PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar tres métodos diferentes de PCR en tiempo real basados en sondas que se utilizan para cuantificar micro ARN en muestras de plasma y suero. La PCR en tiempo real basada en sonda se logra mediante hidrólisis y detección de la sonda marcada con fluorescencia, que contiene un reportero fluorescente y un extintor. Cuando la polimerasa pegajosa se extiende desde el cebador aguas arriba y llega hasta el extremo de cinco cebadores de la sonda, conduce a una disociación física del emisor fluorescente del extinguidor.

A continuación, se libera una sola molécula de fluoro cuatro, que es registrada por el detector y se presenta como un aumento incremental en la señal fluorescente de esa reacción. En última instancia, la cantidad de producto de PCR generado se puede medir en función del aumento de la fluorescencia, lo que permite una cuantificación precisa del amplificador objetivo amplificado. Este método se está convirtiendo en un método prometedor para descubrir nuevos biomarcadores para varios tipos de cáncer y otras enfermedades como la diabetes.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la abundancia de microARN en suero y plasma, también se puede aplicar a otras muestras, como células y tejidos periféricos. Una demostración visual de este protocolo es fundamental, ya que algunos de los pasos involucrados en el sellado del portaobjetos de la matriz de nanofluidos pueden ser difíciles de aprender simplemente leyendo el protocolo Para la detección de micro ARN maduro de PCR cuantitativa en tiempo real basada en sonda a 4,2 microlitros del reactivo QPCR individual se mezcla en cada pocillo de una placa óptica de 96 pocillos, seguido de 0,8 microlitros de la solución de reacción de ADNc recién preparada adecuada. Selle la placa con la cubierta óptica adecuada y, a continuación, inicie la QPCR en el sistema de PCR en tiempo real.

Para preparar una tarjeta de matriz de microfluídica con una entrada inicial de ARN de uno a 1000 nanogramos totales, primero descongele el tampón de cebadores del grupo A y B, los fosfatos de nucleótidos desoxi, el cloruro de magnesio y el inhibidor de ARN en hielo. Luego, para realizar la transcripción inversa, se colocan 100 nanogramos de cada muestra de ARN en un tubo del grupo A o del grupo B, seguido de la adición del volumen apropiado de agua libre de nucleasa para llevar el volumen total de cada tubo a tres microlitros. A continuación, mezcle 4,5 microlitros del reactivo de transcripción inversa adecuado en los tubos correspondientes adecuados.

A continuación, coloque las muestras en el termociclador e inicie la transcripción inversa. Mientras que la transcripción inversa está progresando. Para entradas de muestras de ARN total entre uno y 350 nanogramos, descongele el conjunto predefinido de cebadores de preamplificación en hielo cuando las muestras estén listas, alícuota 22,5 microlitros del reactivo de preamplificación adecuado.

Mezcle en los tubos del grupo A y del grupo B y agregue 2,5 microlitros de la muestra de CDNA transcrita inversa en cada uno. A continuación, cargue las muestras en el termociclador e inicie el ciclo de preamplificación. Al final del ciclo, agregue 75 microlitros de tampón de 0,1 x tris EDTA al CDNA preamplificado para cargar la tarjeta de microfluídica.

A continuación, agregue 450 microlitros de mezcla de reactivos QPCR a nueve microlitros del CDNA amplificado PREPL diluido para la tarjeta A, use el producto amplificado PREPL preparado con el cebador pool A y agregue 441 microlitros de agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 900 microlitros. Luego, una vez que alcance la temperatura ambiente, retire la tarjeta de matriz de baja densidad de tachuelas de su empaque y colóquela con el papel de aluminio hacia abajo en un área limpia. Añadir 100 microlitros de reacción PCR.

Mézclalo en cada uno de los ocho puertos de llenado de la tarjeta. Gire la tarjeta durante un minuto a 331 GS y temperatura ambiente. Luego, con un trazo lento, constante y uniforme, empuje el carro a través de la tarjeta hasta que llegue al punto final del sellador.

Retire la tarjeta de matriz sellada y corte los depósitos. A continuación, confirme que la tapa calefactada por bloque y el portador de muestras correctos estén instalados en el sistema de PCR en tiempo real de la matriz de microfluidos. Para cargar las matrices nano fluídicas, descongele el prepl diluido, el CDNA amplificado y el reactivo QPCR en tiempo real.

