Un procedimiento de craneotomía lateral grande para el campo amplio de mesoescala imágenes ópticas de la actividad cerebral

El objetivo general de esta craneotomía lateral amplia consiste en realizar imágenes en tiempo real sobre una extensa área de un hemisferio cortical. La principal ventaja de esta técnica es que expone grandes áreas de la corteza para su observación y puede utilizarse junto con tecnologías como la optogenética. Esta técnica puede proporcionar información sobre la caracterización de la dinámica neural entre células, así como entre diferentes circuitos cerebrales, a distintas resoluciones temporales y espaciales.

La demostración visual de este método es fundamental debido al mayor riesgo de hemorragia y daño cortical, ya que la duramadre suele estar adherida a la superficie cerebral y a los vasos sanguíneos. Este método puede aplicarse para estudiar los mecanismos neurobiológicos subyacentes al desarrollo de los circuitos cerebrales y sus cambios a lo largo de la vida en respuesta a nuevas experiencias o a patologías como la enfermedad de Alzheimer o el accidente cerebrovascular. Para comenzar este procedimiento, esterilice todos los materiales quirúrgicos en autoclave y asegúrese de mantener la esterilidad durante toda la cirugía.

Asegúrese de que haya suficiente tampón cerebral para la cirugía. A continuación, transfiera un ratón anestesiado al sistema de sujeción de la cabeza y colóquelo sobre una alfombra calefactora termorregulada ajustada a 37 grados Celsius. Sujete los dientes superiores del ratón en un porta-dientes.

Luego, gire la cabeza hacia la izquierda aproximadamente 30 grados para exponer el lado lateral derecho de la cabeza. Posteriormente, asegure la cabeza del ratón con el extremo romo de las barras auriculares. A continuación, aplique una pomada oftálmica para prevenir el secado corneal.

Para reducir el edema cerebral, inyecte dexametasona a una dosis de cuatro miligramos por kilogramo por vía intramuscular. Limpie la piel sobre el área quirúrgica con hisopos de algodón sumergidos en clorhexidina al 4% tres veces y luego con alcohol al 70% tres veces. Inyecte lidocaína por vía subcutánea sobre el sitio de craneotomía.

Bajo un microscopio estereoscópico, levante la piel a un milímetro a la izquierda de la línea media justo detrás de la oreja con pinzas y realice una pequeña incisión horizontal con tijeras quirúrgicas. Realice un corte lateral de cinco a seis milímetros hacia la oreja derecha y luego corte hacia el extremo rostral de la cabeza. En el punto de incisión inicial, inserte las tijeras y corte 10 milímetros en dirección rostral.

A continuación, corte la piel alrededor de la oreja derecha y cerca del ojo derecho para exponer el lado derecho del cráneo y el músculo temporal. Asegúrese de que la parte más ancha del área expuesta sea de al menos siete milímetros. Luego, recorte más la piel si es necesario extender el área quirúrgica.

Con un hisopo de algodón, frote la superficie del cráneo con movimiento circular para eliminar el periostio del cráneo. Asegúrese de que no quede ningún resto de periostio y de que el cráneo esté completamente seco, lo cual es fundamental para la correcta fijación de la placa craneal. A continuación, utilizando tijeras de resorte y pinzas, separe el músculo temporal del cráneo.

Corte y retrate el músculo lateralmente hasta alcanzar el hueso escamoso. Tenga extremo cuidado de no dañar la vena temporal superficial que discurre a lo largo del nivel del hueso escamoso cerca del ojo, de lo contrario podría producirse una hemorragia. Controle la hemorragia con espuma de gel previamente empapada en tampón para cerebro.

Para hemorragias graves, utilice un cauterizador térmico. Aplique pegamento de butil cianoacrilato sobre los sitios con sangrado. Para comenzar este procedimiento, primero marque el bregma para orientar las regiones cerebrales subyacentes, aplique pegamento de etil cianoacrilato alrededor del borde inferior de la placa craneal y pegue la placa sobre el área de craneotomía.

A continuación, rellene el espacio abierto entre el cráneo y la placa craneal con cemento dental, dejando expuesta únicamente el área de la craneotomía. Luego espere a que el cemento dental se seque y endurezca. Posteriormente, delinee la región de la ventana craneal realizando marcas ligeras sobre la superficie del cráneo con la fresa dental.

