Name: Protocolos para la obtención de embriones somáticos y cigóticos para el estudio de la regulación del desarrollo embrionario temprano en el Modelo de Leguminosas Medicago truncatula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a obtener embriones somáticos y cigóticos de Medicago truncatula para estudiar la regulación genética de la embriogénesis temprana. Este protocolo combina morfología de vainas con técnicas de cultivo de tejidos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada por el Consejo Australiano de Investigación CEO348212 y la Universidad de Newcastle. Se agradece la asistencia del Dr. Sam Zhang.

1. Desarrollo de embriones cigóticos <ol><li> Material Vegetal <ol><li> Crece la Medicago truncatula tipo salvaje Jemalong o su isogénica más cercana, altamente re-generable genotipo Jemalong 2HA 13 (conocido como 2HA) en un invernadero con un fotoperíodo de 14 horas y 23 ° C / 19 ° C de temperatura día / noche. <ol><li> Pierce la superficie de la cubierta de la semilla (con una aguja de 23 G) antes de sembrar la semilla de modo se permite que el agua para entrar en la semilla y en remojo en agua durante la noche. Agregar suficiente agua para cubrir la totalidad de la semilla. </li><li> Siembre 3 semillas en cada maceta 15 cm de diámetro (un total de 10 macetas) en la mezcla para macetas (gruesa arena, perlita, fibra de coco, turba (1: 1: 1) más de 5 g de Osmocote Estándar exacta: fertilizante de liberación lenta) y traslado al invernadero. Conserve la plántula más saludable después de la germinación por lo que no es de 1 planta por maceta y rodeado de un enrejado para la planta proviene de escalar. </li></ol></li></ol></li><li> Vainas de cosecha <ol><li> Recoger las vainas de la wTipo ild Jemalong o 2HA para obtener las fases de embrión temprano adecuadas como primera describe 9. NOTA: Las diferentes etapas de la vaina se muestran en la Figura 1 y las etapas de embriones correspondientes se muestran en la Figura 2. </li><li> Compruebe las diferentes etapas de la vaina en la cosecha utilizando criterios como por la Tabla 1. Medir el tiempo transcurrido desde la etapa 6 para ayudar etapas separadas 6 y 7 (Tabla 2). </li></ol></li><li> La disección de los óvulos de las vainas y la comprobación de la etapa de embrión <ol><li> Aislar óvulos de vainas utilizando unas pinzas finas sola o un microscopio de disección estéreo y pinzas si es necesario. Si se requiere la etapa de embrión se puede comprobar rápidamente usando un microscopio compuesto estándar (Figura 3B). </li><li> Prepárese modificado solución de Hoyer que contiene 7,5 g de goma árabe, 100 g de hidrato de cloral, 5 ml de glicerol, 60 ml de agua desionizada destilada. Disolver por agitación durante 3-5 horas o durante la noche. </li><li> Para obtener más refinard microscopía borrar los óvulos disecados en solución de 15,16 Hoyer modificado. Recoja cuidadosamente los óvulos intactos y el lugar en un pequeño volumen de solución de Hoyer (suficiente para cubrir el óvulo) a temperatura ambiente hasta que se aclare. </li><li> Ver las muestras con contraste de interferencia diferencial (DIC) óptica. Captura las imágenes iwth una cámara digital 9 (Figura 2). </li><li> Obtener los óvulos más uniformes de la región central de la vaina y acumular el número requerido. Un ejemplo se muestra en la Figura 3A. Recoge los óvulos en el hielo y almacenar a temperatura requerida (ácidos -80 ° C durante nucleicos) para su posterior análisis. NOTA: Para obtener más información sobre el análisis de las secciones histológicas, la microscopía electrónica de transmisión, y la hibridación in situ por favor vea los papeles 8,9. </li></ol></li></ol> 2. Desarrollo de embriones somáticos in vitro <ol><li> Utilice una M. truncatula cultivar tsombrero es capaz de formar fácilmente embriones en cultivo. Para este protocolo para explantes de hoja utilizar las plantas 2HA 13,17 que son 2-4 meses de edad. </li><li> Tome folletos de la última hoja trifoliada casi totalmente expandido de un vástago alargando. </li><li> Mantenga las hojas trifoliadas sobre toallas de papel húmedo en una olla de la cultura para evitar la deshidratación. NOTA: Una vez que las hojas trifoliadas se cosechan que necesitan para ser utilizado con la mínima demora. </li><li> Preparación del medio de cultivo <ol><li> Utilice el P4 10: 5 en medio de agar (0,8% w:: v) 4: 1 en 9 cm placas de Petri. NOTA: El P4 10: 4: 1: 5 medio consiste en el medio basal P4 18 más 10 mM de ácido 1-naftalenacético (NAA), 4 M 6-bencilaminopurina (BAP), 1 mM de ácido abscísico (ABA) y 5 mM giberélico ácido (GA). El uso de GA + ABA acelera la formación del embrión y provoca aumentos sustanciales en el número de embriones 14. </li><li> Conforman el medio basal P4 en 1 L; que consiste en sales principales (hacer calcium hasta por separado), sales menores y vitaminas (Tabla 3), de hierro quelado (compensar por separado), casamino ácidos (hidrolizado de caseína), 30 g de sacarosa, 8 g de agar. </li><li> Soluciones tienda del stock de las principales sales, calcio, casaminoácidos, sales menores y vitaminas a -20 ° C en alícuotas adecuadas. Guarde hierro quelado a 4 ° C. </li><li> Completar el hierro quelado (200x) disolviendo 7,44 g de Na 2 EDTA • 2H 2 O en aproximadamente 900 ml de agua destilada desionizada Mientras se agita, a continuación, llevar la solución a 98-99 ° C, mientras que la adición de 1,853 g de FeSO4 • 7H 2 O. Finalmente hacer hasta 1 L cuando se disuelven los ingredientes. Almacenar en color ámbar botellas a 4 ° C. </li><li> Completar el medio basal P4 con las soluciones madre como en la Tabla 4. Las hormonas en el medio son 10 M NAA, 4 BAP M, 1 ABA M, 5 M GA (ver Tabla 4 y Materiales Específicos Tabla). Añadir la NAAy BAP antes de tratamiento en autoclave y añadir ABA y GA después de tratamiento en autoclave y de enfriar a aproximadamente 55 ° C, utilizando esterilización por filtración con un filtro de 0,22 micras unida a una jeringa. Mezclar bien agitando suavemente. </li><li> Ajuste los medios a pH 5,8 con 1 M de KOH antes de autoclave. Autoclave a 121 ° C durante 20 min. </li><li> Después de autoclave agregar la ABA esterilizada filtro y GA, y vierta aproximadamente 25 ml de medio en 9 cm placas de Petri estériles en una campana de flujo laminar o gabinete de riesgo biológico. Enfriar y dejar que el agar establece con la tapa. A continuación, poner en la tapa y asegúrese de que no hay condensación en la tapa. Etiqueta según sea necesario y se almacena a 4 ° C (en una caja de cartón para evitar condensado tapa). </li></ol></li><li> La esterilización de la hoja de tejido <ol><li> Trabajar en una campana de flujo