Manchas de sangre seca - preparación y procesamiento para su uso en inmunoensayos y en técnicas moleculares

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un protocolo estandarizado para la preparación y el procesamiento de las gotas de sangre seca que se utilizarán posteriormente en inmunoensayos y en técnicas moleculares. Esto se logra tomando primero sangre capilar y transfiriéndola a una tarjeta de filtro. El segundo paso es secar las manchas de sangre durante la noche y obtener perforaciones de seis milímetros de los círculos de la tarjeta de filtro.

A continuación, la sangre seca de los punzones se consigue sumergiéndola en un tampón en una coctelera durante un mínimo de cuatro horas. A continuación, los EIT hemolíticos se liberan de los residuos mediante centrifugación. El paso final es analizar los EIT autorizados para los marcadores serológicos y moleculares de infecciones por los virus de la hepatitis B, la hepatitis C y la inmunodeficiencia humana mediante inmunoensayos y técnicas moleculares disponibles en el mercado.

La idea de utilizar la parcela recogida en una tarjeta de filtro hecha de celular se originó hace un siglo. Sin embargo, las personas que utilizan este método por primera vez a menudo tienen dificultades incluso hoy en día porque toda la fase preanalítica, que comprende la preparación y el procesamiento de las gotas de sangre seca para su análisis final, no se ha estandarizado para casi todas las aplicaciones de las pruebas de gotas de sangre seca. Teniendo en cuenta estos antecedentes, sugerimos un protocolo estandarizado completo paso a paso para la preparación y procesamiento de gotas de sangre seca para su posterior uso en técnicas moleculares y de inmunoensayo.

La demostración visual de esta metodología parece ser crucial, ya que varios pasos como la extracción de sangre capilar. Es correcto. La transferencia a las tarjetas de filtro o la preparación de los golpes apropiados de las multitudes no son fáciles de aprender y, en consecuencia, las personas que utilizan la técnica por primera vez sin duda se beneficiarán de la representación visual.

La sangre capilar será extraída del dedo de Nico por un técnico de nuestro laboratorio demostrando el procedimiento de procesamiento. Las gotas de sangre obtenidas serán por el técnico ko, que ya está trabajando durante muchos años en nuestro laboratorio para el diagnóstico biológico molecular para la punción de la piel. Primero ponte un par de guantes de goma de látex desechables.

Antes de la punción cutánea, el paciente debe calentarse las manos. El dedo se masajea en gran medida para enriquecer el flujo sanguíneo hacia el sitio superior de la punción. A continuación, limpie la piel del lado de Palmer de la punta, de la falange distal del tercer o cuarto dedo de la mano no escritural, con un desinfectante adecuado, perfore la piel con una lanceta de seguridad de un solo uso.

Los dedos deben mantenerse en una posición tal que la gravedad facilite la acumulación de sangre en la punta del dedo. Limpie la primera gota de sangre con una gasa, ya que puede contener un exceso de líquido tisular. Después de volver a masajear el dedo para aumentar el flujo sanguíneo en el lugar de la punción, transfiera la siguiente gota a uno de los círculos de una tarjeta de filtro sin tocar la superficie directamente con la yema del dedo.

Deje que se forme la siguiente gota grande de sangre capilar en la yema del dedo y recójala en el siguiente círculo. Continúe este procedimiento hasta que se llenen todos los círculos necesarios o se detenga el flujo sanguíneo durante la recolección. Permita que la sangre penetre en la textura del filtro solo por fuerzas capilares.

No apriete ni ordeña el dedo en exceso si el flujo sanguíneo no es suficiente para llenar todos los círculos requeridos de la tarjeta de filtro. Si el flujo sanguíneo se detiene, coloque un vendaje en la punta del dedo, realice una segunda punción cutánea en otro dedo si se necesita más sangre para el examen para secar las manchas de sangre, coloque las tarjetas de filtro en una toalla de papel limpia en un gabinete de seguridad contra riesgos biológicos y déjelas secar, preferiblemente durante la noche a temperatura ambiente. En ausencia de cualquier fuente externa de calor, cuando se completa el proceso de secado, las manchas de sangre tienen un color marrón uniformemente oscuro y ya no se ven áreas rojas para el almacenamiento.

Coloque la tarjeta de papel de filtro en una sola bolsa con cremallera impermeable al gas que contenga una o dos bolsitas desecantes para proteger las muestras de la humedad. Transfiera esta bolsa a un congelador con una temperatura de menos 20 grados Celsius o menos lo antes posible. Si no se dispone de congeladores en condiciones de campo, es factible almacenarlos a menos cuatro grados centígrados o incluso a temperatura ambiente durante un máximo de 14 días.

