos en este artículo.

<table><tbody><tr>Plataforma <td></td><td></td><td></td><td>de 96 pozos</td></tr><tr><td>para ensayos de microARN</td> TaqMan de transcripción <td></td><td></td><td></td>inversa</tr><tr><td>INV SM&nbsp;</td><td>Biosistemas Aplicados &nbsp;</td><td>4427975</td><td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 Los ensayos se presentan en un paquete de cebadores RT y cebadores PCR.</td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa de microARN TaqMan Applied</td><td>Biosystems &nbsp;</td><td>4366597 o 4366596</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 o http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 El kit de transcripción inversa de microARN TaqMan es el mismo kit que se utiliza para la transcripción inversa en todas las plataformas threeTaqMan: plataforma de 96 pocillos, TLDA y OpenArray.</td></tr><tr><td>Para qPCR ejecutado en una plataforma</td><td></td><td></td><td></td>de 96 pocillos</tr><tr><td>2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, sin AmpErase UNG&nbsp;</td><td>Biosistemas Aplicados &nbsp;</td><td>4367846</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 La mezcla maestra de PCR universal rápida 2X TaqMan se utiliza para qPCR en &nbsp; las dos plataformas TaqMan: la plataforma de 96 pozos y TLDA.</td></tr><tr><td>Película adhesiva óptica MicroAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td></tr><tr><td>Placa de reacción óptica rápida MicroAmp de 96 pocillos, 0,1 ml&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td></tr><tr><td>Plataforma de microfluidics (TLDA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Para la</td><td></td><td></td><td></td>transcripción inversa</tr><tr><td>Consulte el kit de transcripción inversa TaqMan MicroRNA de la plataforma de 96 pocillos (4366597 o 4366596) (como se muestra arriba).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4399966</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 El Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 se utiliza para RT on&nbsp; las dos plataformas TaqMan: TLDA y OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444281</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 El Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 se utiliza para RT on&nbsp; las dos plataformas TaqMan: TLDA y OpenArray.</td></tr><tr><td>OR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OR Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444750</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 El Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 se utiliza para RT on&nbsp; las dos plataformas TaqMan: TLDA y OpenArray.</td></tr><tr><td>Para la preamplificación</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4391128 o 4488593</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 o http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 El TaqMan PreAmp Master Mix se utiliza para la preamplificación de qPCR on&nbsp; las dos plataformas TaqMan: TLDA y OpenArray.</td></tr><tr><td>Imprimaciones de preamplificador Megaplex, Human Pool B v3.0&nbsp;</td><td>Biosistemas Aplicados &nbsp;</td><td>4444303</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 El Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 se utiliza para la preamplificación de qPCR on&nbsp; las dos plataformas TaqMan: TLDA y OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4399233</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 El Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 se utiliza para la preamplificación de qPCR on&nbsp; las dos plataformas TaqMan: TLDA y OpenArray.</td></tr><tr><td>1x Tampón TE (100 ml)</td><td>Invitrogen</td><td>12090-015</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product El tampón 1x TE se utiliza para la preamplificación de qPCR on&nbsp; las dos plataformas TaqMan: TLDA y OpenArray.</td></tr><tr><td>Para cargar y ejecutar la tarjeta</td><td></td><td></td><td></td>de microfluídica de 384 pozos (TLDA)</tr><tr><td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&nbsp;</td>Plataforma de nanofluidos <td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 4444913</td><td></td>de <td>Applied Biosystems</td></tr><tr><td>(OpenArray)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Para la</td><td></td><td></td><td></td>transcripción inversa</tr><tr><td>Consulte el kit de transcripción inversa de microARN TaqMan de la plataforma de 96 pocillos (4366597 o 4366596) (como se muestra arriba).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Para la preamplificación</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consulte Reactivos de preamplificación TLDA (como se muestra arriba)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Para cargar y ejecutar los portaobjetos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4470187</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td></tr><tr><td>Kit de accesorios QuantStudio 12K Flex OpenArray&nbsp;</td><td>Biosistemas Aplicados &nbsp;</td><td>4469576</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td></tr><tr><td>Placas de muestra OpenArray de 384 pocillos&nbsp; &nbsp;</td><td>Biosistemas Aplicados &nbsp;</td><td>4406947</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4462159</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td></tr><tr><td>Consejos del sistema OpenArray AccuFill&nbsp;</td><td>Biosistemas Aplicados &nbsp;</td><td>4457246</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td></tr><tr><td>otros</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>de agua sin nucleasas</td><td>129117</td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td></tr></tbody></table>

pcr en tiempo real basada en sondeos enfoques para la medición cuantitativa de micrornas