laminar UV-esterilizados o gabinete de riesgo biológico. </li><li> Coloque las hojas en la bola del acoplamiento de un infusor de té de primavera previamente tratada en autoclave. </li><li> Sumerja infusor de té que contiene las hojas en el 70% (v: v) de etanol en una callepote tura durante 30 segundos. NOTA: Para todos los pasos de este procedimiento utilizan 250 ml tornillo de cabeza macetas de cultivo de policarbonato que son tratados en autoclave. </li><li> Escurrir y luego transferir y sumergir el tejido de las hojas en 1: 8 (v: v) de blanqueador diluido (0,5% de cloro) durante 10 minutos. Agitar suavemente de vez en cuando. </li><li> Escurrir la lejía y transferir el sistema de infusión de té en una olla de cultivo que contiene agua destilada desionizada estéril. Hacer girar suavemente y drenar el exceso de agua. Repetir una vez más con una olla de cultivo fresco de agua destilada desionizada estéril. </li><li> Quite las hojas desde el infusor de té con unas pinzas estériles a una olla de cultivo fresco de agua destilada desionizada estéril. Tornillo en la tapa estéril y enjuague invirtiendo y remolinos. Deja las hojas que flotan en el agua estéril hasta que esté listo para preparar los explantes. </li></ol></li><li> Preparación y Plating explantes <ol><li> Usando técnicas estériles, recorte folletos esterilizados individuales desde el borde con un bisturí, y cortar el rectángulo restante en dos o three explantes rectangulares (8-10 x 3-5 mm) con la mitad de la vena en el centro de cada explante (Figura 5A). NOTA: El tamaño del explante es muy importante en la iniciación de la primera formación de callos. Llevar a cabo el corte en las tapas de los recipientes estériles comida para llevar. </li><li> Placa de 6 explantes en medio de cultivo agar-solidificado en 9 cm de diámetro placas de Petri (Figura 5B). Placa del lado abaxial explantes abajo para mantener la orientación habitual hoja. </li><li> Sellar las placas de Petri con Parafilm (Figura 5C) se extendía alrededor del plato. El tejido está ahora listo para la incubación. </li></ol></li><li> La incubación del tejido <ol><li> Incubar las placas en la oscuridad a 28 ° C en un ambiente de temperatura controlada o gabinete crecimiento en todo el período de cultivo. NOTA: Los explantes iniciarán desdiferenciación, someterse a la división celular, la proliferación (formación de callo) y la embriogénesis (diferenciación). </li><li> Subcultivar la EXPOSICIÓN diferenciadornoches después de 3 semanas a un medio fresco. En este subcultivo transferir todo el explante usando una espátula de acero inoxidable estéril y pinzas, en una campana de flujo laminar o un armario de riesgo biológico. Como se produce formación de callos y el callo supera el tamaño de la más grande en la Figura 5C, transferir 50% del callo individual cuando el subcultivo a un medio fresco. </li><li> Observe los primeros embriones en unos 4 semanas. Mientras que hay un grado de sincronía, recoger las diferentes etapas de embrión de más de un período de incubación de 4-8 semanas (Figura 6A, B). Reunir bajo un microscopio de disección y el proceso de acuerdo con los objetivos experimentales. </li><li> Subcultivar cada 3 semanas y eliminar periódicamente los embriones de modo que los explantes continuarán produciendo embriones durante 3 meses. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li>
<li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legumes%3A+importance+and+constraints+to+greater+use%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li>
<li>Young, N. D., Udvardi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Medicago+truncatula+genomics+to+crop+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insights+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li>
<li>Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+Medicago+truncatula+seed+development+establishes+the+time+frame+of+diverse+metabolic+processes+related+to+reserve+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation.</a> Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).</li>
<li>Verdier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+M.+truncatula+transcription+factors+identifies+putative+regulators+of+grain+legume+seed+filling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling.</a> Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li>
<li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li>
<li>Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies%3A+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li>
<li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li>
<li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Botany%22%5BJournal%5D)">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li>
<li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+regulation+of+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs.</a> Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).</li>
<li>Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slicing+across+kingdoms%3A+regeneration+in+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals.</a> Cell. 132 (4), 697-710 (2008).</li>
<li>Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li>
<li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis%2C+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908(2014).</li>
<li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li>
<li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+%28SERK1%29+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li>
<li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIantcheva%2C+A+%22The+Medicago+truncatula+handbook%22">The Medicago truncatula handbook</a>. Mathesius, U. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.noble.org/MedicagoHandbook">http://www.noble.org/MedicagoHandbook</a> (2006).</li>
<li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li>
<li>Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOchatt%2C+SJ+%22Plant+Embryo+Culture%3A+Methodsand+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22">Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology</a>. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).</li>
<li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Los protocolos descritos son relativamente sencillo y permiten la investigación de la embriogénesis leguminosa con toda la célula contemporánea y técnicas moleculares. Reconocemos que hay ventajas y desventajas de ambos in vivo e in vitro enfoques. Ambos permiten un mayor enfoque en la embriogénesis temprana en comparación con la cultura de las semillas inmaduras 19. En el caso de los estudios in vivo lo que se describe es predominantemente el a...

