Name: Un procedimiento de craneotomía lateral grande para el campo amplio de mesoescala imágenes ópticas de la actividad cerebral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a realizar una craneotomía lateral grande en ratón para obtener imágenes ópticas de campo amplio de la actividad cerebral. Esta técnica permite estudiar la dinámica neural entre células y circuitos cerebrales en tiempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por una Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) Descubrimiento de Grant # 40352, Campus de Alberta por Presidente del Programa Innovación, Programa de Investigación de Alzheimer Alberta a MHM, y CRSNG crear en BIF beca de doctorado y AIHS beca de postgrado en MK. Agradecemos a Pu Min Wang para el desarrollo de este protocolo y para el entrenamiento quirúrgico y Behroo Mirza Agha y Di Shao para la cría.

<html> El siguiente protocolo sigue la Universidad de Lethbridge Cuidado de Animales (ACC) directrices, y se lleva a cabo de acuerdo con las normas del Consejo Canadiense de los Animales (CCAC). 1. Preparación <ol><li> Para los períodos de estudio prolongados, autoclave todos los suministros quirúrgicos abiertos y asegurar que se mantiene la esterilidad durante toda la cirugía. Si se requieren múltiples cirugías, autoclave entre cirugías. </li><li> Asegúrese de que hay un montón de tampón de cerebro en la mano (por lo menos 50 ml). La solución está compuesta de cloruro de 134 mM de sodio, de potasio 5,4 mM, 1 mM cloruro de magnesio hexahidratado, 1,8 mM de dihidrato de cloruro de calcio, y 5 mM de HEPES de sodio, pH equilibrado a 7,4 con cloruro de 5 M de hidrógeno. </li><li> Coloque el ratón en una cámara de inducción y anestesiar con 3 - 4% de isoflurano. Siga con 1,0 - 2,0% de isoflurano para el mantenimiento durante la cirugía. Además de reducir hasta un mínimo de 0,4 a 0,8% durante la exploracións = &quot;xref&quot;&gt; 5, 13, 14, 15, proporcionado anestesia adecuada se mantiene. Estos bajos niveles de anestesia requieren la supervisión vigilante y frecuente del ratón (aproximadamente cada 5 min) para asegurar que permanece arrefléxica a los estímulos dolorosos. NOTA: La deshidratación puede llegar a ser problemática debido a la alta proporción de superficie a volumen del ratón y agravada por el uso prolongado de isoflurano. <ol><li> Utilice inyecciones subcutáneas de solución salina, 0,1 ml por 10 g de peso corporal, cada 1 - 2 h. Cuando adecuadamente hidratado, el ratón orinar una vez cada 1 - 2 h. </li></ol></li><li> Vigilar de cerca el ratón para asegurar la anestesia consistentes a lo largo de la cirugía y de imagen. No deje desatendido el ratón y cuidar de que nunca recupere la conciencia. </li><li> Transferir el ratón anestesiado a la cabeza porta-configuración y el lugar en una almohadilla de calefacción termo-regulación ajustado a 37 ° C. Asegurar los teet superioresh en un soporte de los dientes. </li><li> Girar la cabeza del ratón hacia la izquierda aproximadamente 30 ° para exponer el lado lateral derecho de la cabeza y asegure la cabeza del ratón con el extremo romo de barras del oído (Figura 1A). </li><li> Aplicar pomada oftálmica para evitar el secado de la córnea. </li><li> Para reducir el edema cerebral, inyectar dexametasona (4 mg / kg) por vía intramuscular. </li><li> Limpiar la piel sobre el área quirúrgica con hisopos de algodón humedecido en 4% de clorhexidina (3 veces) y 70% de etanol (3 veces). Use cada hisopo de algodón sólo una vez. </li><li> Don guantes quirúrgicos y cubrir el animal con una envoltura de plástico adhesivo. Proporcionar anestésico local mediante la inyección de lidocaína (8 - 10 mg / kg; 2% epinefrina) por vía subcutánea sobre el sitio de la craneotomía. Espere entre 3 - 5 min para que el fármaco sea absorbido en el tejido. </li></ol> 2. Extracción de la piel y retraer el músculo del cráneo <ol><li> Realizar casi todos estos procedimientos mientras se visualiza el cráneo bajo unamicroscopio de disección (por ejemplo, 0,7 - 4.5X de potencia, dependiendo de la situación). </li><li> Levante la piel de 1 mm a la izquierda de la línea media (justo detrás de la