Protocolos para la obtención de embriones somáticos y cigóticos para el estudio de la regulación del desarrollo embrionario temprano en el Modelo de Leguminosas Medicago truncatula

El objetivo general de los siguientes procedimientos es demostrar cuántos embriones de tula de carga se pueden obtener en diferentes etapas de desarrollo para investigar la regulación genética de la embriogénesis en las plantas, esto se puede lograr vinculando la morfología de la vaina con las diferentes etapas de desarrollo del embrión cigótico, y mediante el cultivo de hojas para obtener embriones somáticos en las diferentes etapas. En última instancia, la PCR cuantitativa y la beta glucuronidasa se pueden utilizar para evaluar la expresión de genes durante la embriogénesis en las etapas específicas de desarrollo de interés. Las ventajas de estas técnicas son que el marcaje de flores individuales no es necesario para los experimentos in vivo, y son procedimientos in vitro optimizados, proporcionando enfoques experimentales complementarios.

La demostración visual del procedimiento de cultivo es importante porque permite seguir más de cerca los detalles de las manipulaciones. La demostración del procedimiento in vivo estará a cargo de Wang, mientras que Kim Nolan hará una demostración del procedimiento in vitro. Para facilitar el desarrollo cigótico del embrión, perfore la superficie de las cubiertas de semillas de una planta trinocular Monte cargo y remoje las semillas durante la noche, completamente cubiertas de agua.

Al día siguiente, siembre tres semillas en cada una de las 10 macetas de 15 centímetros de diámetro en una mezcla para macetas y transfiera las macetas a una casa de vidrio. Cultive las plantas bajo un período fotográfico de 14 horas con una temperatura diurna y nocturna de 23 a 19 grados centígrados, reteniendo las plántulas más saludables después de la germinación para que haya una planta por maceta y rodeando las plántulas con un enrejado para que los tallos de las plantas trepen cuando aparezcan las vainas. Recoja en las etapas apropiadas descritas en la tabla uno y la figura uno para obtener la etapa temprana de desarrollo embrionaria deseada.

A continuación, use fórceps para aislar los dientes de las vainas. Alternativamente, para una microscopía más refinada, completamente clara en la solución de Hoyer, las etapas embrionarias se pueden confirmar mediante imágenes de los embriones bajo un microscopio compuesto estándar. A continuación, recoja el número de UL necesario para el experimento de la región central de la vaina y guárdelos a la temperatura adecuada para el análisis posterior para el desarrollo del embrión somático.

Cosecha in vitro folíolos de la última hoja de tata, casi completamente expandida, de un tallo alargado de un cultivar de tran atula que es capaz de formar embriones fácilmente en cultivo. Mantenga las hojas de tate sobre una toalla de papel húmeda en una maceta de cultivo para evitar la deshidratación. Luego, trabajando en un gabinete de bioseguridad esterilizado con rayos UV, colocó las hojas en la bola de malla de un infusor de té de primavera en autoclave.

Un infusor sumergido en etanol al 70% en un autoclave con tapón de rosca de 250 mililitros. Maceta de cultivo de policarbonato después de 30 segundos, drene el tejido de la hoja y luego sumerja el infusor en una solución de lejía diluida de uno a ocho durante 10 minutos. Con un remolino suave ocasional, agite suavemente la olla y drene el exceso de agua.

A continuación, enjuague el infusor. Una vez más en agua fresca desionizada en una olla nueva. Ahora use pinzas estériles para transferir las hojas del infusor de té a un cultivo fresco, una olla de agua destilada desionizada estéril enrosque la tapa estéril.

Luego enjuague las hojas por inversión y remolinos. A continuación, deje que los folletos floten en el agua estéril para colocar los implantes. Recorte los bordes de los folletos esterilizados individuales utilizando una técnica estéril.

A continuación, corte el rectángulo restante en dos o tres, de ocho a 10 por tres a cinco milímetros rectangulares con la vena media en el centro de cada placa de explanación X. Seis explantes por medio de cultivo solidificado en agar en nueve centímetros de diámetro. Placas de Petri con el sello ABA hacia abajo para mantener la orientación habitual de las hojas.

A continuación, selle las placas de Petri con perfil e incube las placas en la oscuridad a 28 grados centígrados en una sala de temperatura controlada. Después de tres semanas, use una espátula estéril de acero inoxidable y pinzas para subcultivar los explantes del orificio diferenciador en medio fresco. Los primeros embriones deben observarse en unas cuatro semanas a medida que se produce la callosidad, y el callo supera el tamaño del modelo más grande que se muestra aquí.

Transfiera solo el 50% del callo individual cuando se subcultiva a un medio fresco. Finalmente, utilice un microscopio estereoscópico para recolectar las diferentes etapas embrionarias durante un período de incubación de cuatro a ocho semanas, procesando los explantes de acuerdo con los objetivos experimentales. Después de cosechar embriones cigóticos, como se acaba de demostrar más adelante en C, se pueden emplear dos hibridaciones u otras estrategias apropiadas de particular interés, como se demuestra en estas imágenes, se puede observar el carácter distintivo de SSIS y Spencer siguiendo los planos X plateados.

A lo largo de las semanas, se pueden localizar de cuatro a ocho embriones somáticos en etapas discretas y seleccionarlos para su análisis inmediato. Por ejemplo, estos datos ilustran cómo los embriones en la etapa temprana de Oleína exhiben la expresión de un tipo de gen de la Oleína, pero no de otro. Una ventaja particular del sistema de embriones somáticos es que la transformación del callo se puede llevar a cabo sin regenerar una planta completa.

Efectivamente, como se ha demostrado aquí. La beta glucuronidasa se puede utilizar para visualizar la expresión génica en las diferentes etapas de la embriogénesis. Después de ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo seleccionar y diseccionar la vaina para obtener a Andrés.

También debe tener una buena comprensión de cómo preparar y colocar un plan estéril para la embriogénesis somática después de su desarrollo. Estas técnicas han permitido investigar la regulación de la transcripción de las primeras etapas de la embriogénesis en relación con el crecimiento embrionario, el desarrollo y el almacenamiento de nutrientes.