Name: La infección bacteriana sistémica y Defensa Inmune fenotipos en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprende a inducir infecciones bacterianas sistémicas en Drosophila melanogaster mediante nano inyección o pin septicémico. Este protocolo permite cuantificar la carga bacteriana y la respuesta inmune innata del huésped.

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Nos gustaría agradecer a todo el laboratorio de Lazzaro, y especialmente a Susan Rottschaefer, por su ayuda tanto en la revisión como en la prueba de estos protocolos. Esto es producto de su experiencia acumulada. El trabajo en el laboratorio de Lazzaro está respaldado por las subvenciones R01 AI083932 y R01 AI064950 de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos.

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Ninguno de los autores tiene intereses contrapuestos o intereses contrapuestos.

El procedimiento descrito aquí produce infección rigurosa y de alta calidad de Drosophila melanogaster. Los ejemplos ilustrados se centraron principalmente en la infección con Providencia rettgeri y E. coli, pero el protocolo es altamente adaptable y se puede aplicar a las infecciones con diversas bacterias sobre un rango de condiciones de cría de acogida y de mantenimiento. Los detalles de un enfoque experimental óptima dependerá de la bacteria utilizada para la infección, el genotipo del huésped, y las condiciones experimentales generales. Se recomienda encarecidamente a prueba piloto nuevas condiciones experimentales antes de iniciar los proyectos más ambiciosos. Un buen punto de partida es poner a prueba tres dosis de infección en un rango de 100 veces. Altamente patógenos virulentos son a menudo mejor introdujeron en dosis infecciosas muy bajas, del orden de 10 a 100 células bacterianas por mosca. Patógenos más moderadas pueden ser inyectados con dosis más altas de alrededor de 1.000 bacterias por fly, y los no patógenos pueden ser inyectados con dosis de hasta 10.000 bacterias por mosca. A menudo es instructiva para definir la cinética de nuevas infecciones por el seguimiento de la carga de patógenos, la mortalidad de acogida, y la actividad del sistema inmune a través de una serie de tiempo longitudinal. Dado que la medición de la carga de patógenos y la expresión génica de acogida son ensayos destructivos, es necesario para infectar las moscas distintas desde el principio del experimento para cada punto de tiempo que se va a medir. Al decidir si utilizar pinchazo o inyección a base de microcapilar, es importante tener en cuenta que hay ventajas y limitaciones de cada enfoque. Inyección capilar introduce un volumen de líquido en la marcha, que tanto aumenta la presión de turgencia y modestamente introduce sales u otras moléculas que están suspendidos o disueltos en el vehículo. Inyección capilar también requiere el acceso a un centro de inyección o compra de los equipos necesarios. Pinchazo séptico no requiere equipo e introduce especialmedios insignificantes en la marcha, y es típicamente más eficiente para infectar a un gran número de moscas. Sin embargo, las infecciones pinchazo no permiten el control preciso sobre dosis de infección que se puede lograr con la inyección capilar. El presente protocolo se centró en un aparato de inyección que regula mecánicamente volumen de inyección, pero también hay sistemas de inyección basado en pulsos discretos de aire a presión. 20,21 Estos son típicamente más caros que el aparato ofrece aquí y requieren de calibración del impulso de aire a cada aguja con el fin de asegurar volúmenes de inyección consistentes. Existe un considerable debate, pero muy pocos datos sobre cómo las moscas se convierten sistémicamente infectado con bacterias en el medio silvestre. Algunos investigadores postulan que la mayoría de las infecciones naturales se producen cuando Drosophila ingerir bacterias patógenas y las bacterias son capaces de escapar posteriormente el intestino para establecer una infección sistémica. Sin embargo, hay muy Febacterias w sabe que son capaces de atravesar el intestino de D. melanogaster, y los que sí tienen esta capacidad son altamente letal para las moscas 22,23. Una teoría alternativa es que vuela regularmente sufrir lesiones cuticulares través de escapar de los intentos fallidos de depredación o ataque de ácaros ectoparásitos. Esta hipótesis está apoyada por la recogida frecuente de salvaje D. melanogaster teniendo manchas melanization que son indicativos de heridas cicatrizadas (observaciones no publicadas). Los ácaros se han demostrado para transmitir infecciones bacterianas en Drosophila y 24 heridas dejadas por los ácaros pueden ser secundariamente infectadas por bacterias en las abejas de miel 25. Sin embargo, la frecuencia en la naturaleza de la infección-ácaros impulsado o de otra manera oportunista de D. melanogaster través de las infracciones de la cutícula no se conoce. El protocolo descrito aquí permite la introducción de bacterias directamente en la hemolinfa través de la inyección cuantitativa que evita cualquier barreras epiteliales o Immu de comportamientonidad. Métodos para la alimentación de las bacterias patógenas a D. melanogaster han sido descritos en Vodovar et al. 22 y Nehme et al. 23. Muchas bacterias entomopatógenos representan poco o ningún riesgo para la salud humana, lo que permite a los investigadores a trabajar con ellos cómodamente. Además, muy pocas bacterias tienen la capacidad de infectar a Drosophila en contacto sin intervención experimental, por lo que el riesgo de &quot;epidemia&quot; propagación de la infección bacteriana a través de un laboratorio a través de superficies contaminadas o escaparon moscas es generalmente muy baja. No obstante, es recomendable asegurarse de que las medidas de contención adecuadas en el lugar para evitar que las moscas infectadas se escape y para recuperar cualquier moscas escaparon. El laboratorio debe ser equipado a un nivel de seguridad biológica en consonancia con la de los agentes patógenos que se utiliza, y se debe emplear las mejores prácticas estándar en microbiología. El infecti experimentalen el método descrito aquí permite infecciones de Drosophila melanogaster con cualquier dosis de cualquier bacteria arbitraria. Una vez que la infección se ha establecido, es sencillo para medir la cinética de proliferación o la eliminación de bacterias, el seguimiento de la mortalidad acogida, y para ensayo de inducción del sistema inmune del huésped. Moscas infectadas pueden ser fácilmente sometidos a otros ensayos fenotípicos, incluyendo pruebas de funciones fisiológicas que pueden dar forma o se forma por la infección. Los procedimientos descritos son de bajo costo, requieren relativamente poco equipo especializado, y se aprenden fácilmente, haciéndolos susceptibles para su uso en diversos proyectos a través de una amplitud de laboratorios de investigación y docencia.

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es uno de los organismos modelo de primera clase para el estudio de la función y la evolución de la defensa inmune. Drosophila son baratos y fáciles de criar, son altamente susceptibles a la manipulación experimental, y están respaldados por una amplia comunidad científica que ha desarrollado una amplia variedad de herramientas de investigación. Muchos aspectos de la inmunidad innata se conservan entre los insectos y mamíferos, incluyendo la transducción de señales mediada por los receptores Toll-like y NF-kB factores de transcripción de la familia, de señalización JAK / STAT, y las respuestas de la vía JNK. 1,2 La función de estos genes y vías lata ser consultados en el D. melanogaster mediante mutaciones o RNAi caídas que aumentan o vía disminución actividades. 3 - 6 Además, Drosophila se puede utilizar para estudiar las consecuencias fisiológicas de la infección y la enfermedad, incluso en el contexto de la teoría evolutiva historia de vida 7.- 9 Todos estos estudios, sin embargo, dependen de la capacidad de infectar de forma fiable moscas experimentales bajo condiciones de tratamiento definidos. El procedimiento descrito aquí presenta un marco metodológico para la entrega de infecciones bacterianas robustos y repetibles a Drosophila melanogaster y posteriormente medir la gravedad de la infección y la cuantificación de la respuesta inmune del huésped. Drosophila puede ser natural y experimentalmente infectado por una amplia variedad de parásitos y agentes patógenos, incluyendo bacterias, hongos, virus, nematodos y avispas parasitoides. El protocolo actual se centra en la entrega de la infección bacteriana sistémica. Muchas bacterias diferentes se pueden utilizar para infectar las moscas, y la elección del experimentador deben basarse en las cuestiones científicas precisas que nos pidieron. Por ejemplo, los aislados clínicos humanos se pueden emplear para estudiar los mecanismos de virulencia bacteriana 10, o ecológicamente cepas pertinentes pueden ser preferred para el estudio de la evolución. 