Name: Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. Parte III. Detección de virus por RT-qPCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Aprende a cuantificar enterovirus y norovirus en agua mediante RT-qPCR con ultrafiltración centrífuga y extracción de ácidos nucleicos. Este método EPA 1615 permite evaluar riesgos en agua potable y recreativa con recuperaciones del 20-30%.

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Los autores agradecen al Dr. Eric Rhodes por preparar los clones utilizados en el desarrollo del reactivo de curva estándar, a Brian McMinn por su asistencia en el procesamiento de muestras, a Larry Wymer por el análisis estadístico, al Dr. Mark Borchardt, Departamento de Agricultura de EE. UU., Marshfield, WI, por suministrar el serotipo 3 del virus de la poliomielitis Sabin utilizado en este estudio y al Dr. H. W. Virgin, de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, para el norovirus murino. Los autores también agradecen a Gretchen Sullivan por su ayuda en la preparación de las existencias de reactivos de laboratorio, al Dr. Mohammad Karim por la propagación de las existencias de norovirus murinos, y a los propietarios de pozos privados locales y a las empresas de servicios públicos por permitirnos recoger muestras de agua. Aunque este trabajo fue revisado por la EPA y aprobado para su publicación, es posible que no refleje necesariamente la política oficial de la Agencia. La mención de nombres comerciales o productos comerciales no constituye un respaldo o recomendación de uso.

Nota: Las hojas de datos utilizar para rastrear todos los pasos del protocolo; hojas de datos de ejemplo se dan en el material complementario Tablas S2-S4. 1. Preparación de la curva estándar <ol><li> Preparar una solución de trabajo del reactivo curva estándar (por ejemplo, Armored RNA EPA-1615) diluyéndola partir de la concentración suministrado por el fabricante a una concentración de 2,5 x 10 8 partículas / ml (2,5 x 10 8 GC / ml) utilizando TSM tampón III. Divida la madre de trabajo en 250 alícuotas mu l utilizando 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C. NOTA: Ver protocolo de materiales suplementarios Paso S1 para obtener instrucciones sobre la preparación de las reservas de trabajo de virus y plásmidos para su uso como reactivos curva estándar alternativos. </li><li> Descongelar una o más de las alícuotas del stock de trabajo. Preparar cinco diluciones seriadas de 10 veces utilizando 1,5 ml tubos de microcentrífuga, dando concentraciones de 2,5 x 10 7, 2.5 x 10 6, 2.5 x10 5, 2,5 x 10 4 y 2.5 x 10 3 GC / ml. <ol><li> Preparar la primera dilución añadiendo 25 l de la / ml madre de trabajo 2,5 x 10 8 GC 225 l de tampón de TSM III. Mezclar durante 5-15 segundos utilizando un mezclador vortex. </li><li> Preparar la siguiente dilución añadiendo 25 l de la dilución preparada en el paso 1.2.1 a 225 l de tampón de TSM III. Mezclar de nuevo y seguir un proceso similar para preparar los próximos tres diluciones de 10 veces. </li></ol></li><li> Extraer el ARN de la madre de trabajo curva estándar y los cinco diluciones inmediatamente utilizando el procedimiento de la Sección 3. </li></ol> 2. Concentración terciaria <ol><li> Preparar un concentrador centrífugo (corte de peso molecular 30.000) para cada muestra recogida mediante la adición de al menos 10 ml de 1x PBS, 0,2% de albúmina de suero bovino (BSA) a la cámara de muestra superior. Asegúrese de que la solución ha llenado la cámara de concentración canal delgada, y luego celebrar O / N a 4 ° C. <ol><li&gt; Deseche el fluido. Enjuague el concentrador de una vez con al menos 10 ml de agua estéril de grado reactivo para eliminar el exceso de BSA y luego deseche el agua. </li></ol></li><li> Añadir una cantidad de concentrado de agua secundaria de cada muestra de prueba igual a S, el ensayo Volumen de muestra en concentradores centrífugos separadas. <ol><li> Calcular S utilizando la ecuación 1, <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> Donde D es el volumen de la muestra original de agua ensayada, TSV es el volumen total de la muestra y FCSV es el concentrado de volumen de la muestra final. Ver materiales suplementarios S2 para un ejemplo del cálculo del S. </li></ol></li><li> Centrifugar cada muestra de ensayo a 3.000-6.000 xg a 4 ° C en un rotor de cubeta oscilante durante 20 - 30 min. Compruebe el volumen en la cámara de concentración canal delgada. <ol><li> Si el volumen es mayor que 400 l, centrifugar de nuevo durante 20 min o más. Continuar centrifugación hasta que la muestra in the cámara de concentración canal delgada se ha reducido a menos de 400 l. No retire el sobrenadante. </li></ol></li><li> Lavar los lados del concentrador centrífugo con 1 ml de fosfato de sodio 0,15 M estéril, pH 7-7.5 para aumentar la recuperación de virus. Centrifugar de nuevo a 3.000-6.000 xg y 4 ° C hasta que la muestra se ha reducido a menos de 400 l. Repita este paso de lavado una vez adicional. </li><li> Usando una micropipeta 100-200 l, medir y transferir cada muestra se concentró a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (es decir, la transferencia de 200 l al tubo de microcentrífuga y luego medir el concentrado restante mediante el ajuste de la micropipeta hasta que el líquido restante puede ser completamente elaborado cuidadosamente en la punta de pipeta). Añadir fosfato de sodio 0,15 M, pH 7-7.5, para ajustar el volumen final a 400 ± 2 l. </li><li> Extraer el ácido nucleico