Teñido Insectos de la Conducta ensayos: el comportamiento de apareamiento de anestesiada Drosophila
22 de abril de 2015
Este protocolo describe una forma sencilla y rentable de identificar individualmente Drosophila u otros insectos. Los datos de demostración que investigan el éxito del apareamiento en tres especies de Drosophila muestran que este método es comparable o mejor que el uso de anestesia con CO2.
El objetivo general de este procedimiento es hacer que los insectos se distingan visiblemente entre sí de una manera no invasiva para su identificación en experimentos de comportamiento. Esto se logra primero tiñendo visiblemente la superficie del alimento normal de drosophila en un vial estándar para moscas con unas gotas de colorante alimentario. A continuación, las moscas se añaden al vial durante tres horas, momento en el que la drosophila debe exhibir una coloración fuerte en el abdomen.
Se pueden realizar experimentos de apareamiento, por ejemplo, para observar si las hembras encuentran más atractivos a los machos teñidos de un color específico. En última instancia, esta técnica de tinte es una forma rápida, sencilla y no invasiva de etiquetar insectos para una fácil identificación experimental. La principal ventaja de usar esta técnica sobre los métodos existentes, como la extirpación de parte del ala de la mosca, es que es más rápida, menos invasiva y es menos probable que afecte el comportamiento posterior.
Este método puede ser útil en una amplia variedad de experimentos en los que es importante identificar individuos o clases de moscas. También es lo suficientemente fácil como para ser utilizado en experimentos simples en escuelas o universidades. La demostración de esta técnica estará a cargo de Rudy Verse Bo y Chloe Hayes, ambos estudiantes de doctorado aquí en la Universidad de Liverpool Después de que la comida se haya llamado y solidificado, comience agregando de 0.5 a un mililitro de colorante azul para alimentos encima de la comida, extienda el tinte por toda la superficie del vial.
A continuación, almacene los alimentos a cuatro grados centígrados durante dos días para permitir que la dieta sea absorbida por la capa superior de los alimentos. A continuación, transfiera las moscas a la comida de acuerdo con las necesidades del experimento. En un día, las moscas de la dieta se pueden distinguir fácilmente de las moscas no teñidas para realizar una prueba de apareamiento con las moscas teñidas.
Use un aspirador para transferir machos vírgenes individuales a viales de plástico estándar de 75 por 20 milímetros que contienen 20 mililitros de comida. Si realiza una prueba de apareamiento de dos machos, coloque la mitad de los machos de cada grupo de tratamiento en viales con alimentos coloreados. A continuación, transfiera las hembras recién emergidas a viales de alimentos frescos en grupos de 10.
Ahora permita que ambos sexos maduren hasta la edad de apareamiento a la temperatura adecuada para la especie. Cuando las drosophila estén listas, exponga a los machos experimentales al tratamiento deseado. Por ejemplo, las otras moscas están siendo anestesiadas con dióxido de carbono y etiquetan los viales para identificar tanto el tratamiento como el estado de color de las moscas el día antes del ensayo.
Mueva las hembras a viales individuales que contengan 20 mililitros de alimento para aclimatar a las moscas al vial de apareamiento, y etiquete los viales con etiquetas neutras para cegar el experimento. A continuación, añada una o dos moscas macho a cada vial de apareamiento que contenga una sola mosca hembra. Según corresponda.
Comience la prueba de apareamiento para que coincida con las luces que se encienden en la incubadora para dos pruebas de apareamiento de machos. Tenga cuidado de que cada macho sea de un tratamiento diferente y que una mosca exhiba manchas abdominales. Registre el tratamiento y la coloración de cada mosca macho.
Si la cópula ocurre dentro de las dos horas, registre el estado de los dados del macho que se aparea para las pruebas de apareamiento de un solo macho. Registre la hora en que comienza y se detiene el apareamiento. A continuación, calcule los datos de éxito de acoplamiento, latencia y duración de la prueba.
El mejor modelo encontrado para explicar la variación en el efecto del dióxido de carbono. La anestesia contiene especies como un factor. Por ejemplo, en estos experimentos representativos, la anestesia con dióxido de carbono no mostró ningún efecto significativo en el éxito del apareamiento de Drosophila.
Moscas pseudo oscuras y Drosophila sub oscuras en dos ensayos masculinos para Drosophila melanogaster, sin embargo, se observó un éxito de apareamiento significativamente menor para los machos expuestos a la anestesia con dióxido de carbono, con un efecto aún mayor cuando Drosophila melanogaster fue expuesto al gas en la recolección o un día antes de los ensayos. No se observaron diferencias significativas en el apareamiento de las moscas coloreadas para alimentos de ninguna de las tres especies, ni tampoco se incluyó el tratamiento en el análisis o el estado de apareamiento de los insectos en los ensayos de apareamiento único. No hay diferencia en el apareamiento.
Se observó latencia para cualquiera de las tres especies cuando se utilizó anestesia de dióxido de carbono para recolectar adultos recién emergidos. Solo las moscas Drosophila sub obscure mostraron un efecto en la duración del apareamiento cuando se expusieron al dióxido de carbono dos días antes de las pruebas de apareamiento. Después de ver este video, deberías tener una buena idea de cómo usar el tinte intestinal como una técnica no invasiva para etiquetar a tus moscas durante tus experimentos.
Al intentar este procedimiento, es importante probar cualquier impacto del tinte de interés en su especie focal. Algunos tintes pueden ser tóxicos y algunos colores pueden afectar directamente el éxito del apareamiento. Por ejemplo, el colorante alimentario rojo puede ser preferible en algunas especies.