11 Algunas bacterias son patógenos competentes de D. melanogaster, la proliferación tras la infección y causar la enfermedad de host o la muerte. Otras bacterias se administran eficazmente por el sistema inmune del huésped y borran dentro de unos pocos días. En esta demostración, Providencia rettgeri será utilizado como un patógeno proliferativa que puede causar la mortalidad de acogida y persiste en huéspedes supervivientes. Escherichia coli se utilizará como un no patógeno que se elimina por el sistema inmune del huésped. La infección se estableció mediante la introducción de bacterias directamente en la cavidad del cuerpo de la mosca. Este enfoque evita las barreras epiteliales y comportamientos de protección, lo que permite la investigación de la infección sistémica con independencia del modo natural de transmisión. Hay dos métodos principales para establecer experimentalmente la infección sistémica. En el primero, un nanoinjector y capilares de vidrio tirado agujas se utilizan para inyectar un número preciso debacterias en la marcha. Este método tiene las ventajas de permitir un gran rango dinámico de dosis de infección y de ser cuantitativamente altamente repetible. El segundo enfoque es entregar la infección con un pinchazo séptico. Este enfoque tiene las ventajas de ser rápido y no requiere equipo especial. Una vez establecidas las infecciones, se hace posible medir la carga sistémica patógeno, la mortalidad de acogida, y la actividad inducible sistema inmunológico. Por supuesto, cualquier número de fenotipos adicionales posiblemente podría medirse en D. infectada melanogaster, incluyendo post-infección fecundidad 12, la capacidad de aprendizaje 13, estado metabólico 14, o prácticamente cualquier otro rasgo que se puede imaginar.

<table><tbody><tr><td>Incubadora</td><td>Powers Scientific, Inc</td><td>DROS52SD</td><td></td></tr><tr><td>Pincel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Flypads</td><td>FlyStuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD FG50</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de cría de Drosophila&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Botellas de fondo cuadrado de 6 oz, polipropileno</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Bolas de algodón extra grandes y naestériles</td><td>de la marca Fisher 22-456-882</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Vials de poliestireno</td><td>VWR international</td><td>89092-720</td><td></td></tr><tr><td>Bolas</td> <td>de algodón grandes y naricesFisher brand</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de 2 L</td><td>VWR international</td><td>89000-370</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri con Tapas Transparentes, Cresta Elevada; 100 x 15 mm;</td><td>VWR international</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Innoculing Loop</td><td>VWR international</td><td>80094-488</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Clasic Pipetas en varios tamaños 0.1 y micro; l a 2 y micro; l, 2 y micro; l a 20 &micro; l, 20 y micro; l a 200 y micro; l, 100 y micro; l a 1.000 y micro; l</td><td>Rainin</td><td>PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de micropipeta (tamaños variados)</td><td>VWR international</td><td>30128-376 53503-810 16466-008</td><td></td>Base de</tr><tr><td>caldo Luria, Miller</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo desechables Vidrio de borosilicato</td><td>VWR international</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>S-500 Orbital Agitador</td><td>VWR international</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>VWR international</td><td>37001-300</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 10X</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Espectrofotómetro</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas semimicrovolumen</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>Extractor capilar vertical</td><td>Aguja Kopf Extractor</td><td></td><td></td>de pipetas</tr><tr><td>3.5'' Capilares de vidrio de repuesto para Nanojet II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Mineral, Blanco, Claro</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>6358-10</td><td></td></tr><tr><td>Pines Minutein</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml&nbsp; Tubos de microcentrífuga; Rito de sello</td><td>USA Scientific Inc.