Las legumbres son la tercera familia más grande de plantas superiores, con aproximadamente 20.000 especies y el (o Fabaceae) familia de las leguminosas son segundos a los cereales en la superficie cosechada y la producción total 1. La soja es el cultivo cultivado tercera más grande. Leguminosas de grano proporcionan alrededor de un tercio de la proteína dietética y un tercio de aceite vegetal para el consumo humano 2. Legumbres con su capacidad de fijación de N2 también contribuyen a los sistemas agrícolas sostenibles. Medicago truncatula, como la soja, las tiendas de proteína y aceite en los cotiledones de las semillas y es una leguminosa modelo genética y genómica con considerables recursos genéticos y genómicos 3,4. Mientras M. truncatula ha permitido avances en la comprensión de la leguminosa simbiosis Rhizobium 4 se ha empleado cada vez más para estudiar la biología de semillas de leguminosas 5-7 y embriogénesis 8,9. Embriogénesis Arabidopsis ha sido ampliamente estudiado 10,11 pero isa no leguminosas y los detalles de la embriogénesis no son idénticos a Medicago 8,10. Embriogénesis cigóticos en M. truncatula tiene características interesantes, con un hipófisis multicelular distintivo, un suspensor endoployploid y transferencia de células basales 8. La embriogénesis somática (SE) se utiliza comúnmente para la regeneración de plantas 12. En el modelo de leguminosas M. truncatula, la línea de semillas Jemalong 2HA (2HA) se ha desarrollado a partir de la matriz Jemalong tener altas tasas de embriogénesis somática 13. El número de embriones producidos recientemente se ha incrementado sustancialmente por la adición tanto de ácido giberélico (GA) y ácido abscísico (ABA) al medio de largo establecido 14. En este caso, GA y actuar sinérgicamente ABA, que es inusual dado que GA y ABA generalmente actúan antagónicamente 14. Los embriones producidos a partir de callos se desarrollan en la superficie que permite la etapa de la embriogénesis a ser determinada fácilmente Visually cosechado y fácilmente. Tener cerca de líneas isogénicas que son embriogénico (2HA) y no embriogénico (Jemalong) facilita la investigación de la embriogénesis somática y que tiene tanto in vivo como sistemas in vitro proporciona diferentes posibilidades experimentales. La comprensión de los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo embrionario es esencial para la comprensión de semillas y desarrollo de la planta. En las legumbres, como en otras dicotiledóneas, son los cotiledones del embrión que almacenan los productos que se utilizan para la nutrición humana. Embriogénesis temprana implica la división de células, y los patrones de embriones correcta. En aproximadamente 8 días después de la fecundación, el M. truncatula embrión alcanza etapas tempranas de cotiledones. La caracterización morfológica no se indica exactamente por día después de la fecundación en condiciones de invernadero. Por lo tanto, un enfoque estandarizado eficiente para indicar la etapa de embriones en desarrollo es valioso en el estudio de la genética Regulación de principios de la embriogénesis cigóticos. En este trabajo, ofrecemos dos protocolos estandarizados para recoger embriones en desarrollo para estudios biológicos de la embriogénesis en el modelo de leguminosas M. truncatula. El primero es recoger embriones cigóticos asociando la embriogénesis y pod morfología mientras que la segunda es la embriogénesis somática a través de explantes de hoja de cultivo para proporcionar los números de embriones grandes de fácil acceso.