Mezcle y mezcle el frasco de reactivo QPCR girando. A continuación, añada 22,5 microlitros de mezcla de reactivos QPCR a 22,5 microlitros de CDNA amplificado y prepl diluido. A continuación, añada cinco microlitros de cada muestra en ocho pocillos de la placa de muestra de 384 pocillos del flujo de trabajo de la matriz de nanofluidos nanofluidos, teniendo cuidado de colocar el grupo A y el grupo B de cada muestra.

En bloques de ocho pocillos adyacentes, cuando se hayan transferido todas las muestras, cubra cada sección de la placa con piezas de sellador de placas de muestra de matriz abierta. A continuación, descongele el primer portaobjetos de la matriz de nanofluidos a temperatura ambiente después de aproximadamente 15 minutos. Confirmado que la tapa de edición de bloques y el portador de muestras correctos están instalados en el sistema de matriz de nano fluidos, y luego afloje el émbolo de la jeringa de fluido de inmersión con un tirón suave.

Retire la tapa, coloque la punta en su lugar y enjuague el aire de la punta. A continuación, coloque las puntas del sistema de carga dentro del sistema de carga. Abra la tapa y coloque la placa de muestra en el sistema de carga.

Ahora ponte un par de guantes ajustados. Abra con cuidado el empaque de la corredera e incline lentamente la corredera fuera del paquete sin tocar la parte superior. Coloque la corredera en el sistema de carga con el código de barras a la izquierda.

A continuación, retire el sellador de la parte de la placa de muestra destinada a la carga y utilice el software del sistema de carga para introducir la corredera, el código de barras, la posición de la corredera, la posición de la muestra y la configuración de la punta. Mientras se carga la guía, retire el plástico transparente y rojo de la parte inferior de la tapa de la guía. Luego, retire y selle con cuidado la corredera dentro de los 90 segundos posteriores al final del proceso de carga.

Coloque el portaobjetos dentro de la abrazadera de la placa y la tapa del portaobjetos en el portaobjetos durante 30 segundos confirmando que la tapa está colocada de manera que el código de barras se muestre correctamente. A continuación, coloque la jeringa de líquido de inmersión dentro del portaobjetos de modo que la punta presione contra la tapa y llene lentamente el portaobjetos con líquido de inmersión, teniendo cuidado de que el líquido corra a lo largo de la tapa. Una vez que la corredera esté llena, séllela con el tapón, girando el tornillo hasta que se rompa el mango.

Finalmente, retire la cubierta de plástico en la parte superior de la tapa del portaobjetos y coloque con cuidado el portaobjetos en el soporte del sistema de PCR en tiempo real. Tenga cuidado de sostener la parte inferior de la corredera a medida que se baja sin tocar la parte superior de la corredera. A continuación, inicialice el sistema de PCR e inicie el programa de PCR cuantitativa en el plazo de una hora tras la carga de las muestras.

Con este procedimiento, un volumen de reacción de cinco microlitros puede producir resultados similares a los que se obtienen con un volumen de 20 microlitros con una fuerte correlación. Hasta 39 ciclos aquí, se muestran gráficos de correlación y Altman insípidos para todos los 754 micro RN probados en la misma muestra utilizando tarjetas de matriz de microfluídica, ya que los microARN recién demostrados que tienen valores de CT entre cero y 19,99 en ambos senderos también exhiben expresiones similares con un coeficiente de determinación del 98%Además, el número de microARN con diferencias significativas observadas entre los ensayos aumenta cuando se seleccionan valores de CT entre 30 y 40. En este gráfico, se muestran los datos de la plataforma de la matriz de nanofluidics para los 754 microRNAs.

Es importante examinar las curvas de amplificación para asegurarse de que los resultados sean indicativos de una amplificación verdadera. Los microARN de limpieza, como el U seis, también deben examinarse para determinar la variabilidad. Por ejemplo, en este gráfico, se muestra una agrupación típica de U seis réplicas que muestran una desviación estándar baja, lo que indica la fiabilidad de los datos.

Finalmente, estos datos ilustran el aumento de la variabilidad de las réplicas de U six en una segunda muestra. Las tecnologías basadas en sondas de alto rendimiento, como las matrices de microfluídica y fluida Nana, ofrecen la facilidad de detectar de manera reproducible y eficiente la abundancia de múltiples microARN en un gran número de muestras en muy poco tiempo. Cada uno de los flujos de trabajo está diseñado para atender a diferentes rendimientos en función del número de objetivos de microARN y el número de muestras que se van a analizar.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar diferentes técnicas de PCR en tiempo real basadas en sondas para aumentar la abundancia de micro NA.