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Basado en la sonda de PCR cuantitativa (qPCR) es un método preferido para medir la abundancia de transcripción, ya que es uno de los métodos de detección más sensibles que proporciona un análisis preciso y reproducible. Química basada-Probe ofrece la fluorescencia de fondo por lo menos en comparación con otras químicas (base de colorante). Actualmente, hay varias plataformas disponibles que la química basada en sonda de uso para cuantificar la abundancia de transcripción. qPCR en un 96 y placa es el método más utilizado habitualmente, sin embargo, sólo un máximo de 96 muestras o miRNAs se puede probar en una sola carrera. Esto consume tiempo y tedioso si un gran número de muestras / miRNAs se van a analizar. Las plataformas basadas en la sonda de alto rendimiento como microfluídica (por ejemplo, tarjetas de TaqMan Array) y matrices nanofluidos (por ejemplo OpenArray) ofrecen la facilidad para detectar de manera reproducible y eficiente la abundancia de múltiples microRNAs en un gran número de muestras en poco tiempo. Aquí, nos demuestran la configuración experimental unnd protocolo para miARN cuantificación de muestras de suero o plasma EDTA, utilizando la química basada en la sonda y tres plataformas diferentes (placa de 96 pocillos, microfluídica y matrices nanofluidos) ofreciendo mayores niveles de rendimiento.