<table><tbody><tr><td>Medio P4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Utilice Sigma-Aldrich Chemicals u otro proveedor</td></tr><tr><td>de</td><td></td><td></td><td></td>grado analítico Sales principales</tr><tr><td>Sales menores</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitaminas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bacto Laboratories</td><td>214010</td><td>Bacto agar</td></tr><tr><td>Hormonas vegetales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1- Ácido naftalenacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>Disolver en una pequeña cantidad de 1 M de NaOH</td></tr><tr><td>Ácido abscísico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td>Disolver en una pequeña cantidad de 1 M de NaOH</td></tr><tr><td>6-Benzilaminopurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3274</td><td>Disolver en agua MQ con calentamiento y unas gotas 1N HCl</td></tr><tr><td>Ácido giberélico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7645</td><td>Disolver en una pequeña cantidad de etanol</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de disección</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>O similar</td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Zeiss</td><td>Axiophot</td><td>O similar, con óptica adecuada</td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRc</td><td>O similar</td></tr><tr><td>Hojas</td><td></td><td></td><td></td>esterilizantes</tr><tr><td>Tapón de rosca de 250 mL Recipiente de policarbonato con tapa de polipropileno</td><td>SARSTEDT</td><td>75.9922.519</td><td>Esterilizable en autoclave</td></tr></tbody></table>