</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Maja motorizada; Agitador de laboratorio</td><td>Talboys Troemner</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>Talboys Homogeneizador de alto rendimiento</td><td>OPS Diagnostics</td><td>930145</td><td></td></tr><tr><td>bolas de molienda de 5/32 ''</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 156-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>Scientific indurstries inc.</td>Pipeta multicanal <td>G560</td><td></td></tr><tr><td>(10 &mu; l - 300 &mu; l)</td> <td>Sartorius</td><td>730360</td><td></td></tr><tr><td>WASP2 Whitley Automated Spiral Plater</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProtoCOL contador de colonias automatizado / contador de placas / lector de placas &nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>tubos de qPCR; Tiras de 8 tubos de 0,2 ml de perfil bajo</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>tapones de qPCR; Tiras ópticas planas de 8 tapones</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNasa libre de RNasa</td><td>Promega</td><td>m610a</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Transcriptasa inversa</td><td>Promega</td><td>m170b</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1240</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5260</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Sistema de detección de PCR en tiempo real</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5200</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Inhibidor de la ribonucleasa</td><td>Promega</td><td>N2115</td><td></td></tr></tbody></table>

la infección bacteriana sistémica y defensa inmune fenotipos en<em&gt; drosophila melanogaster</em

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es uno de los organismos modelo de primera clase para el estudio de la función y la evolución de la defensa inmune. Muchos aspectos de la inmunidad innata se conservan entre insectos y mamíferos, y desde Drosophila puede ser fácilmente manipulado genéticamente y experimentalmente, que son de gran alcance para el estudio de la función del sistema inmune y las consecuencias fisiológicas de la enfermedad. El procedimiento ha demostrado aquí permite la infección de las moscas por la introducción de bacterias directamente en la cavidad del cuerpo, por encima de las barreras epiteliales y formas más pasivas de defensa y permitiendo enfoque en la infección sistémica. El procedimiento incluye protocolos para las tasas de mortalidad de medición anfitrión, la carga de patógenos sistémica, y el grado de inducción del sistema inmune del huésped. Este procedimiento de infección es barato, robusto y cuantitativamente repetible, y se puede utilizar en estudios de genética funcional, la historia evolutiva, la vida y la fisiología.

Esta sección ilustra los resultados que se pueden obtener después de la infección bacteriana de Drosophila melanogaster. Figura 1 muestra que dosis de infección varía con la densidad óptica de la suspensión bacteriana utilizada para la inyección, y que la dosis administrada puede ser estimado de manera fiable por homogeneización y el chapado vuela inmediatamente después de la inyección . Como se ilustra en la Figura 2, diferentes patógenos pueden causar diferentes niveles de mortalidad host (Figura 2A) y la mortalidad huésped puede ser (Figura 2B) dependiente de la dosis. Es importante destacar que este protocolo permite diferentes tipos de infecciones que deben alcanzarse: Providencia rettgeri puede causar una infección crónica, subletal que persiste durante 20 días o más (Figura 3A). Sin embargo, otras bacterias como Escerichia coli mayormente se borrarán por la mosca de acogida dentro de seis horas después de la infección (Figura 3B). La inducción de los sys inmunesTEM se puede estimar a través de aislamiento de ARN y posterior qRT-PCR de los transcritos de péptidos antibacterianos (Figura 4A y B). Análogamente pero menos cuantitativamente, las moscas que expresan GFP bajo el control de promotores de genes de péptido antimicrobiano puede ser utilizado para visualizar la inducción del sistema inmune (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> . Figura 1: Determinación de la dosis infecciosa Las moscas fueron inyectados con 50 nl de suspensiones bacterianas que cubren una gama de densidades ópticas (0,0001 a 0,05). Las moscas fueron inmediatamente homogeneizada y se sembraron para determinar el número de bacterias introducido por la inyección. Carga bacteriana inicial se correlaciona fuertemente con OD inicial inyectada (r 2 = 0,96) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2:. supervivencia después de la inyección con patógenos