Sincronización de Caulobacter crescentus Para la Investigación del Ciclo Celular Bacteriana

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células enjambre de Coob para establecer un cultivo celular sincronizado. Esto se logra primero cultivando un cultivo mixto de células coob backer, y luego deteniendo brevemente el crecimiento mediante la suspensión de las células en medio frío. El segundo paso es separar las celdas del enjambre mediante centrifugación de densidad diferencial.

El siguiente paso es resuspender las células del enjambre en medio cálido, lo que permite que las células entren en el ciclo celular. Por último, las células de enjambre aisladas pueden seguirse a lo largo del ciclo celular mediante ensayos bioquímicos o microscopía. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos, como la máquina de células de bebé, es que las células se pueden aislar rápidamente y aumentar lo suficiente como para realizar estudios bioquímicos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como qué controla la segregación cromosómica y el ciclo asimétrico de división celular. Para empezar, inocule cinco mililitros de medio PYE con bacterias de una placa de la cepa CSIS de apoyo colo, NA 1000. Cultive el cultivo durante la noche a 28 grados Celsius y agite al día siguiente, transfiera 0,5 mililitros del cultivo durante la noche a un matraz que contenga 25 mililitros de medio M dos G y agite el matraz a 28 grados Celsius hasta que el cultivo alcance una densidad óptica entre 0,5 y 0,6.

A continuación, diluya el cultivo en un litro de medio M dos G para obtener la densidad óptica inicial deseada y agite el matraz a 28 grados centígrados cuando la densidad óptica del cultivo alcance 0,5 pipetee un microlitro del cultivo en un portaobjetos y, a continuación, cubra el líquido con un cubreobjetos. Obtener imágenes de las células mediante microscopía de fase para confirmar la presencia de células de enjambre que nadan rápidamente. Transfiera el cultivo a un tubo de centrífuga estéril y luego haga girar las células a 7.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.

A continuación, deseche las células peletizadas sin apretar al verter el sobrenadante y agregue 180 mililitros de M dos medios fríos. Utilice una pipeta serológica para resuspender suavemente las células. Luego agregue 60 mililitros de solución fría de sílice coloidal a la suspensión celular y mezcle bien.

Vierta la suspensión de la celda en ocho tubos de 30 mililitros y centrifuérrelos a 6.400 veces G durante 30 minutos. Establece cuatro grados centígrados. Retire suavemente los tubos de la centrífuga y revise el tubo para ver si tiene dos bandas distintas.

La banda inferior contiene las celdas de enjambre y las celdas predivisionales están en la banda superior. A continuación, aspire con cuidado la banda superior y el líquido hasta aproximadamente un centímetro por encima de la banda inferior. Utilice una pipeta pastelera para retirar la banda de enjambre y transfierirla a un tubo limpio.

Llene el tubo con medio M dos frío y luego centrifugue el tubo para lavar la sílice coloidal. A continuación, deseche cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 20 mililitros de centrífuga M dos medianas frías. Nuevamente, para pellets las celdas, resuspenda los pellets en 30 mililitros de medio M dos fríos y luego mida la densidad óptica de la suspensión.

Coloque un microlitro de la suspensión celular en un portaobjetos de microscopio y use imágenes de fase para verificar si hay células de enjambre. A continuación, centrifugar las células y volver a suspenderlas en medio M dos G hasta una densidad óptica entre 0,3 y 0,4. Incubar el cultivo con agitación a 28 grados centígrados para ensayos de expresión génica o de parcela occidental.

Retire una alícuota de mililitro cada 10 a 30 minutos durante aproximadamente 140 minutos hasta que la densidad óptica del cultivo se duplique. Utilice una centrífuga de mesa para hacer girar las células durante 30 segundos y, a continuación, aspire rápidamente el flash medio. Congele los gránulos de células en nitrógeno líquido y guárdelos a menos 80 grados centígrados para una sincronía a pequeña escala, inocule cinco mililitros de medio M dos G con células NA 1000 y haga crecer las células durante la noche agitándolas a 28 grados centígrados al día siguiente.

Diluir el cultivo en 15 mililitros de medio M dos G y cultivar las células hasta que la densidad óptica esté entre 0,5 y 0,6. Centrifugar las células y luego resuspenderlas en un mililitro de medio frío M dos. Transfiera las células a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros, granule las células por centrifugación y aspire el supnatante.

A continuación, coloque el tubo en hielo y vuelva a suspender el pellet de celda en 900 microlitros de medio M dos fríos. A continuación, agregue 900 microlitros de sílice coloidal fría recubierta de PVP y centrifugue el tubo durante 20 minutos. Aspire con cuidado la banda de células predivisionales superior y luego recoja la banda inferior del enjambre en un nuevo tubo de microcentrífuga.

Lave las celdas del enjambre dos veces en un mililitro de medio M dos fríos mientras centrifuga durante tres minutos entre cada lavado justo antes del centrifugado final. Coloque la suspensión celular en un tubo de ensayo de vidrio preenfriado de un mililitro y mida la densidad óptica de las celdas. A continuación, transfiera las células a un tubo de microfuga y centrifuga después de la centrifusión.

Reese, suspenda el pellet de celda final en medio Prewarm M dos G a una densidad óptica entre 0,3 y 0,4 y agite las celdas a 28 grados centígrados. Si se desea microscopía, coloque un microlitro del cultivo en una almohadilla aerodinámica M dos G en los puntos de tiempo apropiados. La centrifugación de densidad diferencial de un cultivo asíncrono produce dos bandas de células.

La banda inferior contiene células de enjambre, que tienen una densidad más alta, y la banda superior contiene células almacenadas y predivisionales, que tienen una densidad más baja. La densidad óptica del cultivo aumenta aproximadamente el doble durante el transcurso del ciclo celular. Durante este tiempo, las células de enjambre se diferencian en células almacenadas, las células almacenadas luego se replican y se someten a una división celular asimétrica.

Con cada división que produce una nueva célula de enjambre y la célula de población principal, un Western blot para el regulador maestro del ciclo celular CTRA es un control útil para verificar la sincronización, CTRA bloquea la replicación del ADN en las células del enjambre y se degrada tras la replicación del ADN. A continuación, el CTRA se sintetiza más adelante en el ciclo celular, evitando el reinicio de la replicación del ADN y activando la transcripción de muchos genes del desarrollo. Este patrón oscilante de los niveles de la proteína CTRA indica una sincronía exitosa.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sincronizar la devolución de llamada o las células NA 1000 para investigar el ciclo celular bacteriano. Este procedimiento de sincronización de celdas se puede realizar en una o dos horas si se realiza correctamente. Al realizar este procedimiento es importante recordar trabajar rápidamente.