Aquí hemos utilizado esta técnica de tinte para distinguir entre moscas en pruebas de apareamiento competitivas. Sin embargo, también se puede utilizar en una variedad de otros experimentos en los que las moscas deben identificarse individualmente, como ensayos para evaluar la agresión, la defensa territorial, la actividad de preferencia alimentaria o los comportamientos sociales.
Resumen
Este protocolo describe un método no invasivo para identificar individuos de Drosophila y otros insectos utilizando colorantes alimentarios. La técnica permite una identificación sencilla durante experimentos de comportamiento, demostrando resultados comparables o mejores que los métodos tradicionales como la anestesia con CO2.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del comportamiento
- Entomología
Antecedentes
- La identificación de insectos individuales es fundamental para los estudios de comportamiento.
- Los métodos tradicionales pueden ser invasivos y afectar el comportamiento.
- El colorante alimentario proporciona una alternativa rápida y sencilla.
- Este método es adecuado para diversos entornos experimentales, incluidas instituciones educativas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una técnica no invasiva para la identificación de insectos.
- Evaluar la atracción que ejercen los machos de diferentes colores sobre las hembras.
- Comparar la eficacia de este método frente a la anestesia con CO2.
Métodos Utilizados
- Tinción del alimento para Drosophila con colorante alimentario.
- Permitir que las moscas se alimenten del alimento teñido durante tres horas.
- Realización de ensayos de apareamiento con moscas teñidas y no teñidas.
- Registro del éxito reproductivo y del comportamiento en condiciones controladas.
Resultados principales
- No hubo diferencias significativas en el éxito reproductivo entre moscas coloreadas y no coloreadas.
- La anestesia con CO2 afectó negativamente el éxito reproductivo en algunas especies.
- La técnica del colorante demostró ser efectiva para la identificación individual.
- Se debería probar el impacto conductual del color del colorante en especies específicas.
Conclusiones
- El método del colorante alimentario es una alternativa viable para la identificación de insectos.
- Esta técnica es menos invasiva y más rápida que los métodos tradicionales.
- Puede aplicarse en diversos contextos experimentales más allá de las pruebas de apareamiento.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los métodos de etiquetado no invasivos son fundamentales para mantener la integridad de los ensayos conductuales en las fases iniciales de validación de dianas y en los flujos de trabajo de cribado fenotípico. Esta técnica con colorante alimentario reduce las variables confusas derivadas de procedimientos invasivos, favoreciendo un cribado de compuestos más fiable y una reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento neuroconductual. El enfoque permite una identificación individual escalable y reproducible entre especies, acorde con las necesidades empresariales de modelos preclínicos estandarizados.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis en ensayos de comportamiento reproductivo sin introducir artefactos conductuales derivados de etiquetado invasivo.
- Valor operativo: Proporciona una identificación individual rápida y de bajo costo, compatible con diseños de cribado de alto rendimiento.
- Valor predictivo: Facilita la validación de objetivos al aislar los efectos genéticos o farmacológicos sobre el comportamiento mediante una reducción del ruido procedural.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera resultados conductuales cuantificables (éxito en el apareamiento, latencia, duración) con una variabilidad técnica reducida.
- Valor operativo: Facilita la estandarización del ensayo entre laboratorios mediante una coloración sencilla y transferible basada en el alimento.
- Escalabilidad: Compatible con formatos de múltiples pocillos y sistemas automatizados de seguimiento para la cribado de bibliotecas de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite la comparación conductual entre especies (D. melanogaster, D. pseudoobscura, D. subobscura) para estudios de conservación de dianas.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Permite evaluar los efectos de genes o compuestos sobre la conducta sin interferencias inducidas por anestesia.
- Confianza Predictiva: Posibilita el seguimiento longitudinal de la conducta en modelos relevantes para enfermedades donde se requiere muestreo repetido.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de biología de descubrimiento como un paso previo al fenotipado conductual, antes de la exposición al compuesto y la recopilación de lecturas en las cascadas de identificación de fármacos prometedores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya el aislamiento de variables independientes (por ejemplo, genotipo, tratamiento) al garantizar un seguimiento individual consistente en diferentes condiciones experimentales.
- Selección: Permite mediciones basales reproducibles, esenciales para detectar cambios sutiles en el comportamiento en ensayos de compuestos.
- Análisis: Genera datos conductuales categóricos y temporales (estado reproductivo, latencia, duración) adecuados para modelado estadístico y cálculo del tamaño del efecto.
- Investigación Traducional: Facilita puntos finales conductuales alineados con biomarcadores en modelos preclínicos de trastornos neuropsiquiátricos.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad de etiquetado independiente de la plataforma, aplicable en ensayos conductuales basados en insectos en entornos académicos e industriales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al eliminar los factores de confusión conductuales de los métodos tradicionales de etiquetado.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la comparabilidad entre laboratorios mediante una identificación estandarizada y no invasiva.
- Valor estratégico: Aumenta la confianza en las decisiones de avance o interrupción en las fases iniciales del descubrimiento al mejorar la relación señal-ruido del ensayo.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización de objetivos ajustada al riesgo mediante datos fenotípicos más limpios en las cascadas de validación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el diseño de ensayos conductuales y pruebas de tolerancia a colorantes específicas para cada especie.
- Depende de equipos de laboratorio estándar (viales, colorantes alimentarios, aspiradores), sin necesidad de instrumentación especializada.
- Necesita una estandarización del protocolo entre equipos, respecto a la concentración del colorante, el tiempo de exposición y la selección de colores, en distintos sistemas modelo.
- Incluye consideraciones de adaptación relacionadas con la permeabilidad del cutícula y la absorción de pigmentos en diferentes especies de insectos y sus estadios de desarrollo.
- Presenta limitaciones prácticas, como la posible toxicidad del colorante o preferencias de color específicas de cada especie, que requieren validación empírica.