bacterianos Cinco a siete machos viejos día se inyectaron con 50 nl de cualquiera de suspensión bacteriana o medios estériles y se controló para la supervivencia. (A) Tipo de moscas salvajes fueron inyectados con aproximadamente 5.000 bacterias de de una de las tres especies diferentes. La tasa de mortalidad huésped depende en gran medida de las especies bacterianas usadas para la infección. (B) Tipo moscas salvajes fueron inyectados con tres dosis diferentes de Enterococcous faecalis - 50, 500, y 5000 bacterias por mosca. Las moscas mueren más rápidamente cuando se infectan con dosis más altas infecciosas (C) Un mutante sistema inmune y su línea de control isogénicas de tipo salvaje fueron inyectados con aproximadamente 500 Burkholderia cepacia. Una comparación por parejas Log-Rank muestra que la mosca de tipo salvaje sobrevive a la infección significativamente mejor que el mutante (χ 2 = 59,02, df = 1, p &lt;0,0001). Figura 3:. Carga bacteriana después de la inyección Las moscas fueron inyectados con aproximadamente (A) 5000 P. rettgeri (B) 3400 E. coli. La carga bacteriana se determinó inmediatamente después de la inyección y en varios puntos de tiempo posteriores. Cada punto de datos representa la carga bacteriana de una sola mosca. E. coli se elimina rápidamente de anfitriones impugnados mientras que P. rettgeri persiste durante el resto de la vida del anfitrión ,. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> Figura 4: Inducción de la expresión génica inmune después de la inyección. Las moscas (A) se inyectaron con 50 nl de P. PBS rettgeri o estéril, ya sea en el abdomen o el tórax, o se dejaron sin manipular aparte de CO <sub&gt; 2 anestesia. Seis horas después de la infección, las moscas fueron recolectados para el aislamiento de ARN y la expresión de la Diptericin Un gen se determinó utilizando qRT-PCR. (A) Los niveles de expresión se representan gráficamente como la relación de Diptericin Una transcripción de transcripción rp49 y ampliarse de manera que el control de CO 2 se define como tener un nivel de expresión de 1. Las barras representan la media y el error estándar de las proporciones de cada condición (n = 4). Niveles (B) de expresión se grafican como ΔΔCT 2 con el valor promedio de C T de CO 2 de control de moscas aesthesia utilizados como la condición no inducido estándar. Las barras representan el error medio y estándar de ΔΔC T de cada condición (n = 4). Mientras que no hay diferencia en la inducción de la transcripción debido a sitio de la inyección, la comparación de los paneles A y B muestra cómo el método ΔΔC T potencialmente puede sobreestimar los niveles de inducción. (C) Moscas que expresan GFP bajo el control del Diptericin Un promotor se inyectaron con 50 nl de P. rettgeri (OD = 0,1) y luego fotografiada 7 días más tarde. El panel de GFP muestra la expresión de GFP en el cuerpo la grasa abdominal de moscas infectadas, lo que indica la activación de la Diptericin Un promotor en las moscas infectadas por bacterias, pero no los controles con inyección de medios de comunicación. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gene </td><td> Adelante </td><td> Reverse </td></tr><tr><td> rp49 (también llamado RPL32) </td><td> 5 &#39;AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3&#39; </td><td> 5 &#39;GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3&#39; </td></tr><tr><td> Diptericin A </td><td> 5 &#39;GCGGCGATGGTTTTGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;CGCTGGTCCACACCTTCTG 3&#39; </td></tr><tr><td> Drosomycin </td><td> 5 &#39;CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3 &#39; </td><td> 5 &#39;TCCCTCCTCCTTGCACACA 3&#39; </td></tr><tr><td> Defensina </td><td> 5 &#39;GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3&#39; </td><td> 5 &#39;TCGCTTCTGGCGGCTATG 3&#39; </td></tr><tr><td> Attacin A </td><td> 5 &#39;CGTTTGGATCTGACCAAGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Metchnikowan </td><td> 5 &#39;AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3&#39; </td><td> 5 &#39;ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Los cebadores para QRT-PCR.

Drosophila melanogaster es un organismo modelo excepcional para estudiar el sistema inmune innato y las consecuencias fisiológicas de la infección y la enfermedad. Este protocolo describe cómo administrar infecciones bacterianas robustas y cuantitativamente repetibles a D. melanogaster, y cómo medir posteriormente la gravedad de la infección y cuantificar la respuesta inmunitaria del huésped.

