Un método simple y barato para la Determinación de la sensibilidad al frío y Adaptación en ratones

El objetivo general de este procedimiento es medir la capacidad de respuesta al frío de los ratones. Esto se logra enfriando o calentando primero el vidrio a la temperatura deseada. El segundo paso es aclimatar a los ratones hasta que estén en reposo.

El tercer paso es comprimir el polvo de hielo seco en una pastilla en una jeringa. El paso final es probar a los ratones usando la peltoma de hielo seco y un cronómetro para medir la latencia de retirada. En última instancia, el ensayo de siembra en frío se utiliza para medir la respuesta al frío y la adaptación en ratones que se comportan libremente.

La principal ventaja de nuestro ensayo sobre los ensayos existentes actualmente, como la prueba de acetona y la prueba de placa fría, es que podemos probar tanto la hipersensibilidad como la analgesia al inicio del estudio en una variedad de circunstancias ambientales. Aunque este método puede proporcionar información sobre la capacidad de respuesta al frío de los ratones. También se puede utilizar en otros sistemas, como el mono, la rata y los humanos. La demostración del procedimiento correrá a cargo de Daniel Brenner, un estudiante de posgrado en mi laboratorio.

Después de limpiar la superficie del vidrio, asegure la sonda de termopar de filamento tipo T a la superficie en el medio de la placa de vidrio con cinta de laboratorio. Coloque los recintos de los animales en la placa de vidrio en una sola línea a lo largo del medio. A continuación, pase la sonda de termopar a través del recinto central del animal y conéctela al registrador de datos.

Encienda el registrador de datos y desactive la función de apagado automático. Conecte el registrador de datos a la computadora con el cable provisto. Separe los recintos de los animales con inserciones negras para evitar interacciones visuales entre los ratones y coloque espejos debajo del vidrio para permitir la visualización de la parte inferior de los recintos.

Para comenzar la prueba, coloque cajas de aluminio en la placa de vidrio a cada lado del animal, recintos a una distancia fija. Si la prueba es a 30 grados centígrados, conecte los circuladores de agua caliente a las cajas de aluminio colocadas a 0,25 pulgadas de distancia del recinto de los animales. Llene las cajas con agua hasta la mitad mientras los orificios de drenaje están tapados.

Coloque los circuladores de manera que el agua caliente de las cajas de aluminio se drene directamente al depósito del circulador a cada lado. Deberá agregar agua a cada circulador. Una vez que las cajas de metal estén llenas, configure los circuladores a 45 a 60 grados centígrados y llene las cajas de aluminio con un flujo constante de agua caliente.

Cuando los vasos alcancen el rango de temperatura deseado, coloque los ratones en los recintos de la placa. Permita que los ratones se aclimaten al aparato y a la temperatura. Estos ratones se aclimatarán durante 2,5 horas.

Cuando se acerque al final del período de aclimatación, llene un cubo de hielo hasta la mitad con hielo seco y use un martillo o mazo para triturar el hielo seco hasta convertirlo en polvo. Hazlo fuera de la sala de comportamiento para evitar molestar a los ratones. A continuación, utiliza una cuchilla de afeitar o unas tijeras para cortar la parte superior de una jeringa de tres mililitros.

Luego use una aguja de calibre 21 para perforar dos juegos de tres orificios en lados opuestos de la jeringa para disminuir la presión generada por la sublimación mientras comprime el hielo seco en la sala de comportamiento, llene la cámara de la jeringa hasta la mitad con polvo de hielo seco. Sostenga el extremo cortado de la jeringa contra un objeto plano y comprima firmemente el polvo con el émbolo. Extienda la punta de la paleta de hielo seco comprimido más allá del borde de la jeringa.

Ahora, pruebe a esos ratones que tienen las cuatro patas en el vidrio y no se mueven, pero no están completamente dormidos. Usando los espejos para apuntar suave pero firmemente, presione el pellet plano al ras contra la superficie del vidrio debajo de la pata trasera del ratón. Al mismo tiempo, presione iniciar en un temporizador.