Perfore un punto con un dispositivo de seis milímetros de un solo uso de cada círculo empapado de sangre de la transferencia de tarjeta de filtro de grado 9 0 3, todas las manchas de sangre seca perforadas de un solo paciente a un pocillo de los 12. La placa del pocillo llene el pocillo con solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,05% entre 20 y 0,08% de azida de sodio. Repita estos pasos para obtener una segunda serie de EIT de gotas de sangre seca con el fin de realizar análisis moleculares.

A continuación, coloque la placa de cultivo celular en un agitador de laboratorio y deje que las manchas de sangre seca se eluyan suavemente durante un mínimo de cuatro horas o preferiblemente durante la noche. Al día siguiente, las manchas están casi libres de sangre y se han formado sobrenadantes hemolíticos. Transfiera estos EIT a tubos de microcentrífuga, luego sométalos a centrifugación durante dos minutos a 10, 500 veces G para liberar.

Los sobrenadantes de cualquier residuo que se haya formado durante las EIT centrifugadas por Ellucian están ahora listos para ser utilizados para los análisis previstos. La primera serie de EIT se transfiere a tazas para pruebas serológicas. La segunda serie se transfiere a microtubos para el análisis por PCR.

Investigue los EIT para los marcadores del virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C y la infección por el VIH utilizando ensayos disponibles en el mercado y siga cuidadosamente las instrucciones del fabricante respectivo. Finalmente, los resultados de las pruebas serológicas en el analizador totalmente automatizado se muestran en la pantalla del sistema. La efectividad del protocolo sugerido para la preparación y el procesamiento de las gotas de sangre seca se evaluó primero mediante el análisis de 1.762 pares de manchas de sangre seca en suero acopladas con respecto a las determinaciones de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B.

El protocolo de ensayo fue modificado debido a que con un valor de corte de 0,05 unidades internacionales por mililitro, el 56,2% de los fueron reactivos en comparación con los resultados obtenidos de Sarah. Esto correspondió a una tasa de falsos positivos del 14,7% en las pruebas de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. El análisis de las características operativas del receptor de los datos indicó que un aumento del umbral a 0,15 unidades internacionales por mililitro daría lugar a una separación ideal de los positivos para el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B de los negativos para el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B al investigar los pares de manchas de sangre seca en suero para detectar la presencia de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. Solo se obtuvieron dos discrepantes.

Los dos falsos negativos Sarah se originaron en pacientes bajo tratamiento antiviral. La determinación cualitativa de H-B-V-D-N-A mediante PCR en tiempo real a partir de EIT en sangre total arrojó una sensibilidad del 93%, por lo que no se detectaron siete muestras con bajas concentraciones séricas de H-B-V-D-N-A. Solo se determinaron cuatro resultados falsos negativos de anti VHC a partir de EIT con gotas de sangre seca.

Es muy probable que las C respectivas se tomaran de pacientes cuyas infecciones se habían resuelto hacía mucho tiempo. La sensibilidad analítica del 100% para las determinaciones de H-C-V-R-N-A a partir de EIT de gotas de sangre seca indicó la excelente sensibilidad del enfoque de amplificación mediada por transcripción isotérmica, que se utilizó para la amplificación de H-C-V-R-N-A. La detección de anticuerpos anti VIH en EIT de gotas de sangre seca con un sistema totalmente automatizado también resultó en una sensibilidad analítica del 100%Este video muestra que hoy en día es posible detectar de manera confiable marcadores serológicos y moleculares de infecciones por hepatitis B, hepatitis C y VIH en todas las manchas de sangre estrechas, incluso cuando se utiliza un volumen de elución comparativamente alto y se modifican los protocolos establecidos para las investigaciones en suero o plasma. no ha cambiado considerablemente.

Sin embargo, los resultados comunicados también confirmaron los límites inherentes de la técnica de las gotas de sangre seca. En algunos casos. El protocolo descrito también se probó en condiciones de campo en 534 usuarios activos de drogas en las ciudades alemanas de Berlín y Essen durante la fase piloto del estudio de medicamentos y enfermedades infecciosas crónicas.

Los resultados obtenidos condujeron a una pequeña modificación del algoritmo de prueba para la fase principal del estudio del fármaco en otras seis grandes ciudades alemanas.