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El objetivo general de este procedimiento es registrar señales de calcio evocadas por estímulos luminosos en los fotorreceptores cónicos de la retina de ratón, utilizando un biosensor fluorescente. Esto se logra aislando la retina de una línea de ratón transgénico que expresa un sensor genéticamente codificado de calcio exclusivamente en los fotorreceptores cónicos. El segundo paso consiste en cortar secciones verticales del tejido retiniano.

A continuación, se montan los cortes retinianos sobre cubreobjetos y se colocan bajo un microscopio de dos fotones. El paso final consiste en registrar las señales de calcio procedentes de los terminales sinápticos individuales de los fotorreceptores cónicos en respuesta a la estimulación luminosa. En última instancia, las señales de calcio registradas se analizan fuera de línea.

Con este método, podemos registrar la actividad de muchos receptores de alimento simultáneamente con resolución subcelular. Esta es la principal ventaja frente a técnicas existentes, como las grabaciones eléctricas de una sola célula, que son más difíciles y requieren más tiempo. Por lo tanto, la pregunta que nos gustaría abordar es si y cómo el calcio está involucrado en la degeneración de los fotorreceptores.

Este método nos permite determinar si la entrada de calcio está provocando la degeneración de los fotorreceptores o si es un resultado del hecho de que la célula está muriendo. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades principalmente porque la sensibilidad a la luz de la retina debe conservarse semanalmente, y por lo tanto todos los pasos delicados, incluidas la disección de la retina y la preparación de cortes iónicos, deben realizarse bajo luz roja o verde. Para comenzar este procedimiento, transfiera un ojo de ratón a una placa de Petri que contenga una solución extracelular recién carbogenada y oxigenada.

Atraviese el globo ocular en cualquier punto del borde entre la córnea y la esclerótica con una aguja de inyección afilada. A continuación, sostenga el ojo por la esclerótica con un par de pinzas e inserte suavemente una hoja de tijera en el orificio. Corte a lo largo de la ora serrata para separar la parte anterior del ojo del vaso ocular.

A continuación, corte el vaso ocular radialmente en la posición de la marca de bolígrafo para indicar la posición dorsal en la retina. Luego, coloque el vaso ocular de manera que el corte dorsal quede orientado hacia afuera. Sujete la esclerótica en los lados izquierdo y derecho del vaso ocular insertando las puntas de la pinza entre la retina y la esclerótica.

Posteriormente, separe la retina invirtiendo suavemente la parte escleral del iica. Finalmente, corte el nervio óptico para liberar la retina de la esclerótica. Sujete el borde de la retina con un par de pinzas y retire suavemente los restos y el cuerpo vítreo de la superficie retiniana utilizando un segundo par de pinzas.

Cuando la superficie retiniana esté limpia, realice tres cortes radiales más cortos adicionales. Ahora sumerja lentamente una lámina de vidrio en la solución extracelular cerca del tejido. Tire suavemente de la retina hacia la lámina de vidrio con el lado de las células ganglionares hacia arriba, agarrando el borde para reducir el daño mecánico y el plegamiento del tejido.

A continuación, corte un rectángulo de aproximadamente un por dos milímetros de la región retiniana seleccionada utilizando una hoja de bisturí curva y elimine la solución excesiva alrededor del tejido. Luego, coloque la membrana de fibra de nitrocelulosa previamente preparada encima del fragmento de retina, de modo que el lado de las células ganglionares adhiera a la membrana. Inmediatamente, agregue una gota de medio extracelular sobre la membrana para fijar firmemente el tejido a ella.

Transfiera el tejido retinal montado en una membrana a la cámara de corte que contiene solución extracelular fresca. Luego, corte la retina en secciones verticales de 200 micrómetros de grosor. Utilizando un adhesivo para cortador de tejidos, fije un único corte montado en membrana a un cubreobjetos de vidrio preparado previamente con grasa de alto vacío.