El volumen recomendado para una reacción qPCR ensayo basado sonda-miRNA es de 20 l. NOTA: Hemos confirmado que un volumen de reacción de 5 l es capaz de producir resultados similares a los obtenidos utilizando 20 l de volumen 4,7,30. La reducción del volumen de reacción a 5 l permite una disminución del 75% en los costes de reactivos sin pérdida apreciable en la sensibilidad. Tal como se presenta en la Figura 2, los volúmenes de reacción de 20 l y 5 l muestran una fuerte correlación hasta 39 ciclos (con r 2 de 0,92, p = 0,0002). Array microfluídica proporciona una herramienta para la obtención de datos sobre 754 miRNAs expresadas en una muestra en alrededor de 5 horas (para la tarjeta de A y B de tarjeta), que es una forma más eficiente de analizar múltiples muestras en comparación con convencionales 96 PCRs placa de pocillos. Comparamos miARN tarjetas de matriz de microfluidos para la misma muestra (muestra A y la muestra A repetición) Figura 3A -. B muestra un gráfico de Bland-Altman (&lt;strong&gt; 3A) y la trama de correlación (3B) para todos los 754 miRNAs ensayadas para estas muestras. Hay 3 miRNAs control diferentes (U6, RNU44 y RNU48) colocados al azar en ambos las tarjetas (Card A y B) en varias ubicaciones. Cuando los valores de umbral ciclo U6 (MA) son comparados entre los 2 carreras, no observamos diferencias significativas entre los valores (Tabla 4). También es importante señalar aquí que U6 se expresa en mayor abundancia (menor valor Ct) en la muestra evaluada. Por último, comparamos todos los miRNAs que tienen valores de Ct entre 0-19,99 tanto en las carreras (n = 150), que había expresión similar de miRNAs general con un coeficiente de determinación de 98% (Figura 3C-D). De todos los 277 miRNAs que tienen valores de Ct de 20 a 29.99 en tanto las carreras, 16 miRs difirieron significativamente entre los originales y ensayos repetidos (Figura 3E - F) El número de miRNAs con diferencia significativa betwee.n las carreras aumentaron (89 de 327) cuando se seleccionan los valores de Ct entre 30-40 para ambas carreras (Figura 3G - H). La plataforma nanofluidos matriz proporciona datos para 754 miRNAs de cada muestra de suero / plasma ensayadas, tal como se representa en la figura 4A Es importante examinar estas curvas de amplificación -. Como lo es con todo qPCR - para asegurar que el resultado es indicativo de la verdadera amplificación. Cada una de las 48 subarrays (Figura 1) contiene también un ensayo para las tres ncRNAs de &quot;mantenimiento&quot; más populares:. U6, RNU44 y RNU48 Figura 4B ilustra una agrupación típica de U6 replica de una sola muestra. Estas repeticiones muestran baja desviación estándar (SD &lt;0,5) y así son un indicador de fiabilidad. Alternativamente, la Figura 4C demuestra el aumento de la variabilidad de repeticiones U6 (SD&gt; 0,5) en una segunda muestra. Esto no niega la validez of los ensayos restantes, aunque sí requeriría una crítica más a fondo. U6, como con la mayoría de miRNAs &quot;limpieza&quot; en fluidos biológicos, puede tener una expresión variable. Cabe señalar que una de las muestras, se describen en la Figura 4C, muestra 4 veces menor contenido U6 que la presentada en la Figura 4B. Dado que el nivel de U6 en la muestra presentada en 4C es un 75% menos, para empezar que el presentado en el panel 4B, una mayor variabilidad técnica se espera debido a la distribución de Poisson de las transcripciones, que se ve agravada por el volumen de reacción pequeño 17. Otra herramienta útil es que las imágenes de control de calidad (CC), disponible para la exportación una vez que la carrera ha terminado. Una selección de estos utiliza la fluorescencia de ROX, el colorante pasiva que se encuentra en la mezcla de reactivos qPCR, para confirmar que cada orificio pasante se ha cargado correctamente (Figura 5). A-agujero a través, o incluso un cuarto<html> subarreglo neumático, no se puede cargar debido al volumen de muestra insuficiente, la evaporación, las burbujas presentes en los pocillos de la placa de muestra de 384 pocillos, la falta de eliminar completamente la junta de la placa de la muestra, o defectos en el sistema de Accufill o sus puntas. Cualquier descargado orificios pasantes deben ser identificados para evitar miRNAs etiquetado como &quot;no detectable&quot;, cuando en realidad el ensayo no estaba cargada. Si se produce este problema, asegúrese de que al menos 5 l de muestra / mezcla maestra se carga en cada pocillo de la placa de la muestra de 384 pozos, la placa muestra se centrifuga correctamente antes de la carga, el sello de aluminio se elimina por completo, y la OpenArray cargado diapositiva se sella y se ejecuta dentro del tiempo asignado para todas las carreras sucesivas. Si todavía persisten problemas de carga, estos pueden ser más probable que pertenecen a lote específico o lote de las matrices o consumibles relacionados y más ayuda debe buscarse a través del fabricante. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Distribución de las muestras para el flujo de trabajo de matriz nanofluidos: (A) Cada placa de muestras de 384 pozos puede contener muestras para un máximo de 8 matrices nanofluidos. (B) Diluido, ADNc pre-amplificado se coloca en 8 pozos (2 columnas por 4 filas), con el Grupo A y Grupo B en grupos de 8 pocillos adyacentes. Cada círculo representa un pozo. (C) Cada pocillo de la placa de la muestra podrá ser cargada en un subconjunto de la matriz nanofluidos. Cada pequeño cuadrado representa un subconjunto. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Figura 2: Análisis de Co-relación para convencionales de 96 pocillos plataformas de PCR: Co-relación entre 20 l y 5 volúmenes de reacción l en tiempo real TaqMan qPCR utilizando una plataforma estándar de placa de 96 pocillos en valores de CT (39 ciclos). Comparamos 4 microRNAs diferentes (miR-375, miR-30c, miR-30d y miR-7) en 4 muestras de suero y plasma humanos diferentes. Sólo 11 puntos de datos se representan ya que los demás fueron indetectables. R 2 = 0,92, p = 0,0002. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Figura 3: Circulación miARN perfiles de uso de tarjetas de microfluidos matriz usando 2 tarjetas de microfluidos (tarjeta-A y tarjeta-B), se genera un perfil de 754 miRNAs (A - B). Como se muestra aquí, se utilizó una misma muestra de 2 matriz microfluídica corre para comprobar la reproducibilidad de los resultados de la tarjeta microfluídica. Se ha observado una expresión similar de miRNAs en general, con los valores de Ct entre 0-19,99 (C - D). Hay pocos miRNAs (16 de 277) con los valores de Ct entre 20 a 29,99 y significativas diferencias entre ensayos repetidos (E - F). Ochenta y nueve de 327microRNAs con los valores de Ct más altas (30-40) mostraron diferencias significativas entre ambas carreras (G - H). &#160; Los datos se analizaron mediante la prueba T pareada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Figura 4: Representante del perfil de las curvas de amplificación por PCR del producto: Es una figura representativa de los combinados curvas (A) de amplificación de todos los genes miARN objetivos para una muestra de plasma humano. Un ensayo para U6 (un control común ncRNA) se coloca en cada subconjunto. La muestra en (B) demuestra una baja variabilidad (SD &lt;0,5), mientras que (C) muestra alta desviación estándar (SD&gt; 0,5) dentro de U6 se replica. Ambas muestras son total ARN aislado a partir de plasma humano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Figura 5: Análisis del control de calidad de nanofluidos Arrays: control de calidad (QC) imágenes de un array nanofluidos cargado correctamente (izquierda) y una serie nanofluidos cargado incorrectamente (a la derecha). El tinte pasiva, ROX (presente en la mezcla de reactivos qPCR), fluorescente para indicar un agujero pasante cargado correctamente. La matriz de la derecha tiene varios subconjuntos / orificios pasantes que no estén cargados con la mezcla de reactivos qPCR y estos deben ser identificadas como reacciones falsos negativos de PCR. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volumen por 5 l de reacción (l) </td></tr&gt; <tr><td> Tampón de RT (10x) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> dNTPs (100 mM) </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> RNasa inhibidor </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Agua libre de nucleasa </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> Transcriptasa Inversa </td><td> 0.33 </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> Tabla 1A: RT componentes de la mezcla de reactivos en una preparación de reacción de RT 5 l de TaqMan en tiempo real qPCR utilizando una plataforma de placa de 96 pocillos estándar. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volumen por 5 l de reacción (l) </td><td> Volumen por 20 l de reacción (l) </td></tr><tr><td> Mastermix PCR rápida (2x) </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Ensayo TaqMan qPCR (20x) * </td><td> 0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Libre de nucleasaagua </td><td> 1.45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> Volumen Total: </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> * Componente de ensayo basado en el miARN seleccionado probado. Tabla 1B: qPCR componentes de la mezcla de reactivos en una preparación de reacción qPCR 5 o 20 l de TaqMan en tiempo real qPCR utilizando una plataforma de placa de 96 pocillos estándar. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volumen por reacción (l) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primers (10x) </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> dNTPs con dTTP (100 mM) </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Multiscribe transcriptasa inverso (50 U / l) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNasa Inhibidor &amp; #<html> 160; (20 U / l) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> Agua libre de nucleasa </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabla 2A: RT componentes de la mezcla de reactivos en una preparación de reacción RT 5 l para el panel TLDA miRNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volumen por reacción (l) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex preamplificador Primers (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Agua libre de nucleasa </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tabla 2B: preamplificador componentes de la mezcla de reactivos en una preparación de reacción de 25 l de pre-amplificación para el panel TLDA miRNA. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volumen por reacción (l) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primers (10x) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dNTPs con dTTP (100 mM) </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> Multiscribe transcriptasa inverso (50 U / l) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNasa Inhibidor (20 U / l) </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td> Agua libre de nucleasa </td><td> 0.35 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabla 3A: RT componentes de la mezcla de reactivos en una preparación de reacción RT 5 l para el panel nanofluidos miARN basada en sondeos. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volumen por reacción (l) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex preamplificador Primers (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Agua libre de nucleasa </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tabla 3B:. Preamplificador componentes de la mezcla de reactivos en una preparación de reacción de 25 l de pre-amplificación para el panel nanofluidos miARN basado en la sonda NOTA: El complementario interactivo excel hojas de cálculo previstas para las tres plataformas, ya representa la adición de 5% para compensar el error de pipeteo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Muestra A </td><td> Muestra A repetición </td></tr><tr><td> 15.535 </td><td> 16.156 </td></tr><tr><td> 15.471 </td><td> 15.652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16.063 </td></tr><tr><td> 15.963 </td><td> 15.889 </td></tr><tr><td> 14.006 </td><td> 13.993 </td></tr><tr><td> 14.502 </td><td> 14.623 </td></tr><tr><td> 14.907 </td><td> 14.384 </td></tr><tr><td> 13.732 </td><td> 14.946 </td></tr></tbody></table> Tabla 4: Circulación miARN perfiles U6 usando microfluidos tarjeta matriz. Uso de dos tarjetas de matriz de microfluidos (A y B). Valores Ct de miRNA de control U6 de la muestra A (total = 8). El control U6 Consistente miARN abundancia observada entre las carreras.