oreja) con unas pinzas y hacer una pequeña incisión horizontal con tijeras quirúrgicas. </li><li> Hacer un 5 - corte lateral 6 mm hacia la oreja derecha, y luego se corta hacia el extremo rostral de la cabeza. </li><li> En el punto de incisión inicial, insertar las tijeras y cortar 10 mm rostral. </li><li> Cortar la piel alrededor de la oreja derecha y cerca del ojo derecho para exponer el lado derecho del cráneo y el músculo temporal. Asegúrese de que la parte más ancha de la zona expuesta es al menos 7 mm. Recorte la piel aún más si el área quirúrgica tiene que ampliarse. </li><li> Fijar la piel alrededor de la incisión poniendo unas gotas de pegamento de cianoacrilato de butilo entre el cráneo y la piel. Asegúrese de que el tejido ha sido previamente secado con aplicadores con punta de algodón o tejidos laminados para aumentar la eficacia del adhesivo. </li><li> El uso de un hisopo de algodón, frotar la superficiedel cráneo en un movimiento circular para eliminar el periostio del cráneo. Asegúrese de que no quede ninguno por secado del cráneo por completo. </li><li> Usando tijeras de primavera y fórceps, separar el músculo temporal del cráneo; cortar y retraer el músculo lateralmente hasta alcanzar el hueso escamoso (Figura 1C). Tenga mucho cuidado de no dañar la vena temporal superficial que corre a lo largo del nivel del hueso escamoso cerca del ojo, de lo contrario podría ocurrir una hemorragia. </li><li> Control de sangrado con espuma de gel pre-empapado en tampón cerebro. Para una hemorragia seria utilizar un cauterizador de calor. Caída de butil cianoacrilato pegamento en los puntos de hemorragia después del tratamiento con el cauterizador calor. Asegúrese de que la zona se seca previamente mediante el uso de aplicadores con punta de algodón o tejidos laminados para aumentar la eficacia del adhesivo. </li></ol> 3. La craneotomía NOTA: El cirujano debe seguir siendo diligente durante la extracción del cráneo yDura para evitar complicaciones innecesarias. pasos para solucionar problemas se incluyen si se presenta complicaciones. <ol><li> Marcar la ubicación de bregma ya sea con un marcador de punta fina o cortar una cinta pequeña pieza triangular y señalar una esquina en bregma (Figura 2A) para orientar las regiones cerebrales subyacentes. </li><li> Antes de la colocación de la placa de cabeza asegurar el cráneo esté completamente seco. El cráneo se transmitirá rápidamente seca después de la aplicación de la espuma de gel empapada en tampón cerebro, si se necesita más de secado, utilice hisopos con punta de algodón. Este paso es crucial para la fijación placa de cabeza (Figura 1B). NOTA: Si hay periostio izquierda en el cráneo, o si el cráneo no está seca antes de pegar en la placa de cabeza, es probable que se desprenda. Si esto ocurre, retire con cuidado la placa de cabeza y empezar de nuevo. El sangrado puede ocurrir durante este proceso; permitir que unos pocos minutos para que se coagule, y luego eliminar suavemente. No se recomienda que este proceso se repitió dos veces más. </li> &lt;li&gt; Aplicar pegamento de cianoacrilato de etilo alrededor del borde inferior de la placa de cabeza 16, y la cola de la placa de cabeza por encima del área de craneotomía (Figura 1D y figura 2A). </li><li> Llenar el espacio de abertura entre la placa y la cabeza del cráneo con cemento dental dejando sólo el área expuesta craneotomía. Esperar a que el cemento dental para secar y endurecer, típicamente de 5 - 10 min (Figura 2B). <ol><li> Una vez ajustado el cemento, llenar brevemente el bien con tampón de cerebro y permitir a remojo durante 3 - 5 min. Utilice un tejido laminado para eliminar el tampón de cerebro antes de perforar (Figura 2C). </li></ol></li><li> Esquema de la zona quirúrgica mediante la ligera anotando la superficie del cráneo con un taladro dental. Use un taladro neumático (ajustado al máximo de 20 PSI), con un FG ¼ rebabas, y controlado con un pedal de velocidad variable. </li><li> trazar suavemente la perforación a lo largo de la puntuación original de profundizar en ella, esegurar el taladro no penetra a través del cráneo en el cerebro (Figura 