de inmediato por continuar con el paso 3. Mantenga las muestras concentradas que no puede ser processed inmediatamente a 4 ° C por no más de 24 horas. </li></ol> 3. Nucleic Acid Aislamiento <ol><li> Añadir 200 l de tampón de extracción preparado como se describe en el Paso 3.3 y 200 l de concentrado terciaria de cada muestra de prueba de la Etapa 2.5 o dilución curva estándar de la Etapa 1.3 para separar la etiqueta 1,5 ml tubos de microcentrífuga. Congele restante concentrados terciarios en o por debajo de -70 ° C. Extraer los ácidos nucleicos a partir de cada muestra según las instrucciones del fabricante de extracción de ácido nucleico kit para el protocolo de giro para muestras de sangre con las siguientes excepciones. </li><li> No añadir proteasa a las muestras de agua o utilizar el tampón de extracción se suministra con el kit de extracción de ácido nucleico. </li><li> Preparar tampón de extracción con ARN transportador <ol><li> Añadir 310 l de tampón de dilución de ARN transportador a un vial que contiene 310 g de ARN portador. Mezcle para disolver y luego dividir en 6 alícuotas que contienen alrededor de 50 l. Conservar a -20DO. </li><li> Añadir 28 l de ARN transportador descongelado por ml del tampón de extracción para obtener una concentración de ARN portador de 0,027 g / l. Utilice el tampón de extracción de ARN modificado de soporte en lugar del que se suministra con el kit de extracción. </li></ol></li><li> Preparar una solución de tampón de elución principal mediante la adición de ribonucleasa (RNasa) Inhibidor hasta una concentración final de 400 unidades / ml para el tampón de elución suministrado con el kit de extracción. <ol><li> Eluir el ARN de la unión de ácidos nucleicos columna de centrifugación mediante la colocación de 50 l de tampón de elución con inhibidor de RNasa en la columna. Espere 1 min, y luego centrifugar a 6000 xg durante 1 min a TA. </li><li> Repita el paso 3.4.1 y luego retire y deseche la columna. </li></ol></li><li> Preparar alícuotas de los extractos de ARN a partir del paso 3.4.2. Preparar 6 alícuotas de la solución de trabajo curva estándar y cada dilución curva estándar que contiene por lo menos 15 l cada uno. Preparar 4 alícuotas de todas las demás muestras de ARN que contienen al menos22 l cada uno. Almacenar una alícuota de cada muestra y la curva estándar de los controles a 4 ° C si pueden ser procesadas por transcripción inversa dentro de 4 horas; de lo contrario, almacenar todos alícuotas en o por debajo de -70 ° C. </li></ol> 4. transcripción inversa (RT) <ol><li> Preparar 100 mM de soluciones madre de cada cebador de oligonucleótido y la sonda enumerados en la Tabla 1 mediante la adición de un volumen de agua de calidad para PCR a cada vial utilizando una cantidad (en microlitros) igual a diez veces el número de nanomoles (nmoles) de oligonucleótido presentes en el vial (como se muestra en la etiqueta o en la hoja de especificaciones del fabricante (por ejemplo, volver a suspender una cartilla que contiene 36,3 nmol en 363 l). Mezclar hasta disolver. <ol><li> Diluir los 100 M soluciones 1:10 con agua PCR-grado para preparar 10 M soluciones de trabajo. </li></ol></li><li> Preparar RT Master Mix 1 y 2 en una habitación limpia con la guía en la Tabla 2. Pipetear 16,5 l de RT Master Mix 1 a cada placa de PCR pocillo usando una pipeta multicanal. </li><li> Thaw, si congela, los extractos de ácidos nucleicos de cada muestra de campo y laboratorio matriz de la muestra fortificada (LFSM; es decir, la muestra matriz de agua sin semillas). <ol><li> Diluir cada campo y muestra LFSM 1: 5 y 1:25 en tampón de elución que contiene 400 unidades / ml de inhibidor de RNasa. </li><li> Thaw, si congela, pero no lo diluya Lab fortificada en blanco (LFB, es decir, un control positivo de la calidad utilizando agua sin semillas grado reactivo), Laboratorio Blanco de reactivo (LRB, es decir, un control negativo calidad utilizando agua de grado reactivo), Evaluación del Desempeño (PE , es decir, las muestras de agua de grado reactivo sembrado utilizan para evaluar el rendimiento de laboratorio antes del inicio de un estudio), Test Performance (PT, es decir, las muestras de agua de grado reactivo sembrado con títulos desconocidos a un analista que se utilizan para evaluar el rendimiento de laboratorio durante un estudio ), el control de la extracción negativo NA lotes, o ARN extraído del conjunto curva estándar. </li></ol&gt; </li><li> Coloque 6.7 l de la ARN a partir de cada muestra de prueba, control, y la curva estándar en pocillos de placas de PCR separadas, utilizando pocillos por triplicado para las muestras de ensayo y controles y pocillos duplicados para las curvas de calibración (véase la figura S1 para un ejemplo placa de RT). <ol><li> Coloque 6.7 l de tampón de elución en pocillos de placas de PCR separadas para controles sin plantilla (NTC). Incluir 2-8 NTC por placa RT, utilizando dos para la primera muestra y luego dos más por cada cuarta muestra adicional. </li><li> Distribuir la extracción negativo y controles NTC en toda la placa. </li></ol></li><li> Selle la placa de PCR con una placa resistente sellador térmico. Mezcle las muestras durante 5-10 segundos y centrifugar a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Incubar la placa durante 4 min a 99 ° C y luego enfriar rápidamente a 4 ° C en un ciclador térmico. Centrifugar de nuevo en ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Retire con cuidado la junta de la placa y luego