MicroRNAs circulantes han surgido recientemente como biomarcadores prometedores y novedosos para varios tipos de cáncer y otras enfermedades. El objetivo de este artículo es discutir tres plataformas basados ​​en sondas diferentes en tiempo real PCR y métodos que están disponibles para cuantificar y determinar la abundancia de microRNAs en circulación.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar tres métodos diferentes de PCR en tiempo real basados en sondas que se utilizan para cuantificar micro ARN en muestras de plasma y suero. La PCR en tiempo real basada en sonda se logra mediante hidrólisis y detección de la sonda marcada con fluorescencia, que contiene un reportero fluorescente y un extintor. Cuando la polimerasa pegajosa se extiende desde el cebador aguas arriba y llega hasta el extremo de cinco cebadores de la sonda, conduce a una disociación física del emisor fluorescente del extinguidor.A continuación, se libera una sola molécula de fluoro cuatro, que es registrada por el detector y se presenta como un aumento incremental en la señal fluorescente de esa reacción. En última instancia, la cantidad de producto de PCR generado se puede medir en función del aumento de la fluorescencia, lo que permite una cuantificación precisa del amplificador objetivo amplificado. Este método se está convirtiendo en un método prometedor para descubrir nuevos biomarcadores para varios tipos de cáncer y otras enfermedades como la diabetes.Aunque este método puede proporcionar información sobre la abundancia de microARN en suero y plasma, también se puede aplicar a otras muestras, como células y tejidos periféricos. Una demostración visual de este protocolo es fundamental, ya que algunos de los pasos involucrados en el sellado del portaobjetos de la matriz de nanofluidos pueden ser difíciles de aprender simplemente leyendo el protocolo Para la detección de micro ARN maduro de PCR cuantitativa en tiempo real basada en sonda a 4,2 microlitros del reactivo QPCR individual se mezcla en cada pocillo de una placa óptica de 96 pocillos, seguido de 0,8 microlitros de la solución de reacción de ADNc recién preparada adecuada. Selle la placa con la cubierta óptica adecuada y, a continuación, inicie la QPCR en el sistema de PCR en tiempo real.Para preparar una tarjeta de matriz de microfluídica con una entrada inicial de ARN de uno a 1000 nanogramos totales, primero descongele el tampón de cebadores del grupo A y B, los fosfatos de nucleótidos desoxi, el cloruro de magnesio y el inhibidor de ARN en hielo. Luego, para realizar la transcripción inversa, se colocan 100 nanogramos de cada muestra de ARN en un tubo del grupo A o del grupo B, seguido de la adición del volumen apropiado de agua libre de nucleasa para llevar el volumen total de cada tubo a tres microlitros. A continuación, mezcle 4,5 microlitros del reactivo de transcripción inversa adecuado en los tubos correspondientes adecuados.A continuación, coloque las muestras en el termociclador e inicie la transcripción inversa. Mientras que la transcripción inversa está progresando. Para entradas de muestras de ARN total entre uno y 350 nanogramos, descongele el conjunto predefinido de cebadores de preamplificación en hielo cuando las muestras estén listas, alícuota 22,5 microlitros del reactivo de preamplificación adecuado.Mezcle en los tubos del grupo A y del grupo B y agregue 2,5 microlitros de la muestra de CDNA transcrita inversa en cada uno. A continuación, cargue las muestras en el termociclador e inicie el ciclo de preamplificación. Al final del ciclo, agregue 75 microlitros de tampón de 0,1 x tris EDTA al CDNA preamplificado para cargar la tarjeta de microfluídica.A continuación, agregue 450 microlitros de mezcla de reactivos QPCR a nueve microlitros del CDNA amplificado PREPL diluido para la tarjeta A, use el producto amplificado PREPL preparado con el cebador pool A y agregue 441 microlitros de agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 900 microlitros. Luego, una vez que alcance la temperatura ambiente, retire la tarjeta de matriz de baja densidad de tachuelas de su empaque y colóquela con el papel de aluminio hacia abajo en un área limpia. Añadir 100 microlitros de reacción PCR.Mézclalo en cada uno de los ocho puertos de llenado de la tarjeta. Gire la tarjeta durante un minuto a 331 GS y temperatura ambiente. Luego, con un trazo lento, constante y uniforme, empuje el carro a través de la tarjeta hasta que llegue al punto final del sellador.Retire la tarjeta de matriz sellada y corte los depósitos. A continuación, confirme que la tapa calefactada por bloque y el portador de muestras correctos estén instalados en el sistema de PCR en tiempo real de la matriz de microfluidos. Para cargar las matrices nano fluídicas, descongele el prepl diluido, el CDNA amplificado y el reactivo QPCR en tiempo real.Mezcle y mezcle