2D). Por turnos cada pocos minutos entre la perforación y frotando la superficie del cráneo con los tejidos laminados humedecidos. Esto reducirá calentamiento y secado del cráneo de la fricción mecánica y la exposición prolongada. NOTA: El cráneo se transmitirá rápidamente seca después de la aplicación de la espuma de gel húmedo. Si se necesita más de secado, utilice hisopos con punta de algodón. Precaución: El cráneo es irregular en espesor. Por ejemplo, la cresta parietal-temporal es el área más gruesa, mientras que las regiones del cráneo cerca de la línea media y monumentos escamoso son relativamente delgadas. </li><li> Durante la perforación, comprobar periódicamente si el pandeo del cráneo presionando suavemente sobre ella con fórceps o la broca de perforación que no se mueve. Cuando el hueso comienza a ceder, dejar de perforación y sumerja toda la ventana en tampón cerebro. NOTA: Si la sangre se precipita fuera de un área, se puede sugerir que la duramadre se ha dañado. Si este es el caso, colocar una semi-húmedo de espuma de gel sobre el área y trato de absorber la sangre mientras se aplica una presión suave a la espuma de gel con un hisopo de punta de algodón. </li><li> Espere por lo menos 5 min antes de la retirada del cráneo para ablandar el hueso y para reducir la posibilidad de la duramadre que se pega al hueso, haciendo que el proceso de eliminación de cráneo más fácil. </li><li> Realizar el proceso de eliminación del cráneo, mientras que el cráneo se sumerge en tampón cerebro. NOTA: Si una porción del cráneo permanece obstinadamente unido, una hoja de bisturí # 11 se puede utilizar para marcar suavemente el cráneo. Tenga mucho cuidado para no romper la hoja a través del cráneo y en el cerebro. </li><li> Comenzando desde el borde anterior, palanca suavemente el cráneo flojo de la duramadre el uso de fórceps. NOTA: Si una pequeña cantidad de sangrado se produce durante el proceso de eliminación cráneo, eliminar el tampón con una pipeta de transferencia o una jeringa, y luego vuelva a colocar con tampón nuevo. </li><li> Una vez que el hueso está suelto y &quot;flotantes&quot; en la duramadre, sujete firmemente el hueso con unas pinzas y levantar el hueso dela duramadre. Asegúrese de que el hueso no penetra en el cerebro. </li><li> Para controlar el sangrado, el rollo de esquina de un tejido en un punto y eliminar la mayor parte de la memoria intermedia del pozo craneal. Aplicar rápidamente espuma de gel, pre-empapados en tampón, a la zona de sangrado mientras que la adición de una presión muy ligera con un hisopo de punta de algodón. NOTA: El sangrado por lo general viene desde el borde del hueso o la superficie de la duramadre; ambos casos son normales y el sangrado se detendrá rápidamente si no hay vasos sanguíneos principales están dañados. Si el sangrado continúa, la sangre puede llenar toda la ventana, formando una hoja de coágulo sobre la superficie de imágenes. <ol><li> Para quitar la hoja de coágulo, cuidadosamente recoger piezas de sangre coagulada de la zona de formación de imágenes mientras se deja el coágulo de sangre intacta alrededor de la fuente del vaso sanguíneo roto. Tenga cuidado de no eliminar el coágulo de sangre procedente de la fuente de sangrado ya que esto puede causar aún más la pérdida de sangre. Irrigar la superficie del cerebro con tampón de cerebro para eliminar cualquier sangre. </li><li> Tenga cuidado de no tocar ladelicado tejido cerebral o la adición de material extraño al cerebro; repetir hasta que el sangrado se ha detenido, durante aproximadamente 2 - 5 min (Figura 2E). NOTA: En este punto, la craneotomía está listo para la preparación de la ventana craneal (ver paso 5). Si es necesario, retire la duramadre antes de implantar la ventana craneal (ver paso 4). </li></ol></li></ol> 4. Eliminación Dura NOTA: la eliminación Dura requiere extremo cuidado y puede tomar más de 15 minutos. <ol><li> Dibuje el exceso de tampón de la craneotomía. Mientras se mantiene una superficie húmeda, agarra un pequeño trozo de duramadre con fórceps y rasgar suavemente la duramadre. </li><li> El uso de fórceps y tijeras de primavera de rasgar