Mantenga la superficie de vidrio debajo de la retina y libre de grasa. A continuación, agregue una gota de solución extracelular a cada laminilla con corte montado en la cámara de almacenamiento a temperatura ambiente. Introduzca carbógeno en la cámara mediante burbujeo en un pequeño reservorio de agua y mantenga la atmósfera en la cámara húmeda.

Deje que los cortes reposen en la cámara de almacenamiento durante 10 a 15 minutos antes de transferirlos uno por uno a la cámara de registro. Transfiera un corte desde la cámara de almacenamiento a la cámara de registro e inmediatamente comience a perfundirlo con una solución extracelular carbonatada. Mantenga un flujo de perfusión de dos mililitros por minuto y una temperatura de 37 grados Celsius.

En la cámara de registro. Utilice un objetivo de inmersión en agua de 20 x 0,95 NA y una cámara CCD en combinación con un LED infrarrojo ubicado debajo de la cámara de registro. Para localizar el corte retiniano, encienda el sistema de imagenología de dos fotones según lo indicado por el fabricante.

A continuación, encienda el láser y ajústelo a 860 nanómetros. Encienda los dos canales de detección para la obtención de imágenes de fluorescencia de ECFP y citrina. A continuación, utilizando el software de adquisición de imágenes, controle el microscopio de dos fotones para escanear y seleccionar una fila de terminales de conos para la grabación; configure la adquisición de imágenes en 128 por 16 píxeles o una configuración similar, y limite el área escaneada a los terminales de conos para evitar el blanqueo de los pigmentos fotosensibles en los segmentos externos.

Encienda el láser. Permita que los conos se adapten al láser de exploración y a la luz de fondo del estímulo durante 20 a 30 segundos antes de presentar los estímulos luminosos o aplicar agentes farmacológicos. Ahora inicie la presentación de los estímulos arbitrarios.

Los estímulos se generan modulando la intensidad de los dos LED a lo largo del tiempo, utilizando una placa microprocesadora controlada por un software personalizado. Luego, inicie la grabación simultánea de los dos canales de fluorescencia mediante el respectivo software de adquisición de imágenes. Las grabaciones se enfocaron en las terminaciones sinápticas de los fotorreceptores cónicos en cortes retinianos.

Este es un ejemplo de una región registrada con siete terminales individuales. Se registró la fluorescencia utilizando dos canales, uno para el citrino fre scepter y otro para el donador de FRET, ECFP. Se muestran aquí los cambios inducidos por la luz en la fluorescencia del citrino y del ECFP registrados en una única región de interés.

Y aquí se muestran las respuestas de calcio en un terminal de cono ante una serie de destellos luminosos brillantes de un segundo de duración con intervalos de cinco segundos. Esta figura muestra el análisis cuantitativo ejemplar de las respuestas de calcio en el cono inducidas por la luz. Y aquí se presentan las respuestas de calcio inducidas por la luz procedentes de un único terminal de cono.

Esta figura muestra la determinación de la respuesta media de calcio. El nivel de calcio en reposo representa la línea base antes de la estimulación luminosa, y el tamaño de la respuesta es ra, que corresponde al área entre el nivel de calcio en reposo y la amplitud máxima, así como entre la cinética del inicio y la finalización de la respuesta. Este procedimiento puede ampliarse aún más.

Por ejemplo, las señales de calcio en los fotorreceptores pueden ser importantes bajo diversas condiciones farmacológicas y de estimulación intensa para investigar, como la adaptación, o para estudiar en detalle diferentes pasos de la transducción fototransductiva. Esta técnica permite investigar la dinámica del calcio en los fotorreceptores cónicos bajo condiciones fisiológicas normales. Y esto es particularmente relevante para comprender la degeneración primaria y secundaria de los fotorreceptores cónicos en enfermedades humanas que causan ceguera, como la acrotopía o la retinitis pigmentosa.