el frasco de reactivo QPCR girando. A continuación, añada 22,5 microlitros de mezcla de reactivos QPCR a 22,5 microlitros de CDNA amplificado y prepl diluido. A continuación, añada cinco microlitros de cada muestra en ocho pocillos de la placa de muestra de 384 pocillos del flujo de trabajo de la matriz de nanofluidos nanofluidos, teniendo cuidado de colocar el grupo A y el grupo B de cada muestra.En bloques de ocho pocillos adyacentes, cuando se hayan transferido todas las muestras, cubra cada sección de la placa con piezas de sellador de placas de muestra de matriz abierta. A continuación, descongele el primer portaobjetos de la matriz de nanofluidos a temperatura ambiente después de aproximadamente 15 minutos. Confirmado que la tapa de edición de bloques y el portador de muestras correctos están instalados en el sistema de matriz de nano fluidos, y luego afloje el émbolo de la jeringa de fluido de inmersión con un tirón suave.Retire la tapa, coloque la punta en su lugar y enjuague el aire de la punta. A continuación, coloque las puntas del sistema de carga dentro del sistema de carga. Abra la tapa y coloque la placa de muestra en el sistema de carga.Ahora ponte un par de guantes ajustados. Abra con cuidado el empaque de la corredera e incline lentamente la corredera fuera del paquete sin tocar la parte superior. Coloque la corredera en el sistema de carga con el código de barras a la izquierda.A continuación, retire el sellador de la parte de la placa de muestra destinada a la carga y utilice el software del sistema de carga para introducir la corredera, el código de barras, la posición de la corredera, la posición de la muestra y la configuración de la punta. Mientras se carga la guía, retire el plástico transparente y rojo de la parte inferior de la tapa de la guía. Luego, retire y selle con cuidado la corredera dentro de los 90 segundos posteriores al final del proceso de carga.Coloque el portaobjetos dentro de la abrazadera de la placa y la tapa del portaobjetos en el portaobjetos durante 30 segundos confirmando que la tapa está colocada de manera que el código de barras se muestre correctamente. A continuación, coloque la jeringa de líquido de inmersión dentro del portaobjetos de modo que la punta presione contra la tapa y llene lentamente el portaobjetos con líquido de inmersión, teniendo cuidado de que el líquido corra a lo largo de la tapa. Una vez que la corredera esté llena, séllela con el tapón, girando el tornillo hasta que se rompa el mango.Finalmente, retire la cubierta de plástico en la parte superior de la tapa del portaobjetos y coloque con cuidado el portaobjetos en el soporte del sistema de PCR en tiempo real. Tenga cuidado de sostener la parte inferior de la corredera a medida que se baja sin tocar la parte superior de la corredera. A continuación, inicialice el sistema de PCR e inicie el programa de PCR cuantitativa en el plazo de una hora tras la carga de las muestras.Con este procedimiento, un volumen de reacción de cinco microlitros puede producir resultados similares a los que se obtienen con un volumen de 20 microlitros con una fuerte correlación. Hasta 39 ciclos aquí, se muestran gráficos de correlación y Altman insípidos para todos los 754 micro RN probados en la misma muestra utilizando tarjetas de matriz de microfluídica, ya que los microARN recién demostrados que tienen valores de CT entre cero y 19,99 en ambos senderos también exhiben expresiones similares con un coeficiente de determinación del 98%Además, el número de microARN con diferencias significativas observadas entre los ensayos aumenta cuando se seleccionan valores de CT entre 30 y 40. En este gráfico, se muestran los datos de la plataforma de la matriz de nanofluidics para los 754 microRNAs.Es importante examinar las curvas de amplificación para asegurarse de que los resultados sean indicativos de una amplificación verdadera. Los microARN de limpieza, como el U seis, también deben examinarse para determinar la variabilidad. Por ejemplo, en este gráfico, se muestra una agrupación típica de U seis réplicas que muestran una desviación estándar baja, lo que indica la fiabilidad de los datos.Finalmente, estos datos ilustran el aumento de la variabilidad de las réplicas de U six en una segunda muestra. Las tecnologías basadas en sondas de alto rendimiento, como las matrices de microfluídica y fluida Nana, ofrecen la facilidad de detectar de manera reproducible y eficiente la abundancia de múltiples microARN en un gran número de muestras en muy poco tiempo. Cada uno de los flujos de trabajo está diseñado para atender a diferentes rendimientos en función del número de objetivos de microARN y el número de muestras que se van a analizar.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar diferentes técnicas de PCR en tiempo real basadas en sondas para aumentar la abundancia de micro NA.