y cortar la duramadre con suavidad. </li><li> Caer más memoria intermedia del cerebro en la superficie del cerebro para flotar la duramadre y evitarlo separado del cerebro. Continúe hasta que todos duramadre se retira del sitio ventana del cráneo. Cuando se realiza correctamente el cerebro parece ser muy limpio, con distinta blvasos OOD y sin manchas (comparar Figura 2E con 2F). Precaución: Algunas áreas de la duramadre están asociadas a las pequeñas arteriolas en la superficie del cerebro (por ejemplo, cerca de la línea media proximal a la zona de asociación parietal), y la eliminación de tales pueden romperse la arteriola. En tales casos, puede ser mejor dejar un pequeño trozo de duramadre intacta sobre la parte superior de la arteriola. El variador de velocidad no puede penetrar esa zona pequeña, pero esto se prefiere tener hemorragia mayor. </li><li> Fix la superficie del cerebro en agarosa tan pronto como sea posible para minimizar el movimiento de pulsación y para prevenir una mayor hinchazón (ver paso 5). </li></ol> 5. Preparar craneal ventana <ol><li> Pulverizar la cubierta de vidrio con 70% de etanol y el uso de un bote de aire para secar suavemente. Asegúrese de que el cristal está completamente limpio, sin manchas o polvo presente. </li><li> Preparar 1,3% de agarosa por calentamiento de 200 mg de polvo de agarosa disueltos en 15 ml de tampón de cerebro. Ajuste el microwAVE a alta y el calor durante 10 - 15 s a la vez, se agita suavemente en el medio, hasta que se disuelve todo el agar. Nota: Asegúrese de que no burbujas o partículas están presentes, ya que estos interfieren con formación de imágenes. </li><li> Coloque un termómetro en la agarosa caliente y enfriar la agarosa hasta justo encima de la temperatura de solidificación (~ 40 ° C). NOTA: correr agua fría sobre el exterior del recipiente de agarosa puede acelerar el proceso de enfriamiento. Remover suavemente de forma continua para asegurar que no burbujas o partículas están presentes. </li><li> Inmediatamente antes de aplicar el agar, eliminar el tampón cerebro del pozo craneal. Elaborar la agarosa con una pipeta de transferencia y soltar la agarosa directamente sobre el cerebro. colocar rápidamente la hoja de la cubierta sobre la superficie y fijación de la hoja de la cubierta con agarosa gotas en las esquinas. </li></ol> 6. La eutanasia NOTA: los cirujanos En nuestra experiencia, este procedimiento toma experimentado al menos 3 - 4 cirugías de práctica para alcanzar más de un 90%tasa de éxito. Menos cirujanos experimentados pueden requerir aún más práctica. Durante la craneotomía o durotomía, el cerebro puede sufrir daños, tales como si los punzones de perforación a través del hueso en el cerebro. Algunos daños menores en el borde de la craneotomía puede ser permisible. Sin embargo, si el cerebro no se ve &quot;limpia&quot; con los vasos sanguíneos no dañados de color rojo brillante y la corteza blanca, puede necesitar ser terminado el experimento. Los ejemplos de preparaciones pobres son aquellos con los vasos sanguíneos muertos, o cuando la corteza está marcado con vasos sanguíneos rotos o dañados. Si alguno de estos síntomas están presentes, el experimento improbable dió datos de alta calidad. Si la cirugía / experimento tuvo éxito o no, con humanidad sacrificar al ratón en la realización del experimento. <ol><li> Profundamente anestesiar con al menos 3,5% de isoflurano. A continuación, dar una inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio a 300 mg / kg. Idealmente, si la aguja se inserta en el hígado, la muerte será muy rápida (&lt;1 min). </li><li> Si se requiere perfusión, verificar que el animal está profundamente anestesiados antes de proceder (véase el paso 1.3). </li><li> Alternativamente, si no se requiere la perfusión, espere un mínimo de 5 minutos y compruebe que el ratón está muerto. Confirmar la ausencia de la respiración, los latidos del corazón, así como una falta de retirada del dolor y los reflejos corneales. También, observar por pálida coloración azul / blanco de las extremidades y el oscurecimiento de los vasos sanguíneos más de la corteza. </li></ol>

