La infección bacteriana sistémica y Defensa Inmune fenotipos en

El objetivo general de este procedimiento es administrar infecciones bacterianas robustas y repetibles a drosophila, melanogaster, y luego medir la gravedad de la infección y cuantificar la respuesta inmunitaria del huésped. Esto se logra administrando primero la infección bacteriana en las moscas usando un nano inyector. La post-mortalidad se puede rastrear después de la infección a lo largo del tiempo, y la carga bacteriana sistémica se puede determinar en cualquier punto homogeneizando las moscas infectadas y midiendo el número de bacterias presentes.

La defensa inmunitaria del huésped también se puede cuantificar midiendo el nivel de expresión de los genes de péptidos antibacterianos y, en última instancia, cuantificando y caracterizando la infección bacteriana. En drosophila, melanogaster se puede utilizar para probar cómo los factores genéticos y ambientales alteran la competencia inmunitaria de la mosca. Este método se puede utilizar para abordar cuestiones clave en el campo de la inmunidad de los insectos, como por ejemplo cómo influyen los factores genéticos y ambientales del huésped en la capacidad inmunitaria o cómo varían las distintas bacterias en su cinética de infección. Aunque estamos utilizando este método para medir la defensa inmunitaria de Drosophila melanogaster contra la infección bacteriana, también se puede aplicar a otros insectos y puede hacer uso de otros tipos de patógenos como virus u hongos.

Un problema común que experimentan las personas cuando aprenden este método por primera vez es que pueden causar demasiadas lesiones a las moscas, lo que puede resultar en una mortalidad excesivamente alta, incluso en los controles. La demostración visual de este método es fundamental para aprender a hacer la infección con un daño mínimo a la mosca. Dado que nuestra especie huésped oph melanogaster es tan pequeña, la infección debe realizarse bajo el microscopio, lo que aumenta la complejidad inicial de la técnica.

Sin embargo, creemos que una pequeña demostración de la técnica la hará accesible incluso para los científicos que tienen una experiencia limitada con moscas. Para comenzar el experimento, seleccione una sola colonia de una placa maestra previamente preparada e inocule un matraz de medio estéril. Cultive las bacterias durante la noche a 37 grados centígrados hasta la fase estacionaria.

Una vez que el cultivo haya alcanzado la fase estacionaria, granule suavemente las células de 600 microlitros del cultivo en una centrífuga de mesa durante tres minutos a 5.000 veces. G, luego descarte el Rena y el Resus. Suspender las bacterias en 1000 microlitros de solución salina estéril tamponada con fosfato o PBS.

A continuación, diluya las células resuspendidas en PBS estéril para lograr la absorbancia deseada de 600 nanómetros y use esta suspensión para infectar las moscas. Prepare una aguja de vidrio tirando de un capilar de vidrio de silicato prestado y use pinzas para romper la punta de la aguja para crear una abertura de 50 micrómetros de diámetro. A continuación, coloque la junta tórica del techo y el espaciador blanco con el hoyuelo grande hacia afuera sobre el émbolo metálico del inyector.

Llene la aguja de vidrio con aceite mineral usando una jeringa con una aguja de calibre 30. A continuación, coloque la aguja de vidrio llena a través de la boquilla y coloque la junta tórica más grande alrededor de su base a un milímetro del extremo romo de la aguja. Deslice la aguja sobre el émbolo de metal y atornille suavemente la pinza hasta que quede segura.

Disipe el aceite mineral del inyector, dejando un pequeño volumen de aceite en la aguja para que actúe como una barrera entre el inyector y la suspensión bacteriana. Asegúrese de que no haya burbujas de aire dentro del aceite mineral, la suspensión bacteriana o entre los dos líquidos. A continuación, ajuste el inyector al volumen deseado para la inyección.

Inserte con cuidado la punta de la aguja capilar en un tubo de PBS estéril y presione el botón de llenado en el inyector para llenar la aguja del inyector y generar controles de heridas. Inyecte a las moscas anestesiadas PBS estéril en la parte anterior del abdomen en la superficie lateral ventral, coloque las moscas inyectadas en viales nuevos con medios nuevos y coloque los viales de lado para evitar que las moscas se peguen a la comida antes de que se recuperen de la anestesia. A continuación, expulse los medios estériles restantes del inyector y vuelva a llenar la misma aguja con la suspensión bacteriana.

Repita el procedimiento e inyecte a las moscas con la suspensión bacteriana. Alternativamente, la infección puede transmitirse mediante un pinchazo séptico. Para preparar el pin infeccioso, derrita el extremo de la punta de una micropipeta de 200 microlitros e inserte un alfiler de insecto mnuchin de 0,15 milímetros en el plástico fundido.