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Biología

Vamos a demostrar la configuración y el análisis de pre-microRNA-96 y las matrices de QPCR utilizando un robot, así como con la mano con una pipeta de Thermo Scientific multicanal Matrix.

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

Cuantitativa de la polimerasa en tiempo real de reacción en cadena (PCR cuantitativa) es un método rápido y sensible para investigar los niveles de expresión de microARN (miRNA varias) moléculas en las muestras tumorales. El uso de este método de expresión de cientos de moléculas de diferentes miARN puede ser amplificada, cuantificado y analizado desde la misma plantilla de cDNA.

Detección de microARN en tumores de próstata por el cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)

Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

Molecular señalización a través de estrógeno y microRNAs son fundamentales en el desarrollo y el crecimiento del cáncer de mama. El estrógeno activa los receptores de estrógeno, que son factores de transcripción. Muchos factores de transcripción pueden regular la expresión de microRNAs, y microARN regulados por estrógenos se puede perfilar el uso de diferentes técnicas a gran escala.

Perfiles de microARN regulados por estrógeno en las células del cáncer de mama

Se describe un método sensible y preciso para la cuantificación de microRNAs libres de células utilizando una química basada en colorantes y tecnología de PCR digital en gotas.

Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de miRNA plasma, mediante la transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR con o sin la amplificación. Este protocolo permite la mejor comprensión de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación cualitativa de los correspondientes datos de diferentes estudios o laboratorios.

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

Aquí, se presenta un protocolo cuantitativo en tiempo real basado en la reacción en cadena de la polimerasa para la determinación del contenido nativo de microARN (absoluto/relativo) de las partículas de lipoproteína. Además, se demuestra un método para aumentar el nivel de microARN, así como un método para determinar la tasa de captación celular de las partículas de lipoproteínas.

Enriquecimiento de partículas de lipoproteínas nativas con microRNA y determinación posterior de su contenido absoluto/relativo de microRNA y su tasa de transferencia celular

Este protocolo utiliza una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en sondas en tiempo real, un ensayo de sulforhodamine B (SRB), 3' regiones no traducidas (3' UTR) clonación, y un ensayo de luciferasa para verificar los genes diana de un miRNA de interés y para entender las funciones de los miRNAs.

Un protocolo in vitro para evaluar los niveles, funciones y genes objetivo asociados de MicroRNA en células tumorales

Aquí, describimos una estrategia paso a paso para aislar pequeños ARN, enriquecer para microARN y preparar muestras para la secuenciación de alto rendimiento. A continuación, describimos cómo procesar lecturas de secuencia y alinearlas con microRNAs, utilizando herramientas de código abierto.

Una tubería completa para aislar y secuenciar microRNAs, y analizarlos mediante herramientas de código abierto

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Aprende métodos de PCR en tiempo real basados en sondas para cuantificar microRNAs en plasma y suero. Esta técnica permite descubrir biomarcadores para cáncer y diabetes con alta sensibilidad.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

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