<ol><li>Sigler, A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+rapid+redistribution+of+sensory-evoked+depolarization+through+existing+cortical+pathways+after+targeted+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging rapid redistribution of sensory-evoked depolarization through existing cortical pathways after targeted stroke in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11759-11764 (2009).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (11), 874-885 (2004).</li>
<li>Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+basis+for+the+robust+distribution+of+blood+to+rodent+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12670-12675 (2010).</li>
<li>Mohajerani, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+cortical+activity+alternates+between+motifs+defined+by+regional+axonal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous cortical activity alternates between motifs defined by regional axonal projections.</a> Nat Neurosci. 16 (10), 1426-1435 (2013).</li>
<li>Mohajerani, M. H., McVea, D. A., Fingas, M., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirrored+bilateral+slow-wave+cortical+activity+within+local+circuits+revealed+by+fast+bihemispheric+voltage-sensitive+dye+imaging+in+anesthetized+and+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mirrored bilateral slow-wave cortical activity within local circuits revealed by fast bihemispheric voltage-sensitive dye imaging in anesthetized and awake mice.</a> J Neurosci. 30 (10), 3745-3751 (2010).</li>
<li>Lippert, M. T., Takagaki, K., Xu, W., Huang, X., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+voltage-sensitive+dye+imaging+of+rat+cortical+activity+with+high+signal-to-noise+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Methods for voltage-sensitive dye imaging of rat cortical activity with high signal-to-noise ratio.</a> J Neurophysiol. 98 (1), 502-512 (2007).</li>
<li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (6), 449-463 (2006).</li>
<li>Kerr, J. N., Denk, W. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nrn/journal/v9/n3/full/nrn2338.html">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).</li>
<li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Eur J Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li>
<li>McVea, D. A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+imaging+reveals+dynamic+spatiotemporal+properties+of+cortical+activity+after+spontaneous+muscle+twitches+in+the+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye imaging reveals dynamic spatiotemporal properties of cortical activity after spontaneous muscle twitches in the newborn rat.</a> J Neurosci. 32 (32), 10982-10994 (2012).</li>
<li>Sweetnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+impairs+cortical+plasticity+and+functional+recovery+following+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diabetes impairs cortical plasticity and functional recovery following ischemic stroke.</a> J Neurosci. 32 (15), 5132-5143 (2012).</li>
<li>Yin, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+field+recordings+effectively+monitor+the+mouse+cortex+and+hippocampus+under+isoflurane+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo field recordings effectively monitor the mouse cortex and hippocampus under isoflurane anesthesia.</a> Neural Regeneration Research. 11 (12), 1951-1955 (2016).</li>
<li>Sharp, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+stimulus-evoked+cerebral+hemodynamics+in+the+awake+mouse+and+under+a+novel+anesthetic+regime%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of stimulus-evoked cerebral hemodynamics in the awake mouse and under a novel anesthetic regime.</a> Scientific Reports. 5, 12621(2015).</li>
<li>Kyweriga, M., Mohajerani, M. H. Optogenetics: Methods and Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKyweriga%2C+M+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Kianianmomeni, A. 1408, Humana Press Inc. 251-265 (2016).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrutzendler%2C+J+%22Imaging+in+neuroscience+and+development+%3A+a+laboratory+manual%22">Imaging in neuroscience and development : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
<li>Vanni, M. P., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscale+transcranial+spontaneous+activity+mapping+in+GCaMP3+transgenic+mice+reveals+extensive+reciprocal+connections+between+areas+of+somatomotor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mesoscale transcranial spontaneous activity mapping in GCaMP3 transgenic mice reveals extensive reciprocal connections between areas of somatomotor cortex.</a> J Neurosci. 34 (48), 15931-15946 (2014).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+High-Frequency+Mesoscale+Intracortical+Maps+Using+the+Genetically+Encoded+Glutamate+Sensor+iGluSnFR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR.</a> J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).</li>
<li>Chan, A. W., Mohajerani, M. H., LeDue, J. M., Wang, Y. T., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscale+infraslow+spontaneous+membrane+potential+fluctuations+recapitulate+high-frequency+activity+cortical+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mesoscale infraslow spontaneous membrane potential fluctuations recapitulate high-frequency activity cortical motifs.</a> Nat Commun. 6, 7738(2015).</li>
<li>Lim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Large-Scale+Cortical+Mapping+Using+Channelrhodopsin-2+Stimulation+in+Transgenic+Mice+Reveals+Asymmetric+and+Reciprocal+Relationships+between+Cortical+Areas%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">In vivo Large-Scale Cortical Mapping Using Channelrhodopsin-2 Stimulation in Transgenic Mice Reveals Asymmetric and Reciprocal Relationships between Cortical Areas.</a> Front Neural Circuits. 6, (2012).</li>
<li>Ferezou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+cortical+sensorimotor+integration+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of cortical sensorimotor integration in behaving mice.</a> Neuron. 56 (5), 907-923 (2007).</li>
<li>Mohajerani, M. H., Aminoltejari, K., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mini-strokes+produce+changes+in+interhemispheric+sensory+signal+processing+that+are+indicative+of+disinhibition+within+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted mini-strokes produce changes in interhemispheric sensory signal processing that are indicative of disinhibition within minutes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (22), E183-E191 (2011).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo innovador para una gran ventana craneal permite imágenes simultáneas sobre las áreas temporal y parietal de la corteza cerebral. Combinado con formación de imágenes ópticas, se puede ayudar a revelar la dinámica neurales dentro de las áreas corticales durante la actividad espontánea y estímulo-inducida. Este craneotomía expansiva también expone una gran extensión de la red vasculatura cortical, incluyendo el extremo proximal de la arteria cerebral media (MCA), permitiendo de imágenes in vivo<...