añadir 16,8 l de RT Master Mix 2 a cada pocillo. Seal de la placa de nuevo con un sellador de placa resistente al calor, seguido de la mezcla y una breve centrifugación a ≥ 500 x g. </li><li> Colocar la placa en un ciclador térmico y una duración de 15 min a 25 ° C, seguido por 60 min a 42 ° C, 5 min a 99 ° C, y luego por un ciclo de 4 ° C espera. </li><li> Proceso de inmediato o dentro de 8 horas por qPCR (Paso 5), o almacenar las muestras en o por debajo de -70 ° C hasta que se puede procesar. Almacene las muestras que se pueden procesar en 8 horas a 4 ° C. </li></ol> 5. En tiempo real PCR cuantitativa (qPCR) <ol><li> Determinar el valor medio de la hepatitis G Cq para cada lote de reactivo G hepatitis antes de ejecutar cualquier muestras de ensayo. <ol><li> Ejecutar un ensayo de RT utilizando 10 réplicas preparados como se describe para los controles NTC (Paso 4.1.1). Ejecutar el ensayo G qPCR hepatitis como se describe a continuación (Pasos 5.2 a 5.5.3). Calcular el valor medio Cq de las 10 repeticiones. </li><li> Ajuste la hepatitis G cantidad de reactivo en RT Master Mix 1 (Tabla 2), Si es necesario, para obtener un valor medio Cq entre 25 y 32 unidades. Compensar la cantidad subir o bajar al cambiar el volumen de agua añadida para mantener la RT Master Mix 1 volumen final de 16,5 l por ensayo. </li><li> Confirme los ajustes por Pasos 5.1.1 a 5.1.2 y el cambio Tabla 2 repitiendo para reflejar las cantidades ajustadas. </li></ol></li><li> Preparar maestros mezclas qPCR en una habitación limpia utilizando las guías en la Tabla 3 para enterovirus, Tabla 4 y Tabla 5 para el norovirus genogrupo I, Tabla 6 para el norovirus genogrupo II, Tabla 7 para el norovirus murino (norovirus genogrupo V), y en la Tabla 8 para la hepatitis G. Mix y cada mezcla maestra centrifugar a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Añadir las mezclas de reacción de PCR a los pocillos apropiados de una placa de reacción óptica etiquetados, utilizando 14 l por pocillo y las placas separadas para cada ensayo qPCR (ver Figura S2 </strong&gt; para un posible diseño para un ensayo de qPCR basado en el diseño de RT en la Figura S1). </li><li> Descongele la placa RT desde el paso 4.8 a temperatura ambiente, si se congela. Mezclar con un mezclador plato y centrifugar a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Dispensar 6 l de la cDNA apropiada a los pocillos apropiados de la placa de reacción óptica. Mezclar las muestras en la placa de reacción óptica y centrifugar a ≥ 500 xg brevemente. <ol><li> Ejecute la hepatitis G ensayo qPCR en el campo sin diluir y diluidos y muestras LFSM antes de ejecutar todos los otros ensayos de qPCR. Utilice la dilución más baja del terreno o de la muestra LFSM que es &lt;1 Cq valor mayor que el valor medio de la hepatitis G Cq para los ensayos de qPCR enterovirus y norovirus. </li><li> Configurar el software termociclador de PCR cuantitativa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Identificar las muestras de la curva estándar como las normas y para cada dilución curva estándar, introduzca los valores de copia genómicas que se muestran en la Tabla 9. </li><li&gt; Ejecutar la placa en la cuantitativa termociclador de PCR durante 10 minutos a 95 ° C, seguido por 45 ciclos de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 60 ° C. </li></ol></li><li> Determina si cada curva estándar cumple con los valores aceptables indicados en la tabla 10. Vea la sección materiales suplementarios S3 para ejemplos. <ol><li> Calcula la desviación estándar global (DesviaciónEstándar) para la curva estándar utilizando la ecuación 2, <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> donde Cq es el valor reportado para cada réplica curva estándar, Cq es el valor medio para cada conjunto de réplicas, #Cq es el número total de valores Cq para todas las repeticiones de control estándar que tienen valores positivos (es decir, no indeterminada), y # Stds es el número de controles estándar que tienen valores positivos. </li><li> Si el software termociclador de PCR cuantitativa no calcula la pendiente de cada curva estándar, calcular la pendiente utilizando la ecuación 3,60; <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> donde Cq es el valor medio de las diluciones altas y más bajas utilizadas log GC es el logaritmo del valor copia genómica de las diluciones altas y más bajas utilizadas en la Tabla 9. </li><li> Calcular el valor de R 2 utilizando la ecuación 4. <img alt="Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> donde Cq es la media de todos los valores de la CQ y registro de GC es el valor medio de registro GC para cada réplica. </li><li> Calcular la eficiencia% utilizando la ecuación 5: <img alt="Ecuación 5" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li></ol></li><li> Registre los valores GC calculados por el software termociclador para todas las muestras de prueba basados ​​en las curvas de calibración que cumplen los criterios especificados en la Tabla 10 y los valores medios de GC para cada muestra. Vuelva a ejecutar las muestras con las curvas de calibración que no cumplan con los criterios establecidos en <strong&gt; Tabla 10 o cuando los controles negativos (LRB, el control de la extracción negativo NA lotes o NTC) son positivos. Vuelva a procesar las muestras que no cumplen con los criterios o tienen controles positivos falsos durante la repetición. </li><li> Determinar la GC por litro (GC L) para cada muestra de ensayo usando la Ecuación 6: <img alt="Ecuación 6" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> donde GC es el número de copias del genoma media desde el paso 5.7, el factor &#39;199&#39; es el factor de dilución total de las reducciones de volumen que se producen durante la concentración terciario, extracción de RNA y pasos de RT-qPCR, DF es el factor de dilución que compensa la inhibición y D es el volumen de la muestra original de agua ensayada en litros. Ver materiales suplementarios sección S4 para un ejemplo del cálculo del GC L. </li><li> Calcule el GC total de LFB y LRB muestras multiplicando el valor medio de GC desde el Paso 5,5 por 199 y dividiendo por 0,3. </li></ol>

