Mejorado el análisis genético de Soltero biopartículas Humanos Recuperadas por simplificado Micromanipulación de Evidencia Forense 'Touch ADN'

El objetivo general de este procedimiento es recuperar células individuales o aglomeradas, denominadas biopartículas putativas, a partir de pruebas de ADN táctiles forenses y obtener un perfil de ADN del donante. Durante la comisión de un delito violento, un pequeño número de células se transfieren de un individuo a otro, como cuando un agresor agarra la muñeca de una víctima. Para recuperar primero el pequeño número de células, utilice una película de gel de baja adherencia unida a un portaobjetos de microscopio para tomar muestras de la zona de contacto.

El segundo paso es teñir las biopartículas transferidas para facilitar su visualización bajo el microscopio. A continuación, aísle las biopartículas de la película de gel mediante micromanipulación. Recoja el adhesivo soluble en agua en la punta de una aguja de tungsteno y utilícelo para eliminar las biopartículas de interés de la superficie de la película de gel.

El paso final es transferir cuidadosamente las biopartículas recolectadas individualmente a una mezcla de amplificación de PCR en la parte inferior de una colección de PCR para, en última instancia, se utilizan métodos de tipificación de ADN mejorados para obtener un perfil de ADN del donante de trazas de evidencia de ADN. Bien, en mi laboratorio, nos enfocamos en el análisis genético de las pequeñas cantidades de células que se transfieren durante la comisión de un crimen violento contra la persona entre un individuo y otro individuo, o entre un individuo y un objeto. Los métodos tradicionales a menudo no logran recuperar el perfil de ADN de un número tan pequeño de células.

Aquí hemos desarrollado un método simplificado para la recuperación física y el análisis genético de un número tan pequeño de células, ya sean células individuales o aglomerados de células que pueden incorporarse a cualquier laboratorio forense. La demostración del procedimiento estará a cargo de Katie Fairish, una estudiante de posgrado en mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare la película de gel que se utilizará para recolectar biopartículas.

Corte la película de gel al tamaño deseado apropiado para el portaobjetos de microscopio de vidrio que se utiliza como soporte sólido. Por ejemplo, para un portaobjetos de vidrio de tres pulgadas por una pulgada, use el tamaño de película de gel de dos pulgadas por 0.75 pulgadas. Retire el soporte blanco de la película de gel y fije la película de gel al portaobjetos del microscopio presionando firmemente hacia abajo para asegurar una fijación completa.

Tenga en cuenta que hay una capa protectora superior transparente que no debe quitarse para permitir que se aplique presión a lo largo de la pieza de película de gel sin contaminar la superficie de la película de gel. Los portaobjetos de película de gel preparados con la capa protectora adjunta se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta que se necesiten. Cuando esté listo para usar la película de gel, use pinzas estériles para quitar la capa protectora superior transparente. Coloque la superficie de la película de gel en contacto directo con un objeto o superficie tocada deseada.

Por ejemplo, la piel humana de la muñeca. Aplique una pequeña cantidad de presión para garantizar una transferencia eficiente de las biopartículas a la película de gel. No aplique demasiada presión porque el portaobjetos de vidrio podría romperse, se pueden recoger múltiples muestras del mismo objeto o superficie en el mismo trozo de película de gel. De la misma manera, las biopartículas se pueden recoger de objetos y prendas de vestir, como el cuello de una camisa.

Para confirmar la transferencia de biopartículas a la película de gel, examine el portaobjetos en un microscopio estereoscópico utilizando iluminación trans o epi. Un aumento de aproximadamente 20 x es mejor para ver áreas más grandes de la película de gel, mientras que un aumento de aproximadamente 200 x es mejor para ver biopartículas individuales. Guarde el portaobjetos de muestra de película de gel a temperatura ambiente en una caja de portaobjetos cubierta.

Hasta que estén listas para la tinción y/o la recolección de biopartículas, las biopartículas se pueden teñir para ayudar en la visualización. Para lograr esto, primero coloque el portaobjetos de muestra de película de gel preparado como se muestra anteriormente en una rejilla de tinción de portaobjetos sobre un fregadero. Con una pipeta de transferencia desechable, cubra toda la superficie de la película de gel con tinte azul trian e incube a temperatura ambiente durante uno o dos minutos.

Elimine el exceso de mancha inclinando el portaobjetos para permitir que la mancha se drene en el fregadero si es necesario. El portaobjetos se puede enjuagar mediante una suave inundación con agua estéril utilizando una pipeta de transferencia desechable. Después de que el portaobjetos se haya secado al aire, observe el portaobjetos con un microscopio estereoscópico para garantizar una tinción adecuada.

El portaobjetos teñido se puede almacenar a temperatura ambiente en una caja de portaobjetos cubierta. Comience este procedimiento colocando el número adecuado de tubos de PCR de 0,2 mililitros en una rejilla y etiquetando los tubos de forma adecuada. Prepare un volumen adecuado de mezcla de amplificación STR para el número deseado de muestras.