La craneotomía es un procedimiento estándar utilizado por los neurólogos para revelar una porción del cerebro. Desde los albores de la electrofisiología, la craneotomía ha permitido avances sin precedentes en el campo de la neurociencia. mapeo densa de la corteza cerebral con electrodos ha llevado a probar hipótesis experimentos y teorías basadas en estos mapas. Hemos entrado recientemente una nueva era en la que se está utilizando la craneotomía para formación de imágenes in vivo de cortical flujo de sangre 1, 2, 3 y la arquitectura neurovascular 4, lo que permite la visualización en tiempo real de la actividad cortical dentro de las áreas expuestas 5, 6, 7. Aunque muchos estudios utilizan craneotomías combinados con técnicas de formación de imágenes ópticas en vivo para estudiar la estructura y función de las neuronas corticales, células gliales, y corvasculatura tical 8, 9, más investigaciones están limitados por pequeñas áreas de corteza expuesta (pero ver 10). El propósito de este protocolo es proporcionar un método para crear una gran craneotomía lateral, la exposición de la corteza cerebral de la línea media en el hueso escamoso, y que se extiende más allá de bregma y lambda. Esta gran craneotomía permite la visualización simultánea de las cortezas de asociación (retroesplenial, cingulada y parietal), el motor primario y secundario, somatosensorial, visual, y la corteza auditiva. Este método se ha acoplado previamente con imágenes de colorante sensible al voltaje (VSDI) para investigar cómo múltiples áreas corticales interactúan entre sí durante la actividad espontánea y estímulos inducidos cortical 5, 11, 12. Los aspectos más desafiantes de este procedimiento incluyen el posicionamiento de la cabezadel animal, la fijación de la placa de cabeza, y evitar la hemorragia mientras se separa el músculo temporal desde el hueso parietal. También se debe tomar durante los procesos de perforación y de eliminación de cráneo como las curvas de cráneo en un ángulo oblicuo.