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<li>Fey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+real-time+PCR-based+approach+for+accurate+quantification+of+bacterial+RNA+targets+in+water%2C+using+Salmonella+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3618-3623 (2004).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).</li>
<li>Kim, M., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+the+inhibitory+effects+of+salt%2C+humic+acid%2C+and+heavy+metals+on+the+recovery+of+waterborne+norovirus+by+electropositive+filters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of the inhibitory effects of salt, humic acid, and heavy metals on the recovery of waterborne norovirus by electropositive filters.</a> J. Water Health. 11 (4), 613-622 (2013).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses%2C+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Estudios nacionales a gran escala de la contaminación viral de las fuentes de agua y beber requieren el uso de múltiples laboratorios analíticos. Bajo estas condiciones, se necesita un método estándar para asegurar que los datos generados por los múltiples laboratorios es comparable. Hay muchos métodos moleculares publicados para la detección de virus, pero muy pocos métodos moleculares normalizados. Método EPA 1615 es un método estandarizado diseñado específicamente para la detección de enterovirus y norovirus en matrices de agua por RT-qPCR. Métodos moleculares estandarizados están disponibles para la detección de virus en los alimentos (CEN / ISO TS 15.216-1 y CEN / ISO TS 15216-2; 07 de abril 2013) 16,17 y se han aplicado a la detección de virus de hepatitis A y el norovirus en primavera agua 16. Todos los métodos estándar deben incluir controles de calidad, los criterios para minimizar internacional y la variación intra-laboratorio y datos falsos positivos debido a la contaminación de laboratorio. Para reducir aún más datos falsos, EMétodo PA 1615 sigue la orientación de la EPA sobre los métodos moleculares, 18 que estipula la separación de trabajo durante el proceso y una forma de flujo de trabajo. Incluye una hepatitis G 1,19 de control y procedimientos para minimizar los resultados negativos falsos debido a inhibidores de la RT-qPCR 15 interna. Utiliza ensayos cuantitativos junto con volúmenes estandarizados, tanto de agua muestreado y analizado el agua de modo que todos los datos de campo se expresa en copias genómicas por litro del campo o beber agua muestreada. Aunque solo tubo eficiente (una etapa) ensayos de RT-PCR están disponibles comercialmente, el método utiliza intencionadamente ensayos separados. Esto tiene la desventaja de reducir al mínimo la cantidad de muestra que puede ensayarse en cada reacción, pero da una mayor flexibilidad en el uso de múltiples conjuntos de cebadores. Ensayos de RT-qPCR están limitados por y sólo tan bueno como los cebadores y sondas utilizados y probablemente ningún conjunto de cebadores detectarán todas las variantes del virus dentro de un grupo. El conjunto de cebadores enterovirus fue elegido porquese dirige a la región 5 &#39;no codificante conservada, 20,21 detecta una amplia variedad de serotipos de enterovirus y virus detectados por ella están asociados con efectos en la salud por el consumo de aguas subterráneas sin tratar 1. Dos conjuntos de cebadores se utilizan para la detección de genogrupo I norovirus 22,23. El primero fue elegido debido a la fuerte correlación entre los efectos de salud en los niños pequeños y detecta virus 1. El segundo genogrupo I conjunto de cebadores y el conjunto de cebadores utilizado para genogrupo II norovirus fueron escogidos porque detectan la más amplia variedad de cepas 24,25. A pesar de las ventajas principales de los procedimientos de RT-qPCR y qPCR para la detección de ARN viral en el agua, hay varias limitaciones. En primer lugar, ambas partículas de virus infecciosos y no infecciosos, incluidos los inactivado por los desinfectantes, se pueden amplificar por estos procedimientos. Los resultados de Borchardt sugieren que esto es un problema menor para las aguas subterráneas sin tratar facuíferos rom similares a los de las comunidades estudiadas que para las aguas superficiales desinfectados 1. Para los virus cultivables este problema se puede superar usando PCR en combinación con la cultura 26,27. El problema también ha sido abordado por algunos virus mediante el uso de agentes de reticulación de ácido nucleico 28-30. Este último enfoque es más eficaz para los virus inactivados por hipoclorito y no eficaces para aquellos inactivado por UV. Una segunda limitación de estos procedimientos moleculares es que el volumen de la muestra concentrada que se puede ensayar típicamente es mucho menor que la utilizada para procedimientos de cultivo de 6,31. Este