Cuando el mouse se aleje del vidrio enfriado, ya sea vertical u horizontalmente, detenga el temporizador y retire la pellets de hielo seco. Sin embargo, si el ratón mueve muy brevemente la pata y luego la devuelve a la superficie de enfriamiento, continúe cronometrando y estimulando hasta que el ratón se aleje permanentemente. Si el ratón no se aleja del cristal enfriado, detenga el estímulo después de 20 segundos.

Repita este procedimiento de prueba hasta que se recojan al menos tres valores en cada pata del animal para probar ratones a 17 grados centígrados. Repita el experimento como se acaba de mostrar, pero en lugar de llenar las cajas de aluminio con agua caliente, use hielo húmedo y coloque las cajas aproximadamente a 0.25 pulgadas de distancia de los recintos para probar a los ratones. A 12 grados centígrados, se utiliza hielo seco, pero las cajas se colocan a 1,25 pulgadas de distancia de los recintos.

Este protocolo alternativo prueba a los ratones a medida que la temperatura de la placa disminuye en lugar de después de que se estabiliza. Esto nos permite probar la adaptación de los ratones a medida que ocurre después de configurar el aparato. Al igual que antes, realice el experimento como se indicó anteriormente para tomar medidas a temperatura ambiente.

Una vez que se han medido las latencias de referencia a temperatura ambiente. Usando el procedimiento mostrado anteriormente, llene las cajas de aluminio vacías con hielo seco y colóquelas a 1.25 pulgadas de los gabinetes a cada lado. Finalmente, repita el experimento para tomar medidas de latencia a medida que la placa de vidrio se enfría.

Tomar medidas con la mayor frecuencia posible. Este gráfico muestra la latencia de extracción promedio para ratones a partir de 12 grados Celsius, 17 grados Celsius, 23 grados Celsius o 30 grados Celsius. Las latencias de extracción son consistentes en todas las temperaturas.

Los efectos analgésicos se pueden medir utilizando el ensayo de siembra en frío, como se muestra aquí. La inyección subcutánea de 1,5 miligramos por kilogramo de morfina aumenta la latencia de retirada de los ratones 30 minutos después de la inyección, medida por una prueba post-hoc de innova de Bonferroni de dos vías 60 minutos después de la inyección. No hay diferencia significativa entre la morfina inyectada y la solución salina inyectada.

Aquí también se puede medir la hipersensibilidad de los ratones. La inyección intraplantadora de 10 microlitros de adyuvante fros completo disminuye significativamente la latencia de extracción de los ratones dos y tres horas después de la inyección, medida por una prueba post-hoc de innova bidireccional con bonferroni. Los mismos ratones recibieron inyecciones subcutáneas de morfina a las cuatro horas y todas las latencias de retirada a las 4,5 horas fueron significativamente más altas en comparación con las tres horas medidas por una prueba única de innova con done's post hoc.

Una vez que la morfina se metabolizó a las 5,5 horas después de la inyección, los ratones a los que se les inyectó CFA todavía tenían latencias de extracción más bajas que los ratones inyectados con solución salina, según lo medido por una inova de dos vías con la prueba post-hoc de Bonferroni. La adaptación a los cambios ambientales de enfriamiento se puede medir en tiempo real con este ensayo. Los ratones de tipo salvaje tienen la misma latencia de extracción a medida que se enfría la placa de vidrio, lo que sugiere que se adaptan a las temperaturas de enfriamiento más rápido de lo que se puede medir con el CPA, que no tuvo diferencias significativas entre ningún grupo.

Sin embargo, cuando a los ratones se les ha inyectado U 7 3 1 2 2 para bloquear la hidrólisis PIP dos, su latencia disminuye a medida que disminuye la placa de la temperatura, lo que sugiere una adaptación deteriorada. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas, incluido el tiempo de aclimatación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la sensación de frío y la adaptación en ratones despiertos que se comportan libremente. No olvide que trabajar con hielo seco puede ser excepcionalmente peligroso y que debe garantizar una ventilación adecuada y esa holgura de aire durante este método.