<table><tbody><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>FHC</td><td>40-90-2</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td> Se <td>recomiendan 2 o más pares</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00, 15000-10</td><td>1 par debe estar designado para la extracción de duramadre&nbsp;</td></tr><tr><td>Polvo de color de dientes Jet</td><td>LANG Dental</td><td>Jet Tooth Shade Powder</td><td>para mezclar con el líquido Jet</td></tr><tr><td>Jet color de dientes líquido</td><td>LANG Dental</td><td>Jet Tooth Shade Liquid</td><td>para mezclar con el polvo de chorro &nbsp;</td></tr><tr><td>Cabezales de broca - Fresas de carburo FG 1/4 389</td><td>Midwest Dental</td><td>385201</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa en polvo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Sinclair Dental Canada</td><td>Pfizer Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd 124125</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaína 2% Epinefrina</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd 125299</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexametazona 5&nbsp; mg/mL</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>125231</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato de butilo (VetBond)</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>12612</td><td></td></tr></tbody></table>

un procedimiento de craneotomía lateral grande para el campo amplio de mesoescala imágenes ópticas de la actividad cerebral

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

La craneotomía es un procedimiento comúnmente realizado para exponer el cerebro para experimentos in vivo. En la investigación de ratón, la mayoría de los laboratorios utilizan un pequeño craneotomía, típicamente 3 mm x 3 mm. Este protocolo presenta un método para crear una ventana craneal sustancialmente mayor 7 mm x 6 mm exponiendo más de un hemisferio cerebral sobre las cortezas temporal y parietal de ratón (por ejemplo, bregma 2.5 a 4.5 mm, lateral 0 - 6 mm). Para realizar esta cirugía, la cabeza debe ser inclinado aproximadamente 30 ° y gran parte del músculo temporal debe ser retraído. Debido a la gran cantidad de eliminación de hueso, este procedimiento es sólo para experimentos agudos con el animal anestesiado durante toda la cirugía y el experimento. La principal ventaja de esta gran ventana craneal lateral innovador es proporcionar acceso simultáneo a las dos áreas medial y lateral de la corteza. Esta gran ventana craneal unilateral puede ser utilizado para estudiar la dinámica de los nervios entre las células,así como entre diferentes áreas corticales mediante la combinación de registros electrofisiológicos de múltiples electrodos, de formación de imágenes de la actividad neuronal (por ejemplo, formación de imágenes, intrínseca o extrínseca), y la estimulación optogenética. Además, este gran craneotomía también expone una gran superficie de los vasos sanguíneos corticales, lo que permite la manipulación directa de la vasculatura cortical lateral.

<html> Para el estudio de las interacciones entre áreas corticales dentro de un solo hemisferio, se utilizó una gran craneotomía extiende a través del seno sagital y 5 - 6 En mm lateral. Esta ventana craneal incluido cortezas de los hemisferios del cerebro derecho (figura 3A) primaria (motor, somatosensorial, visual, auditiva), secundaria (motor, visual), y de asociación (retroesplenial, cingulada, asociación parietal). Para este trabajo se utilizó de formaci...

Este protocolo presenta un método para crear una gran craneotomía unilateral sobre las regiones temporal y parietal de la corteza cerebral de ratón. Esto es especialmente útil para la formación de imágenes en tiempo real sobre un área expansiva de un hemisferio cortical.

Un procedimiento de craneotomía lateral grande para el campo amplio de mesoescala imágenes ópticas de la actividad cerebral

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

El objetivo general de esta craneotomía lateral amplia consiste en realizar imágenes en tiempo real sobre una extensa área de un hemisferio cortical. La principal ventaja de esta técnica es que expone grandes áreas de la corteza para su observación y puede utilizarse junto con tecnologías como la optogenética. Esta técnica puede proporcionar información sobre la caracterización de la dinámica neural entre células, así como entre diferentes circuitos cerebrales, a distintas resoluciones temporales y espaciales.La demostración visual de este método es fundamental debido al mayor riesgo de hemorragia y daño cortical, ya que la duramadre suele estar adherida a la superficie cerebral y a los vasos sanguíneos. Este método puede aplicarse para estudiar los mecanismos neurobiológicos subyacentes al desarrollo de los circuitos cerebrales y sus cambios a lo largo de la vida en respuesta a nuevas experiencias o a patologías como la enfermedad de Alzheimer o el accidente cerebrovascular. Para comenzar este procedimiento, esterilice todos los materiales quirúrgicos en autoclave y asegúrese de mantener la esterilidad durante toda la cirugía.Asegúrese de que haya suficiente tampón cerebral para l

a-large-lateral-craniotomy-procedure-for-mesoscale-wide-field-optical

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video y el protocolo de demostrar cómo la implantación de una cubierta de cristal ventana craneal en los roedores. Estas preparaciones se pueden utilizar para la crónica en vivo de dos fotones de imágenes de la corteza cerebral en escalas de tiempo de meses. También puede ser utilizado para otros tipos de imágenes, incluyendo imágenes ópticas señal intrínseca.