problema es a menudo manejado por cualquiera de sustitución de un procedimiento basado en el polietilenglicol para la concentración secundaria estándar por floculación orgánica, lo que permite que la muestra se resuspendió en un volumen más pequeño, o mediante la adición de una etapa de concentración de la muestra terciaria 6,32,33 . Método 1615 utiliza Centrifultrafiltración ugal para proporcionar concentración terciario. Ultrafiltración centrífuga elimina el agua y los componentes de menos de 30.000 Daltons resultantes tanto en concentración de cualquier virus en muestras de ensayo y una reducción en pequeñas inhibidores de peso molecular de ensayos moleculares. Este terciarios resultados etapa de concentración en un factor de concentración total de&gt; 10 5 para cualquier virus que estaba presente en el agua están probando. Una tercera limitación es la presencia de inhibidores de procedimientos moleculares en muestras ambientales. Aunque se han desarrollado numerosos enfoques para eliminar los inhibidores, ningún enfoque es eficaz para todas las matrices de agua y tipos de virus 6,34,35, haciendo que el uso de controles internos diseñados para estimar el nivel de inhibición esencial. El reactivo de la hepatitis G utilizado en este método satisface este requisito al proporcionar un nivel constante de ARN viral en todas las reacciones y un ensayo de RT-qPCR para la estimación de la inhibición. Cuando el mejor de tél inhibidor enfoques de eliminación no logran eliminar la inhibición, concentrados de muestra se pueden diluir, siempre y cuando las concentraciones de virus son más altas que las concentraciones de inhibidor 14,15. El procedimiento descrito en este documento curva estándar tiene tanto ventajas como una limitación importante. Una ventaja es que el reactivo utilizado materiales de todos los componentes necesarios en un solo reactivo, lo que permite un único control que se utilizará para todos los ensayos. Este reactivo es especialmente una ventaja para los ensayos de norovirus. Partículas norovirus sólo se pueden obtener a partir de individuos infectados por lo que es muy difícil obtener partículas virales para su uso como estándares. Una ventaja más importante es que proporciona un estándar para todos los virus de ARN de ARN específicas en un reactivo, como teniendo un nivel de ARN es esencial para la cuantificación exacta de ARN 36. Sin embargo, su capacidad de cuantificar virus precisión está limitada por el hecho de que los efectos de matriz no se tienen en cuenta. Esto significa que copia genómicavalores de números no pueden considerarse absoluta y sólo deben considerarse en términos relativos. Se recomienda que un número suficiente de curva estándar alícuotas de valores de trabajo (paso 1.2) estar preparado para cubrir los estudios completos. Por ejemplo, cada 250 l alícuota proporciona suficiente reactivo para 6 placas de RT. Si se sabe que un estudio requerirá análisis de 500 muestras, se necesitaría un mínimo de 12 alícuotas (500 muestras / 7 muestras por placa RT / 6 placas RT por alícuota). Método EPA 1615 es un método basado en el rendimiento. Muchos fabricantes hacen reactivos equivalentes a los especificados en este documento y estos reactivos pueden ser sustituidos, siempre y cuando se cumplan los criterios de rendimiento. La curva patrón, que también sirve como un control de RT-qPCR positivo, es de valor en solucionar problemas de rendimiento. El rendimiento puede disminuir debido a la degradación del ARN, la vida útil de reactivo, el fracaso de los congeladores, la calibración del instrumento, y el error técnico. Problemas de rendimiento deben ser sospechosoed si las curvas de calibración diferentes de la mostrada en la Figura 4 o si no cumplen con la especificación de rendimiento para las curvas estándar. El ensayo de RT-qPCR es bastante robusto; completo fracaso es probablemente debido al manejo inadecuado de ARN o error técnico (por ejemplo, un reactivo faltante). Gran se debe tener cuidado en el manejo de muestras de ARN entre la extracción y la etapa de RT para reducir la degradación del ARN de las ribonucleasas. Recuperaciones poliovirus de las aguas subterráneas y de grado reactivo y recuperaciones de norovirus murino de las aguas subterráneas se reunieron el Método EPA 1615 los criterios de aceptación de rendimiento (Cuadro 11) y son similares a los reportados por otros 33,37,38. Recuperaciones norovirus murino de muestras LFB eran mucho más bajos que los de los virus de la polio y no habrían cumplido con los criterios de aceptación-poliovirus específico. Las razones de la recuperación norovirus murino menor de agua grado reactivo son desconocidos. Similar a los resultados del presente documento, Karim y colleagues reportaron una recuperación para el norovirus GI.1 del 4% del agua del grifo 39. Lee et al. 37 informó recuperaciones medias para norovirus murino y GII.4 norovirus humana de 18% y 26% de agua destilada utilizando filtros de disco, respectivamente. Usando condiciones similares a Lee y colegas, Kim y Ko observaron recuperaciones de 46% y 43% para estos virus, respectivamente 38. Gibbons et al. 40 obtuvieron alrededor de 100% de recuperación de GII.4 norovirus humano a partir de agua de mar, pero Kim y Ko 38 encontraron que la adición de sal al agua destilada a concentraciones similares o superiores a agua de mar reduce significativamente la recuperación del virus murino y resultó en una reducción de dos veces en la recuperación GII.4.