protocolos para la obtención de embriones somáticos y cigóticos para el estudio de la regulación del desarrollo embrionario temprano en el modelo de leguminosas<em&gt; medicago truncatula</em

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

La embriogénesis temprana a partir de una sola célula cigoto pasa a través de una rápida división celular y la morfogénesis, y se caracteriza morfológicamente por etapas pre-globular, globulares, corazón, de torpedos y de cotiledones. Este desarrollo progresivo está bajo la regulación estricta de una red molecular compleja. La recolección de suficientes embriones tempranos en una etapa similar de desarrollo es esencial para la investigación de la regulación celular y molecular de la embriogénesis temprana. Esto no es directo desde la embriogénesis temprana sufre morfogénesis rápido en un corto periodo de tiempo, por ejemplo 8 días para Medicago truncatula para llegar al estadio de cotiledones temprano. Aquí, abordamos el tema por dos enfoques. El primero establece una vinculación entre el desarrollo del embrión y la morfología pod en ayudar a indicar la etapa del embrión cigóticos. Esto se basa sobre todo en el número de espirales de la vaina y el desarrollo de las espinas. Una forma alternativa para complementar la in vivo sos estudios es a través de explantes de hoja de cultivo para producir embriones somáticos. El medio incluye una combinación de hormonas inusual - una auxina (ácido 1-naftalenacético), una citocinina (6-bencilaminopurina), el ácido abscísico y ácido giberélico. Las diferentes etapas se pueden discernir que crece fuera del callo sin disección.

Para embriogénesis diferentes estructuras vaina cigóticos correspondientes a las diferentes etapas de embriones se muestra en la Figura 1A - F, mientras que las diferentes etapas de embriones se muestran en la Figura 2A - F. Mediante la selección de las vainas en la misma etapa, las muestras de óvulos que son bastante uniforme puede obtenerse (Figura 3A). Mediante el uso de RT-qPCR embrión genes específicos se pueden detectar fácilmente...

El objetivo es ilustrar que el modelo de leguminosa Medicago truncatula puede utilizarse fácilmente para investigar la regulación de la embriogénesis temprana de plantas para complementar el modelo de Arabidopsis no leguminosa. La morfología de las vainas está relacionada con las etapas de embriogénesis cigótica y también se proporciona un protocolo para recolectar embriones mediante cultivo de tejidos.

Protocolos para la obtención de embriones somáticos y cigóticos para el estudio de la regulación del desarrollo embrionario temprano en el Modelo de Leguminosas<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