Deje que el plástico se solidifique para que el alfiler se mantenga en su lugar con 0,5 centímetros de alfiler que se extienda desde el plástico, anestesiar las moscas con dióxido de carbono y pinchar las moscas en la placa pleural esternal del tórax con la aguja, evitando los sitios de unión de las alas y las patas. Retira las moscas del alfiler de las minucias con pinzas blandas. Asegúrate de sumergir el alfiler en la suspensión bacteriana entre pinchar cada mosca.

Coloque las moscas pinchadas en un frasco nuevo con medio nuevo para moscas, colocando el frasco de lado hasta que todas las moscas se hayan recuperado de la anestesia. Coloque un subconjunto de las moscas infectadas en tubos de microcentrífuga individuales sobre hielo. Agregue 250 microlitros de PBS a cada tubo y use un mortero para homogeneizar las moscas.

A continuación, coloque el homogeneizado en una aireación LB utilizando un platillo en espiral. Alternativamente, para colocar el homogeneizado en placa por dilución en serie. Transfiera cada mosca homogeneizada a la primera fila de un 96.

Cubra y llene cada pocillo de las filas restantes con 90 microlitros de PBS utilizando una pipeta multicanal. Tome 10 microlitros de la primera fila que contenga homogeneizado de mosca y dispense el homogeneizado en la segunda fila. Cásalo hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces para mezclar bien el homogeneizado.

Luego tome 10 microlitros del homogeneizado y transfiéralo a la siguiente fila. Repita este procedimiento utilizando las filas restantes, empezando por la fila inferior. Utilice la pipeta multicanal para tomar 10 microlitros de cada pocillo y depositarlo en una placa LB.

Asegúrese de que las muestras se dispensen como puntos discretos que no se toquen entre sí. Repita este paso hasta que se hayan tomado muestras de todos los pocillos de cada fila, dispensándolos en orden descendente de dilución en la placa LB. Cualquiera que sea el método de siembra que se utilice, tenga cuidado de no crecer demasiado para que las colonias permanezcan pequeñas y discretas.

Retire la placa de la incubadora. Una vez que las bacterias experimentales han desarrollado colonias visibles, pero antes de que las colonias de la drosophila, la microbiota intestinal se hace visible aproximadamente 24 horas después en forma de placas espirales. Cuente las colonias que crecen utilizando un contador de colonias automatizado que puede estimar la carga bacteriana por mililitro de homogeneizado en función del número y la posición de las colonias en el plato.

En el caso de las placas puntuales, cuente manualmente las colonias de cada mosca de la dilución que contenga de 30 a 300 colonias y calcule el número de bacterias por mililitro de homogeneizado original. A las moscas se les inyectaron 50 nanolitros de suspensiones bacterianas que cubrían un rango de densidades ópticas e inmediatamente homogeneizadas y platicadas, la dosis de infección varía con la densidad óptica de la suspensión bacteriana utilizada para la inyección. Las cargas bacterianas iniciales se correlacionan fuertemente con la OD inicial inyectada.

Este protocolo permite la observación de diferentes tipos de infecciones. Las moscas fueron infectadas con providencia rei, que puede causar una infección crónica subletal que persiste durante 20 días o más. Las moscas infectadas con coli eliminarán la infección en seis horas. Post-infección.

La inducción del sistema inmune se puede estimar a través del aislamiento de ARN y la posterior Q rtpcr R de la transcripción del péptido antibacteriano de manera análoga, pero menos cuantitativamente moscas que expresan GFP bajo el control del péptido antimicrobiano. Los promotores de genes se pueden utilizar para visualizar la inducción del sistema inmunitario una vez dominados. Esta técnica puede permitir la infección de cientos de moscas por hora.

Es concebible que se pueda medir cualquier número de fenotipos en las moscas después de que se infecten, incluida la capacidad de aprendizaje, el estado metabólico o prácticamente cualquier otro rasgo que se pueda imaginar. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo administrar infecciones bacterianas sólidas y repetibles a drosophila, melanogaster, y cómo medir posteriormente la gravedad de la infección y cuantificar la respuesta inmunitaria del huésped. No olvide que ciertas bacterias pueden representar riesgos para la salud humana.

Asegúrese de que se sigan los procedimientos de bioseguridad adecuados y de que se implementen las medidas de contención adecuadas para evitar que las moscas infectadas escapen. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.