PCR cuantitativa (qPCR, ver materiales suplementarios para las definiciones de los términos utilizados en este manuscrito) y transcriptasa reversa-qPCR (RT-qPCR) son herramientas valiosas para la detección y cuantificación de virus entéricos humanos en el medio ambiente y bebiendo aguas, y en especial para muchos virus que hacen no replicar o replicar mal en sistemas de cultivo celular. Ambas herramientas han demostrado que muchos tipos de virus están presentes en aguas ambientales y de agua potable en todo el mundo 6.1. Su uso junto con la secuenciación de los fragmentos genómicos amplificados durante las investigaciones brote de la enfermedad ha proporcionado evidencia de la transmisión del virus a base de agua, ya que han demostrado que el virus encontrado en el agua potable es idéntico al cobertizo por los pacientes de brotes 7-10. Tanto qPCR y RT-qPCR son herramientas de salud pública útiles. Por ejemplo, los datos de los estudios realizados por la Agencia de Protección Ambiental (EPA) mostraron una relación fuerte seamediciones de los indicadores de interpolación por qPCR y efectos sobre la salud en las aguas de recreo. Como resultado, finales de 2012 Criterios de Calidad del Agua Recreativa de la EPA incluye un método qPCR para vigilar las playas recreativas 11,12. Borchardt y sus colegas también encontraron una fuerte relación entre la gastroenteritis aguda en las comunidades que utilizan las aguas subterráneas sin tratar y virus en las aguas subterráneas, medida por RT-qPCR 1. El propósito de este trabajo es describir el componente de ensayo molecular del Método EPA 1615 13,14. Este ensayo usa RT-qPCR para proporcionar una estimación cuantitativa de enterovirus y norovirus copias genómicas (CG) por litro basado en el volumen original de agua del medio ambiente o beber pasado a través de un filtro de electropositivo. Una visión general del procedimiento molecular se muestra en la Figura sección 1. Protocolo 1 detalla los procedimientos para la preparación de la curva estándar. Estos estándares se preparan a partir de un reactivo que contiene un RNUna copia de la secuencia diana para todos los conjuntos de cebador / sonda. Sección 2 describe el procedimiento de concentración terciario. Sección 3 da el procedimiento para la extracción de ARN de las muestras de agua y control concentrado. El ARN de cada muestra de prueba se transcribe invertir utilizando ensayos por triplicado y cebadores aleatorios para cebar la transcripción (Sección 4). El ADNc de cada reacción de transcripción inversa se ​​divide en cinco ensayos específicos del virus separadas que se analizan por triplicado mediante qPCR (Sección 5; Figura 2). El ensayo usa cebadores y sondas de la literatura científica (Tabla 1) que están diseñados para detectar muchos enterovirus y norovirus y un reactivo que contiene hepatitis G ARN para identificar muestras de ensayo que son inhibidores de la RT-qPCR 15.

<table><tbody><tr><td>Cámara de tubo de 1,5 ml</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-3000</td><td></td></tr><tr><td>1 &deg; C ladrillo frío</td><td>Diversified Biotech</td><td>BRIK-2501</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR Buffer II y 25 mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>N8080130-20</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C congelador</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td>Debe ser un congelador de descongelación</td></tr> <tr><td>manual-70 &deg; Congelador C o más frío</td><td>Thermo Scientific</td><td>MBF700LSAO-E</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de 96 pocillos</td><td>Biotech diversificado</td><td>CHAM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>ARN blindado EPA-1615</td><td>Asuragen</td><td>Pedido personalizado</td><td>Se utiliza para cuantificar el ensayo RT-qPCR</td></tr><tr><td>ARN blindado Virus de la hepatitis G</td><td>Asuragen</td><td>42024</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab Series</td><td></td></tr><tr><td>Cabina de bioseguridad</td><td>NuAir Suministro de equipos de laboratorio</td><td>Labgard 437 ES</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Affymetrix</td><td>10856</td><td>Tampón de grado cristalino o superior</td></tr><tr><td>AVE</td><td>Qiagen</td><td>1026956</td><td>Tampón de dilución de ARN portador</td></tr><tr><td>Tampón AVL</td><td>Qiagen</td><td>19073</td><td>Extracción tampón</td></tr><tr><td>ARN portador</td><td>Qiagen</td><td>No aplicable</td><td>Utilice el ARN portador suministrado con tampón AVL</td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-562-23 o 05-562-26</td><td></td></tr><tr><td>Rotores de centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>339080, 336380</td><td></td></tr><tr><td>Caja de seguridad refrigerada</td><td>Diversified Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&reg; 480 Probes Kit maestro</td> Roche <td>Diagnostics</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Utilice tubos sin ribonucleasa y desoxirribonucleasa con tapones a presión</td></tr><tr><td>Microcida III</td><td>Fitzgerald</td><td>99R-103</td><td></td></tr><tr><td>Película Microseal 'A'</td><td>Bio-Rad Laboratories HSA5001</td><td></td><td>Heat resistente</td></tr><tr><td>Película Microseal 'F'</td><td>Bio-Rad Laboratories MSA1001</td><td></td><td>Resistente al congelador</td></tr><tr><td>Mini-plato giratorio</td><td>Labnet International MPS1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Rainin</td><td>L8-20</td><td></td></tr><tr><td>Cámara multitubo</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-5000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de reacción óptica</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>4314320</tr><tr><td>Mezcla de nucleótidos para PCR</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td>Placa de PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>agua de grado PCR</td><td>Roche</td><td>3315932001</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>U.S. Biological</td><td>D9820</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de placas</td><td>Scientific</td><td>Industries MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Prionex gelatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0411</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Incluye tampones AW1 (tampón de primer lavado), AW2 (tampón de segundo lavado), AE (tampón de elución); el etanol debe agregarse a los tampones AW1 y AW2 antes de su uso; No utilice el tampón AL suministrado con el kit</td></tr><tr><td>Termociclador cuantitativo de PCR</td><td>Life Technologies</td><td>4351405</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación aleatoria</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td></td></tr><tr><td>Depósito de reactivos</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-381-27E</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Beckman Coulter</td><td>367501</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ARNasa</td><td>Promega</td><td>N2515 o N2615</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de referencia ROX</td><td>Life Technologies</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II o III Transcriptasa</td> inversa <td>Life Technologies</td><td>18064-022 o 18080044</td><td></td></tr><tr><td>Guantes quirúrgicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Life Technologies</td><td>4314879</td><td></td></tr><tr><td>Trisma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Unidades concentradoras centrífugas Vivaspin 20</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>VS2022</td><td></td></tr></tbody></table>

método epa 1615. la medición de enterovirus y norovirus ocurrencia en agua por cultura y rt-qpcr. parte iii. detección de virus por rt-qpcr

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 mide los enterovirus y norovirus presentes en las aguas ambientales y potables. Este método se desarrolló con el objetivo de tener un método estandarizado para su uso en múltiples laboratorios analíticos durante el período de monitoreo 3 de la Regla de Monitoreo de Contaminantes No Regulados. En este trabajo se presenta el protocolo para la extracción de ácido ribonucleico viral (ARN) a partir de concentrados de muestras de agua y para la medición cuantitativa de las concentraciones de enterovirus y norovirus mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). Las concentraciones de virus para el ensayo molecular se calculan en términos de copias genómicas de ARN viral por litro sobre la base de una curva estándar. El método utiliza una serie de controles de calidad para aumentar la calidad de los datos y reducir la variación entre laboratorios e intralaboratorios. El método se ha evaluado examinando la recuperación del virus a partir de aguas subterráneas y de grado reactivo sembradas con poliovirus tipo 3 y norovirus murino como sustituto de los norovirus humanos. Las recuperaciones medias de poliovirus fueron del 20% en las aguas subterráneas y del 44% en el agua de grado reactivo. Las recuperaciones medias de norovirus murinos con el ensayo RT-qPCR fueron del 30% en aguas subterráneas y del 4% en aguas reactivas.