El objetivo general de los siguientes procedimientos es demostrar cuántos embriones de cargo tula pueden obtenerse en diferentes etapas de desarrollo para investigar la regulación genética de la embriogénesis en plantas; esto puede lograrse vinculando la morfología de la vaina con las distintas etapas de desarrollo del embrión zigótico, y mediante el cultivo in vitro de explantes foliares para obtener embriones somáticos en las diferentes etapas. En última instancia, la PCR cuantitativa y la beta-glucuronidasa pueden utilizarse para evaluar la expresión génica durante la embriogénesis en etapas de desarrollo específicas de interés. Las ventajas de estas técnicas son que no se requiere etiquetar flores individuales para los experimentos in vivo, y que los procedimientos in vitro están optimizados, proporcionando enfoques experimentales complementarios.La demostración visual del procedimiento de cultivo es importante porque permite seguir con mayor precisión los detalles de las manipulaciones. Wang ing realizará la demostración del procedimiento in vivo, mientras que Kim Nolan realizará la demostración del procedimiento in vitro. Para facilitar el desarrollo del embrión cigótico, perfore la superficie de las cubiertas seminales de semillas procedentes de una planta trinocular Monte cargo y remoje las semillas durante la noche, completamente cubiertas de agua.Al día siguiente, siembre tres semillas en cada una de 10 macetas de 15 centímetros de diámetro, utilizando una mezcla para macetas, y traslade las macetas a un invernadero. Cultive las plantas bajo un fotoperíodo de 14 horas con una temperatura diurna-nocturna de 23 a 19 grados Celsius, conservando las plántulas más sanas tras la germinación de modo que quede una planta por maceta, y rodee las plántulas con una tutora para que los tallos de las plantas puedan trepar cuando aparezcan las vainas. Recolecte en las etapas apropiadas descritas en la tabla uno y la figura uno para obtener la etapa deseada de desarrollo embrionario temprano.A continuación, utilice pinzas para aislar los embriones de las vainas. Alternativamente, para una microscopía más refinada, aclare completamente en solución de Hoyer; las etapas de los embriones se pueden confirmar mediante el análisis de imágenes de los embriones bajo un microscopio compuesto estándar. Luego, recoja el número de embriones necesarios para el experimento a partir de la región central de la vaina y almacénelos a la temperatura adecuada para su análisis posterior en el desarrollo de embriones somáticos.En el cultivo in vitro, recolecte los folíolos del último hoja casi completamente expandida de un tallo en elongación de un cultivar de tran atula que sea capaz de formar embriones fácilmente en cultivo. Mantenga las hojas en una toalla de papel húmeda dentro de un recipiente de cultivo para evitar la deshidratación. Luego, trabajando en una cabina de seguridad biológica esterilizada con UV, coloque las hojas dentro de la bola de malla de un infusor de té de resorte para autoclave.Un infusor sumergido en etanol al 70 % en un frasco de 250 mililitros con tapón roscado esterilizado en autoclave. Después de 30 segundos, retire el tejido foliar del recipiente de cultivo de policarbonato y luego sumerja el infusor en una solución de lejía diluida uno a ocho durante 10 minutos. Con movimientos suaves y ocasionales de agitación, agite suavemente el recipiente y deseche el exceso de agua.Luego enjuague el infusor. Una vez más con agua desionizada fresca en una olla nueva. Ahora use pinzas estériles para transferir las hojas del infusor de té a un cultivo fresco, una olla con agua destilada desionizada estéril, y coloque la tapa estéril enroscando.Luego enjuague las hojas mediante inversión y agitación suave. A continuación, permita que los folíolos floten sobre el agua estéril para colocar los implantes. Recorte los bordes de los folíolos individualmente esterilizados utilizando técnica estéril.Luego, corte el rectángulo restante en dos o tres explantes rectangulares de ocho a diez por tres a cinco milímetros, con la nervadura media en el centro de cada explante X. Seis explantes X por medio de cultivo sólido en agar en placas de Petri de nueve centímetros de diámetro, con el sello ABA hacia abajo para mantener la orientación habitual de la hoja.Luego, selle las placas de Petri con perfil y incube las placas en la oscuridad a 28 grados Celsius en una habitación con temperatura controlada. Después de tres semanas, utilice una espátula y pinzas de acero inoxidable estériles para subcultivar los explantes de los orificios en diferenciación en medio fresco. Los primeros embriones deben observarse en aproximadamente cuatro semanas, ya que ocurre el callo y el callo supera el tamaño del explante más grande mostrado aquí.Transfiera únicamente el 50 % del callo individual al realizar el subcultivo en medio fresco. Finalmente, utilice un microscopio estereoscópico para recolectar las diferentes etapas de embrión durante un período de incubación de cuatro a ocho semanas, procesando los explantes de acuerdo con los objetivos experimentales. Después de cosechar los embriones cigóticos como se acaba de demostrar, en pasos posteriores se pueden emplear hibridación en C dos o otras estrategias adecuadas; de especial interés, como se muestra en estas imágenes, puede observarse la distinción entre SSIS y Spencer siguiendo los explantes X dispuestos en placa.Entre las semanas cuatro y ocho, se pueden localizar y seleccionar embriones somáticos en etapas definidas para su análisis inmediato. Por ejemplo, estos datos ilustran cómo los embriones en la etapa temprana de Olein exhiben la expresión de un tipo de gen medicago Tula eoin, pero no de otro. Una ventaja particular del sistema de embriones somáticos es que la transformación del callo puede llevarse a cabo sin necesidad de regenerar una planta completa.De hecho, como se demuestra aquí, la beta-glucuronidasa puede utilizarse para visualizar la expresión génica en las diferentes etapas de la embriogénesis. Después de ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo seleccionar y diseccionar la vaina para obtener Andrés.También debería tener un buen conocimiento sobre cómo preparar y sembrar explantes estériles para la embriogénesis somática tras su desarrollo. Estas técnicas han permitido investigar la regulación transcripcional de las etapas tempranas de la embriogénesis en relación con el crecimiento del embrión, su desarrollo y el almacenamiento de nutrientes.