Recorra suavemente con la fresa la muesca original para profundizarla, asegurándose de que la fresa no penetre a través del cráneo hasta el cerebro. Mientras tanto, alterne entre el fresado y tocar la superficie del cráneo con torundas humedecidas cada pocos minutos. Este inicio muy difícil requiere que los cirujanos fresen a través del cráneo envejecido para liberarlo y extraerlo sin dañar la corteza subyacente.

Lento es suave, lo suave es rápido. Durante la perforación, revise periódicamente si hay pandeo del cráneo presionando suavemente sobre él con pinzas o con la broca inactiva. Cuando el hueso comience a pandearse, detenga la perforación y sumerja completamente la ventana en tampón cerebral.

Espere al menos cinco minutos antes de la extracción del cráneo para ablandar el hueso y reducir la posibilidad de que la duramadre se adhiera al hueso, lo que facilita el proceso de eliminación del cráneo. A continuación, realice el procedimiento de extracción del cráneo comenzando por el borde anterior. Separe suavemente el cráneo suelto de la duramadre utilizando pinzas.

Una vez que el hueso esté suelto y flotando sobre la duramadre, agárralo firmemente con pinzas y levántalo alejándolo de la duramadre. Asegúrese de que el hueso nunca penetre en el cerebro. Utilice pinzas y tijeras de resorte para rasgar y cortar suavemente la duramadre.

Se debe tener cuidado para asegurar que el parénquima cerebral y los vasos sanguíneos no resulten dañados. Continúe hasta que se haya eliminado toda la duramadre del sitio de la ventana craneal. Cuando se realiza correctamente, el cerebro parecerá muy limpio, con vasos sanguíneos bien definidos y sin manchas.

Rocíe la cubreobjetos con etanol al 70 % y use un bote de aire comprimido para secarla suavemente. Asegúrese de que el vidrio esté completamente limpio, sin manchas ni polvo. A continuación, prepare agarosa al 1,3 % calentando 200 miligramos de polvo de agarosa disueltos en 15 mililitros de tampón cerebral.

Coloque un termómetro en el agarosa caliente y enfríe el agarosa hasta alcanzar una temperatura ligeramente por encima de la de solidificación, aproximadamente 40 grados Celsius. El enfriamiento puede acelerarse pasando agua fría sobre el tubo, teniendo cuidado de no permitir que entre agua en el agar. Agite suavemente con el termómetro mientras monitorea su temperatura.

Inmediatamente antes de aplicar el agar, retire el tampón del cerebro del pozo craneal. Asegúrese de que no haya burbujas ni partículas presentes, ya que interferirían con la obtención de imágenes. Ahora aspire el agarosa con una pipeta de transferencia y deposite directamente el agarosa sobre el cerebro.

Luego coloque rápidamente la cubreobjetos sobre la superficie y sujétela con gotas de agarosa en las esquinas. Aquí se muestra una micrografía fotográfica de una craneotomía unilateral amplia, con el bregma indicado mediante un círculo blanco en cada imagen. Se muestran los patrones de activación cortical en un ratón anestesiado con isoflurano al 0,5% tras la estimulación del bigote contralateral, estimulación auditiva, estimulación del miembro anterior contralateral, estimulación del miembro posterior contralateral y estimulación visual del ojo contralateral con un diodo emisor de luz.

Hubo una activación en la línea media a partir de todas las formas de estimulación sensorial entre 10 y 25 milisegundos después de la activación de la corteza sensorial primaria. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en tres o cuatro horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la pérdida de sangre al mínimo y asegurarse de que la corteza no resulte dañada.

Mediante este procedimiento, otras técnicas de imagen, como la imagen óptica, pueden ayudar a responder preguntas importantes, como cómo la actividad espontánea influye en la dinámica neuronal en el cerebro normal y enfermo. Tras su desarrollo, esta técnica ayudó a allanar el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia de sistemas exploraran las interacciones y la dinámica neuronal entre regiones corticales ampliamente separadas en ratones. Este video le muestra cómo realizar una craneotomía lateral amplia en el ratón con mínima pérdida de sangre y daño cortical, permitiéndole recopilar los datos necesarios para responder sus preguntas científicas más urgentes.