Aquí presentamos un procedimiento para cuantificar enterovirus y norovirus en aguas ambientales y potables utilizando PCR cuantitativa con transcripción inversa. La recuperación media del virus de las aguas subterráneas con este procedimiento estandarizado del Método 1615 de la EPA fue del 20% para el poliovirus y del 30% para el norovirus murino.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. Parte III. Detección de virus por RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la concentración de enterovirus y norovirus en agua, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa. Esto se logra mediante la concentración terciaria de partículas virales a partir de muestras de agua concentradas, empleando ultrafiltración centrífuga. Luego, se preparan los reactivos para la curva patrón según se describe en el protocolo. A continuación, se realiza la extracción de ácidos nucleicos de los concentrados virales y de la curva patrón. Posteriormente, el ARN viral, diluido entre uno a cinco y uno a veinticinco veces, se transcribe inversamente utilizando cebadores aleatorios y transcriptasa inversa. Finalmente, se lleva a cabo la amplificación del ADNc viral empleando cebadores y sondas específicos para el virus en un termociclador en tiempo real, seguida del cálculo del número de copias genómicas de la muestra basado en la curva patrón.La principal ventaja del método EPA 1615 frente a otros métodos normalizados como ISO 15216 es que está diseñado específicamente para muestras de agua e incluye un ensayo de enterovirus. Este método puede proporcionar a los evaluadores de riesgos en el campo de la microbiología ambiental el estado actual de la determinación del riesgo por virus en aguas potables y recreativas. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la estandarización incorporada en él. El método es muy detallado y debe seguirse explícitamente. La demostración visual del método es fundamental porque incluso variaciones mínimas en el procedimiento pueden causar consecuencias negativas. Realizando la demostración del procedimiento hoy están Nichole Brinkman, Jennifer Cashdollar, Shannon Griffin y yo misma, Shay Fout. Todos somos miembros profesionales del laboratorio nacional de investigación sobre exposición de la EPA en Cincinnati, Ohio. Después de preparar una curva patrón según el protocolo descrito en el texto, prepare un concentrador centrífugo para cada muestra recolectada, añadiendo al menos 10 mililitros de PBS 1X y 2 % de BSA a la cámara superior de muestra. Después de incubar durante la noche, lavar y luego añadir las muestras según lo indicado en el protocolo descrito en el texto, centrifugue cada muestra de prueba en un rotor de cubeta oscilante a 3000-6000 ×g y 4 grados Celsius durante veinte a treinta minutos.Una vez que la muestra se haya concentrado adecuadamente y se haya transferido a un tubo fresco de microcentrifuga, agregue tampón de fosfato de sodio 0,15 molar para ajustar el volumen final a 400 microlitros más o menos dos microlitros. Para extraer los ácidos nucleicos, añada 200 microlitros de tampón de extracción para un control negativo de extracción y 200 microlitros del concentrado terciario para cada muestra de prueba o dilución de la curva patrón, en tubos separados de microcentrifuga, y extraiga el ARN según las modificaciones indicadas en el protocolo escrito de las instrucciones del fabricante del kit de extracción. Tras la preparación de los cebadores y sondas según se describe en el protocolo, prepare las mezclas maestras de transcripción inversa uno y dos en una sala limpia, como se muestra aquí.Utilizando una pipeta multicanal, transfiera 16,5 microlitros de la mezcla maestra de RT uno a los pocillos de cada placa de PCR. A continuación, con el tampón de elución del kit de extracción de ácidos nucleicos que contiene 400 unidades por mililitro de inhibidor de RNasa, diluya la matriz de muestras fortificadas de campo y de laboratorio o las muestras LSFM uno a cinco y uno a veinticinco. Transfiera 6,7 microlitros de los ácidos nucleicos de cada muestra de prueba, control y curva patrón a pocillos separados de la placa de PCR, utilizando pocillos por triplicado para las muestras de prueba y los controles y pocillos por duplicado para las curvas patrón.Agregue 6,7 microlitros de tampón de elución en los pozos de control sin plantilla o controles negativos (NTC). Incluya de dos a ocho NTC por placa de RT, utilizando dos para la primera muestra y luego dos o más por cada cuarta muestra adicional, distribuyendo los controles negativos a lo largo de la placa. Use el sellador de placa resistente al calor para sellar la placa de PCR, asegurándose de que cada pozo quede bien sellado. Luego, mezcle las muestras durante cinco a diez segundos antes de centrifugar brevemente a mayor o igual que 500 ×g.En un termociclador, incubar la placa a 99 grados Celsius durante cuatro minutos. Llevar la placa a cuatro grados Celsius y luego centrifugar brevemente por segunda vez. A continuación, retirar cuidadosamente el sello de la placa y añadir 16,8 microlitros de la mezcla maestra de RT 2 a cada pocillo. Después de sellar la placa, mezclar brevemente y centrifugar, colocar la placa en el termociclador y ejecutar el programa a 25 grados Celsius durante 15 minutos, seguido de 42 grados Celsius durante 60 minutos, 99 grados Celsius durante cinco minutos y, finalmente, mantener a 4 grados Celsius durante hasta ocho horas o almacenar las muestras a 70 grados Celsius