Un procedimiento de cirugía craneotomía para imágenes cerebrales crónicas

Se describe un método para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en funcional predeterminada micro-dominios del neocórtex. En primer lugar, la imagen de la señal óptica intrínseca se utiliza para obtener un mapa funcional. Luego de dos fotones microscopía se utiliza para etiquetar y neuronas imagen dentro de un dominio de micro del mapa.

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

Se presenta un método de creación de una ventana adelgazada cráneo cortical (TSCW) en un modelo de ratón...

Diluido-skull técnica de ventana cortical para<em&gt; En Vivo</em&gt; Tomografía de Coherencia Óptica de imagen

Aquí describimos un método para la toma de imágenes multifotonas de lapso de tiempo de alta resolución de células tumorales cerebrales antes y después de una intervención quirúrgica invasiva (por ejemplo, biopsia) dentro del mismo animal vivo. Este método permite estudiar el impacto de estos procedimientos quirúrgicos invasivos en el comportamiento migratorio, invasivo y proliferativo de las células tumorales a un nivel de células únicas.

Imagen intravital longitudinal del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva

Presentamos un protocolo para integrar la tractografía por resonancia magnética de difusión en el trabajo del paciente hasta la cirugía endonasal endoscópica para un tumor de la base del cráneo. Se describen los métodos para adoptar estos estudios de neuroimagen en las fases pre e intraoperatoria.

Papel de la tractografía por resonancia magnética de difusión en la cirugía endoscópica endonasal de la base del cráneo

Este artículo demuestra la preparación de una ventana de encargo de la proyección de imagen complementada con la cánula de la infusión y su implantación sobre la región CA1 del hipocampo en ratones.

Procedimiento De Craneotomía Para La Visualización De Las Actividades Neuronales En El Hipocampo De Comportarse Ratones

El presente protocolo describe la fabricación de una ventana craneal grande (6 x 3 mm2) utilizando envoltura de alimentos, silicona transparente y vidrio de cubierta. Esta ventana craneal permite experimentos in vivo de imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones en el mismo ratón.

In vivo Imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones de un ratón usando una ventana craneal grande

Cuando se integra con una placa de cabeza y un diseño óptico compatible con microscopios de uno y dos fotones, la lente de microprisma presenta una ventaja significativa en la medición de respuestas neuronales en una columna vertical en diversas condiciones, incluidos experimentos bien controlados en estados de cabeza fija o tareas de comportamiento natural en animales que se mueven libremente.

Obtención de imágenes a largo plazo de poblaciones neuronales identificadas mediante microprismas en animales que se mueven libremente y con la cabeza fija

Aquí, presentamos dos protocolos para el registro de microelectrocorticografía de alta densidad (μEcoG) en ratas y ratones, incluidos los métodos quirúrgicos, de implantación y de registro. Los registros de μECoG se realizan en combinación con el registro de politrodos laminares en la corteza auditiva de la rata o con la manipulación optogenética de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial del ratón.

Investigaciones multiescala del procesamiento cortical mediante la integración de politrodos laminares y optogenética con microelectrocorticografía en roedores

Introdujimos una técnica de imagen novedosa llamada Tomografía de Interferencia Óptica Multicapa (OMLIT), que permite la imagen imparcial de todas las células en muestras cerebrales a mesoescala y puede integrarse perfectamente en el flujo de trabajo de imagen de la microscopía electrónica de barrido serial basada en cinta en la misma muestra.

Un método de imagen óptica compatible con microscopía electrónica de barrido para el mapeo cerebral mesoscópico de todas las células

Este protocolo describe un método quirúrgico en dos fases para crear una ventana craneal grande, resellable y que salve la duramadre en ratones. Esta técnica permite registros electrofisiológicos crónicos y multimodales de redes profundas del cerebro distribuido, como la Red de Modos Predeterminados, durante varias semanas.

Protocolo quirúrgico para una ventana craneal grande y resellable que permite grabaciones electrofisiológicas longitudinales y multimodales de la red de modo predeterminado del ratón

Aprende a realizar una craneotomía lateral grande en ratón para obtener imágenes ópticas de campo amplio de la actividad cerebral. Esta técnica permite estudiar la dinámica neural entre células y circuitos cerebrales en tiempo real.

Un procedimiento de craneotomía lateral grande para el campo amplio de mesoescala imágenes ópticas de la actividad cerebral

Explorar más videos