La infección bacteriana sistémica y Defensa Inmune fenotipos en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

El objetivo general de este procedimiento es administrar infecciones bacterianas robustas y repetibles a drosophila, melanogaster, y luego medir la gravedad de la infección y cuantificar la respuesta inmunitaria del huésped. Esto se logra administrando primero la infección bacteriana en las moscas usando un nano inyector. La post-mortalidad se puede rastrear después de la infección a lo largo del tiempo, y la carga bacteriana sistémica se puede determinar en cualquier punto homogeneizando las moscas infectadas y midiendo el número de bacterias presentes.La defensa inmunitaria del huésped también se puede cuantificar midiendo el nivel de expresión de los genes de péptidos antibacterianos y, en última instancia, cuantificando y caracterizando la infección bacteriana. En drosophila, melanogaster se puede utilizar para probar cómo los factores genéticos y ambientales alteran la competencia inmunitaria de la mosca. Este método se puede utilizar para abordar cuestiones clave en el campo de la inmunidad de los insectos, como por ejemplo cómo influyen los factores genéticos y ambientales del huésped en la capacidad inmunitaria o cómo varían las distintas bacterias en su cinética de infección. Aunque estamos utilizando este método para medir la defensa inmunitaria de Drosophila melanogaster contra la infección bacteriana, también se puede aplicar a otros insectos y puede hacer uso de otros tipos de patógenos como virus u hongos.Un problema común que experimentan las personas cuando aprenden este método por primera vez es que pueden causar demasiadas lesiones a las moscas, lo que puede resultar en una mortalidad excesivamente alta, incluso en los controles. La demostración visual de este método es fundamental para aprender a hacer la infección con un daño mínimo a la mosca. Dado que nuestra especie huésped oph melanogaster es tan pequeña, la infección debe realizarse bajo el microscopio, lo que aumenta la complejidad inicial de la técnica.Sin embargo, creemos que una pequeña demostración de la técnica la hará accesible incluso para los científicos que tienen una experiencia limitada con moscas. Para comenzar el experimento, seleccione una sola colonia de una placa maestra previamente preparada e inocule un matraz de medio estéril. Cultive las bacterias durante la noche a 37 grados centígrados hasta la fase estacionaria.Una vez que el cultivo haya alcanzado la fase estacionaria, granule suavemente las células de 600 microlitros del cultivo en una centrífuga de mesa durante tres minutos a 5.000 veces. G, luego descarte el Rena y el Resus. Suspender las bacterias en 1000 microlitros de solución salina estéril tamponada con fosfato o PBS.A continuación, diluya las células resuspendidas en PBS estéril para lograr la absorbancia deseada de 600 nanómetros y use esta suspensión para infectar las moscas. Prepare una aguja de vidrio tirando de un capilar de vidrio de silicato prestado y use pinzas para romper la punta de la aguja para crear una abertura de 50 micrómetros de diámetro. A continuación, coloque la junta tórica del techo y el espaciador blanco con el hoyuelo grande hacia afuera sobre el émbolo metálico del inyector.Llene la aguja de vidrio con aceite mineral usando una jeringa con una aguja de calibre 30. A continuación, coloque la aguja de vidrio llena a través de la boquilla y coloque la junta tórica más grande alrededor de su base a un milímetro del extremo romo de la aguja. Deslice la aguja sobre el émbolo de metal y atornille suavemente la pinza hasta que quede segura.Disipe el aceite mineral del inyector, dejando un pequeño volumen de aceite en la aguja para que actúe como una barrera entre el inyector y la suspensión bacteriana. Asegúrese de que no haya burbujas de aire dentro del aceite mineral, la suspensión bacteriana o entre los dos líquidos. A continuación, ajuste el inyector al volumen deseado para la inyección.Inserte con cuidado la punta de la aguja capilar en un tubo de PBS estéril y presione el botón de llenado en el inyector para llenar la aguja del inyector y generar controles de heridas. Inyecte a las moscas anestesiadas PBS estéril en la parte anterior del abdomen en la superficie lateral ventral, coloque las moscas inyectadas en viales nuevos con medios nuevos y coloque los viales de lado para evitar que las moscas se peguen a la comida antes de que se recuperen de la anestesia. A continuación, expulse los medios estériles restantes del inyector y vuelva a llenar la misma aguja con la suspensión bacteriana.Repita el procedimiento e inyecte a las moscas con la suspensión bacteriana. Alternativamente, la infección puede transmitirse mediante un pinchazo séptico. Para preparar el pin infeccioso, derrita el