protocols-for-obtaining-zygotic-somatic-embryos-for-studying

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se presenta un método eficiente y simple para aislar embriones en las primeras etapas de desarrollo...

Aislamiento eficaz y rápida de los embriones en etapa temprana de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semillas

El pinzón cebra (Taeniopygiaguttata) es un valioso organismo modelo; sin embargo, las primeras etapas del desarrollo del pinzón cebra no han sido ampliamente estudiadas. El protocolo describe cómo diseccionar embriones tempranos para aplicaciones moleculares y de desarrollo.

La disección y análisis de aguas abajo de Zebra Finch embriones en etapas tempranas del desarrollo

Los métodos que producen embriones morphant son esenciales para estudiar los mecanismos de desarrollo y redes reguladoras de genes. La estrella de mar patiria miniata es un sistema modelo emergente para estos estudios. Aquí se presenta un protocolo para la obtención de gametos, la producción de cultivos de embriones, y la rápida microinyección de cigotos de esta especie.

Un método para la microinyección de Patiria minata Los cigotos

Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Este protocolo describe un método para la observación de embriogénesis en Arabidopsis vía separación de óvulo, seguido por la inspección de la formación de patrones de embrión bajo un microscopio.

Un método para la caracterización de embriogénesis en Arabidopsis

Este manuscrito describe una en vitro óvulo cultivo método que permite la proyección de imagen de células vivas de Arabidopsis cigotos y embriones. Este método se utiliza para visualizar la dinámica intracelular durante la polarización del cigoto y la especificación de destino celular en el desarrollo de embriones.

In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

Los genes morfogénicos de las plantas se pueden utilizar para mejorar la transformación genética de los genotipos recalcitrantes. Aquí se describe un protocolo de transformación genética mediada por Agrobacterium(QuickCorn) para tres importantes líneas de maíz público endogámico.

Agrobacterium-Transformación de embriones inmaduros mediados de líneas endogámicas de maíz recalcitrante utilizando genes morfogénicos

Este artículo establece una línea para suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad de embriones de ratón gastrulados para la secuenciación de células individuales y núcleos.

Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

Describimos métodos para visualizar la transcripción naciente durante la activación del genoma cigótico en células individuales durante la embriogénesis temprana.

Visualización de la activación del genoma cigótico en células individuales de embriones tempranos

Describimos un método de constricción física para producir mini embriones a partir de embriones de Xenopus laevis de 1 célula.

Manipulación física para generar embriones de Xenopus Mini

Aprende a obtener embriones somáticos y cigóticos de Medicago truncatula para estudiar la regulación genética de la embriogénesis temprana. Este protocolo combina morfología de vainas con técnicas de cultivo de tejidos.

Protocolos para la obtención de embriones somáticos y cigóticos para el estudio de la regulación del desarrollo embrionario temprano en el Modelo de Leguminosas Medicago truncatula (Video) | JoVE Journal

Protocolos para la obtención de embriones somáticos y cigóticos para el estudio de la regulación del desarrollo embrionario temprano en el Modelo de Leguminosas

Explorar más videos