El vórtice y el maestro se mezclan bien y centrifugan brevemente en una ruta PI de mini centrífuga. 3,5 microlitros de amplificación. Mezcle en cada tubo de 0,2 mililitros con la tapa de cada tubo sin apretar.

Coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara directamente sobre un bloque de vidrio. Esto se utilizará para mantener el tubo de 0,2 mililitros en su lugar durante la recolección de la muestra. Coloque otro pedazo de cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio.

A continuación, coloque un trozo de cinta adhesiva ondulada soluble en agua encima de la cinta adhesiva de doble cara. Asegure la cinta en su posición aplicando presión a lo largo de la cinta. A continuación, se puede retirar la capa blanca superior protectora.

A continuación, coloque el primer tubo de 0,2 mililitros en la cinta adhesiva de doble cara sobre el bloque de vidrio. Deje este tubo a un lado hasta que se recoja la muestra. Coloque el portaobjetos de cinta soldado de onda soluble en agua debajo del microscopio mientras observa con un aumento bajo.

Utilice la punta de una aguja de soporte de lengua para raspar suavemente la superficie de la cinta con el fin de recoger la pequeña cantidad o bola de adhesivo en el extremo de la aguja. El tamaño de la bola de adhesivo dependerá de la cantidad de biopartículas que se recojan con cuidado. Retira las lenguas.

Coloque la aguja con adhesivo debajo del microscopio sin alterar la punta de la aguja. Coloque la aguja en una rejilla si es necesario. El aspecto más crítico del procedimiento es la recolección y transferencia de las biopartículas.

Para asegurar el éxito, las técnicas deben practicarse hasta que el analista sea competente en ellas. Coloque una muestra de película de gel previamente preparada en la platina del microscopio utilizando un bloque de vidrio para apoyar el portaobjetos. Ajuste el enfoque y la ampliación hasta que las partículas biológicas se puedan ver fácilmente.

Identifique las biopartículas que se recogerán. Recupere la aguja de tungsteno con la bola adhesiva y coloque la aguja sobre la superficie de la película de gel donde se encuentran las biopartículas de interés. Presione la punta de la aguja hacia abajo para que esté en contacto con la biopartícula.

Levante la aguja para asegurarse de que se haya recogido la biopartícula. Repita este proceso hasta que se haya recolectado la cantidad deseada de biopartículas. Coloque un tubo de PCR de 0,2 mililitros preparado en la platina del microscopio.

Ajuste el aumento para que la parte inferior del tubo que contiene la mezcla de amplificación esté enfocada. Mientras observa a través del microscopio, inserte con cuidado la aguja de tungsteno en el tubo de PCR de 0,2 mililitros hasta que la punta de la aguja esté en la mezcla de amplificación. Sostenga la aguja en la mezcla de amplificación hasta que el adhesivo se disuelva y se observe la liberación de biopartículas en la solución.

Retire la aguja. Coloque el tubo de 0,2 mililitros en posición vertical y tápalo sin apretar. Limpie la aguja de tungsteno con una toallita con alcohol previamente humedecida y repita este procedimiento de recolección para obtener muestras adicionales.

Para comenzar el protocolo de amplificación mejorado para el perfil STR autosómico de las biopartículas recolectadas, agregue 1,5 microlitros de tampón de lisis a cada tubo de 0,2 mililitros que contenga la mezcla de amplificación y las biopartículas cerrarán herméticamente las tapas de los tubos. Coloque las muestras en el termociclador y amplifique las muestras utilizando las condiciones de ciclo descritas en el texto del protocolo cuando se complete la amplificación. Almacene los productos de amplificación a cuatro grados centígrados hasta que estén listos para su detección por electroforesis capilar.

No se muestran imágenes representativas de partículas biológicas individuales en una muestra de cuello de camisa. Las biopartículas recolectadas están encerradas en un círculo. Los círculos rojos indican que se ha recuperado un perfil.

Se incluye el porcentaje de recuperación de alelos. Los círculos negros indican que no se ha recuperado un perfil. De manera similar, estas imágenes son de biopartículas agrupadas en una muestra de cuello de camisa, aquí se muestra el perfil STR obtenido de una de las muestras individuales de biopartículas del cuello de camisa.

Su precisión se determinó mediante la comparación con un perfil de referencia. Los números alélicos se designan debajo de cada pico en cada locus. El eje x representa el tamaño del fragmento y el eje Y representa la intensidad de la señal.

Este perfil es de alta calidad, con alturas de pico inter locus razonablemente equilibradas y sin caída alélica. El siguiente perfil es un perfil STR completo obtenido a partir de una de las muestras de biopartículas agrupadas del cuello de la camisa. Por último, esta figura muestra un ejemplo de perfil de ADN fallido de una sola biopartícula con una recuperación de alelos del 3%.

Este método debería promover la recuperación de perfiles de ADN de una sola fuente de los agresores en casos de agresión física. No ha escapado a nuestra atención que este método también elimina algunos de los problemas asociados con la interpretación y deconvolución de perfiles de ADN mixtos.