negativos durante un período más prolongado.En una sala limpia, prepare mezclas maestras de PCR cuantitativa utilizando las guías para enterovirus, norovirus del genogrupo uno, norovirus del genogrupo dos y hepatitis G. Mezcle cada mezcla maestra y centrifugue brevemente. Luego, como se muestra en este ejemplo, agregue 14 microlitros de las mezclas maestras de PCR a los pozos correspondientes de una placa de reacción óptica etiquetada, utilizando placas separadas para cada ensayo de qPCR. Dispense seis microlitros del cDNA correspondiente en los pozos adecuados. A continuación, mezcle las muestras y centrifugue brevemente.Configure el software del termociclador según se describe en el protocolo y realice el ensayo de qPCR del virus de la hepatitis G en las muestras de matriz de campo y laboratorio fortificadas sin diluir y diluidas, o muestras de LFSM, antes de realizar todos los demás ensayos de qPCR. Compare el valor medio de Cq de cada muestra con el valor medio de Cq de la hepatitis G predeterminado para cada nuevo lote de reactivo de hepatitis G. Utilice la dilución más baja de la muestra de campo o LDF que sea menor en un valor de Cq al valor medio de Cq de la hepatitis G para los ensayos de qPCR de enterovirus y norovirus.Configure el software del termociclador para PCR cuantitativa según las instrucciones del fabricante. Identifique las muestras de la curva patrón como estándares y, para cada dilución de la curva patrón, introduzca los valores de copias genómicas que se indican aquí. Ejecute la placa a 95 grados Celsius durante diez minutos, seguido de 45 ciclos de 15 segundos a 90 grados Celsius y un minuto a 60 grados Celsius.Determine si cada curva estándar cumple con los valores aceptables indicados en esta tabla. Después de calcular la desviación estándar, la pendiente, el coeficiente de determinación (R²) y el porcentaje de eficiencia según las ecuaciones del protocolo descrito en el texto, registre los valores de copias genómicas o GC calculados por el software del termociclador para todas las muestras de prueba, basándose en las curvas estándar que cumplen con los criterios especificados en esta tabla, así como los valores medios de GC para cada muestra. Determine las GC por litro para cada muestra de prueba utilizando la siguiente ecuación, donde GC es el número medio de copias genómicas recién calculado.El factor 199 es el factor total de dilución para las reacciones de volumen que ocurrieron durante las concentraciones terciarias. Los pasos de extracción de ARN y RT-qPCR. DF es el factor de dilución que compensa la inhibición y D es el volumen del ensayo de la muestra de agua original en litros.Finalmente, calcule el GC total de las muestras de blanco fortificado de laboratorio o LFB y de blanco de reactivo de laboratorio o LRB multiplicando el valor medio de GC determinado previamente por 199 y dividiendo entre 0,3. En general, la recuperación del virus se determinó utilizando muestras emparejadas de agua subterránea LFSM de campo, provenientes de un total de siete conjuntos de muestras recuperadas de tres plantas públicas de tratamiento y un pozo privado. Los niveles de siembra para las muestras LFSM fueron de tres millones de MPN del poliovirus tipo tres y cinco millones de PFU del norovirus murino.Se utilizó el norovirus murino para la evaluación inicial en un solo laboratorio del método EPA 1615 porque el reactivo de la curva patrón no estaba disponible en ese momento. Para muestras de agua subterránea, la recuperación media del poliovirus fue del 20% con un error estándar del 2%, mientras que la recuperación media del norovirus murino fue del 30% con un error estándar del 3%. La muestra habitual de campo de agua subterránea para cada LFSM no mostró enterovirus ni norovirus detectables. Las muestras de blanco fortificado en el laboratorio (LFB) y de blanco de reactivo en el laboratorio (LRB) se analizaron utilizando agua de grado reactivo inoculada y no inoculada.El recupero del poliovirus promedió 44% con un error estándar de 1%, mientras que el recupero del norovirus murino promedió 4% con un error estándar de 0,5%. Esta figura muestra curvas estándar típicas para enterovirus y norovirus del genogrupo dos. La curva del norovirus del genogrupo dos cumple con los criterios de la curva estándar, con un valor de R cuadrado de 0,9987, una desviación estándar general de 0,14 y una eficiencia del 101%. La curva del enterovirus cumple con los criterios de desempeño de la curva estándar, con un valor de R cuadrado de 0,9874, una desviación estándar general de 0,58 y una eficiencia del 103%, pero tiene una sensibilidad aproximadamente 100 veces menor y, por lo tanto, un límite de detección más alto que las curvas del norovirus.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo concentrar y detectar enterovirus y norovirus en el agua utilizando RT-qPCR. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente ocho horas para muestras con baja turbidez. Para muestras con mayor turbidez, puede requerirse tiempo adicional, especialmente en el paso de concentración terciaria.Al realizar este procedimiento, es importante proteger las muestras de la contaminación por RNasa antes de la transcripción inversa. No olvide que la PCR es una técnica muy potente y útil. Son necesarias precauciones como la separación de estaciones de trabajo y el uso de controles adecuados para minimizar los resultados falsos positivos y falsos negativos.

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