extremo de la punta de una micropipeta de 200 microlitros e inserte un alfiler de insecto mnuchin de 0,15 milímetros en el plástico fundido.Deje que el plástico se solidifique para que el alfiler se mantenga en su lugar con 0,5 centímetros de alfiler que se extienda desde el plástico, anestesiar las moscas con dióxido de carbono y pinchar las moscas en la placa pleural esternal del tórax con la aguja, evitando los sitios de unión de las alas y las patas. Retira las moscas del alfiler de las minucias con pinzas blandas. Asegúrate de sumergir el alfiler en la suspensión bacteriana entre pinchar cada mosca.Coloque las moscas pinchadas en un frasco nuevo con medio nuevo para moscas, colocando el frasco de lado hasta que todas las moscas se hayan recuperado de la anestesia. Coloque un subconjunto de las moscas infectadas en tubos de microcentrífuga individuales sobre hielo. Agregue 250 microlitros de PBS a cada tubo y use un mortero para homogeneizar las moscas.A continuación, coloque el homogeneizado en una aireación LB utilizando un platillo en espiral. Alternativamente, para colocar el homogeneizado en placa por dilución en serie. Transfiera cada mosca homogeneizada a la primera fila de un 96.Cubra y llene cada pocillo de las filas restantes con 90 microlitros de PBS utilizando una pipeta multicanal. Tome 10 microlitros de la primera fila que contenga homogeneizado de mosca y dispense el homogeneizado en la segunda fila. Cásalo hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces para mezclar bien el homogeneizado.Luego tome 10 microlitros del homogeneizado y transfiéralo a la siguiente fila. Repita este procedimiento utilizando las filas restantes, empezando por la fila inferior. Utilice la pipeta multicanal para tomar 10 microlitros de cada pocillo y depositarlo en una placa LB.Asegúrese de que las muestras se dispensen como puntos discretos que no se toquen entre sí. Repita este paso hasta que se hayan tomado muestras de todos los pocillos de cada fila, dispensándolos en orden descendente de dilución en la placa LB. Cualquiera que sea el método de siembra que se utilice, tenga cuidado de no crecer demasiado para que las colonias permanezcan pequeñas y discretas.Retire la placa de la incubadora. Una vez que las bacterias experimentales han desarrollado colonias visibles, pero antes de que las colonias de la drosophila, la microbiota intestinal se hace visible aproximadamente 24 horas después en forma de placas espirales. Cuente las colonias que crecen utilizando un contador de colonias automatizado que puede estimar la carga bacteriana por mililitro de homogeneizado en función del número y la posición de las colonias en el plato.En el caso de las placas puntuales, cuente manualmente las colonias de cada mosca de la dilución que contenga de 30 a 300 colonias y calcule el número de bacterias por mililitro de homogeneizado original. A las moscas se les inyectaron 50 nanolitros de suspensiones bacterianas que cubrían un rango de densidades ópticas e inmediatamente homogeneizadas y platicadas, la dosis de infección varía con la densidad óptica de la suspensión bacteriana utilizada para la inyección. Las cargas bacterianas iniciales se correlacionan fuertemente con la OD inicial inyectada.Este protocolo permite la observación de diferentes tipos de infecciones. Las moscas fueron infectadas con providencia rei, que puede causar una infección crónica subletal que persiste durante 20 días o más. Las moscas infectadas con coli eliminarán la infección en seis horas. Post-infección.La inducción del sistema inmune se puede estimar a través del aislamiento de ARN y la posterior Q rtpcr R de la transcripción del péptido antibacteriano de manera análoga, pero menos cuantitativamente moscas que expresan GFP bajo el control del péptido antimicrobiano. Los promotores de genes se pueden utilizar para visualizar la inducción del sistema inmunitario una vez dominados. Esta técnica puede permitir la infección de cientos de moscas por hora.Es concebible que se pueda medir cualquier número de fenotipos en las moscas después de que se infecten, incluida la capacidad de aprendizaje, el estado metabólico o prácticamente cualquier otro rasgo que se pueda imaginar. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo administrar infecciones bacterianas sólidas y repetibles a drosophila, melanogaster, y cómo medir posteriormente la gravedad de la infección y cuantificar la respuesta inmunitaria del huésped. No olvide que ciertas bacterias pueden representar riesgos para la salud humana.Asegúrese de que se sigan los procedimientos de bioseguridad adecuados y de que se implementen las medidas de contención adecuadas para evitar que las moscas infectadas escapen. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.

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