Name: Una tubería rápida y fiable para el estudio de caso Análisis Bacteriano Transcriptome: Regulación Génica Serina-dependiente en Streptococcus pneumoniae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprende análisis de transcriptoma bacteriano mediante microarrays de ADN y software personalizado. Este método permite estudiar cambios globales de expresión génica en Streptococcus pneumoniae bajo condiciones específicas de forma rápida y confiable.

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Damos las gracias a Anne de Jong y Siger Holsappel para obtener ayuda con la producción de diapositivas microarrays de ADN. El apoyo de Anne de Jong para el análisis de la bioinformática también se agradece. También agradecemos a Jelle Slager para revisar el documento. Muhammad Afzal y Irfan Manzoor son apoyados por la Universidad GC, Faisalabad, Pakistán bajo el programa de desarrollo de la facultad de HEC Pakistán.

1. Preparación de los medios de comunicación, y cultivo celular <ol><li> Crecer S. D39 pneumoniae cepa de tipo salvaje 21 como se describió anteriormente 11. Inocular células almacenadas a -80 ° C en glicerol al 10% (con relación 1/100 en tubos de 50 ml estériles) en 50 ml químicamente medio definido (CDM) con un pH final de 6,4 15, pero omitir L-serina a partir del aminoácido mezcla. Nota: se utilizaron dos MDL diferentes; uno que contiene una concentración mínima de L-serina (150 mM) y el otro que contiene una concentración máxima de L-serina (10 mM). Esta concentración mínima es básicamente la concentración de L-serina en el plasma sanguíneo humano y el objetivo es comparar la expresión de genes de S. pneumoniae cepa D39 bajo estas dos condiciones. </li></ol> 2. Aislamiento de ARN total <ol><li> Materiales <ol><li> Utilice fenol ácido, ARN de grado para el aislamiento de ARN total. </li><li> Macaloide: <ol><li> Suspender 2 gramos deMacaloide en 100 ml de TE y hervir durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente y se somete a ultrasonidos hasta Macaloide gels.Centrifuge la solución a 2000 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente, se vuelve a suspender en 50 ml de TE pH 8 y se almacena a 4 ° C. </li></ol></li><li> Soluciones: <ol><li> Tratar a todos sus soluciones con pirocarbonato de dietilo (DEPC). Añadir 100 l DEPC / 100 ml de solución, incubar O / N a 37 ° C y autoclave durante 15 min. </li></ol></li></ol></li><li> Metodología <ol><li> Crecer 50 ml de S. cultivo celular pneumoniae D39 en tubos de 50 ml a 37 ° C (sin agitación) hasta mediados de la fase exponencial (OD ~ 0,3). Culturas centrifugar a 4 ° C en 10000 × g durante 2 min. Deseche los medios de comunicación y congelar inmediatamente los sedimentos de células en nitrógeno líquido. </li><li> Premix 300 l de cloroformo: IAA (24: 1) y 300 l de fenol (fenol ácido, ARN grado). Utilice 500 l de la fase orgánica en el paso 2.2.3. </li><li> Preparar la siguiente mezcla con antelación en tubos con tapa de rosca-ARN libre: 00,5 g de perlas de vidrio, 50 l 10% de SDS, 500 l de fenol / cloroformo: IAA (tal como se preparó en el paso 2.2.2), la capa de Macaloide (150-175 l, no exacta ya que es muy viscoso). Resuspender los sedimentos de células en 400 l de TE (DEPC) y añadir las células resuspendidas en los tubos con tapa de rosca. </li><li> Para romper las células, colocar los tubos con tapa de rosca en un batidor de bolas para pulsos 2x 60 &quot;(&quot; homogeneizar &quot;) con 1 min de intervalo en el hielo. Centrifugar las muestras durante 10 min a 10.000 × g (4 ° C). </li><li> Transferir la fase superior a un tubo nuevo, añadir 500 l de cloroformo: IAA (24: 1) y se centrifuga durante 5 min a 10.000 × g (4 ° C). </li><li> Transferir 500 l de la fase superior a tubos nuevos, agregar 2 volúmenes (1 ml) de tampón de lisis / unión y mezclar pipeteando arriba y abajo. Aislar el ARN total usando el kit de aislamiento de ARN y seguir el protocolo recomendado fabricante. </li></ol></li></ol> 3. ARN Limpieza &lt;<html> ol&gt; <li> Para eliminar la contaminación de ADN a partir de ARN total, añadir 100 l mezcla DNAsaI (tampón DNAsa 90 ly 10μl DNAsaI) y se incuba durante 20-30 minutos a 15-25 ºC. </li><li> Wash limpia ARN utilizando el kit de ARNasa. Obtener 50 l de volumen eluido. </li></ol> 4. Análisis de ARN <ol><li> Determinar la concentración de ARN en un espectrofotómetro. Determinar la calidad del ARN mediante el uso de un ensayo de la siguiente manera (Figura 2). <ol><li> Diluir 1 l de muestra con 50 l de agua DEPC para obtener una concentración de 20 a 200 ng / l. </li><li> Utilice 1 l muestra de ARN diluido para comprobar la calidad en la Bioanalyser de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol></li><li> Nota: una relación de 23S: 16S de alrededor de 2,0 se considera bueno 1 A260 unidad de RNA corresponde a 40 mg / ml.. Una cantidad recomendada para el etiquetado es de 10-20 g. </li></ol> 5. Preparación de ADNc y Etiquetado ntent &quot;&gt; NOTA: El siguiente protocolo se siguió para la preparación de cDNA y etiquetado. <ol><li> Recocido <ol><li> Realizar reacción de hibridación en 300 tubos de PCR mu l, manteniendo la concentración de ARN total de 10-15 mg para las diapositivas hechas en casa o 5 mg para las diapositivas hechos a la empresa. Mezclar ARN con 2 nonamers l azar (1,6 g / l) y añadir agua libre de nucleasas si es necesario para mantener el volumen final de la mezcla de recocido a 18 l. </li><li> Mantener la mezcla de hibridación a 70 ° C durante 5 min. Después de eso, enfriar la mezcla a TA durante 10 min (recocido) y si es necesario, de girar las reacciones a la parte inferior del tubo. Colocar los tubos de reacción en hielo durante al menos 1 min. </li></ol></li><li> Transcripción inversa <ol><li> Preparar la mezcla de la transcriptasa inversa de la siguiente manera: a la mezcla de recocido 18 l, añadir 12 l de mezcla Master (que consta de 6 l de tampón 5X First Strand, 3 l 0,1 M DDT, 1,2 l 25x AA-dUTP mezcla / nucleótidos y 1,8 l revertir transcriptase (1 l de diapositivas hechos a la empresa). Mantenga la mezcla de reacción durante 2-16 horas a 42 ° C. </li></ol></li></ol> 6. La degradación de mRNA y purificación de cDNA <ol><li> Para degradar el ARNm a partir de la mezcla de reacción, añadir 3 l de 2,5 M NaOH y lugar a 37 ° C durante aproximadamente 15 min. A continuación añadir 15 l de 2M HEPES ácido libre para neutralizar el NaOH. </li><li> Se purifica la mezcla de ADNc por PCR usando columnas de limpieza y siga el protocolo del fabricante. </li></ol> 7. Medición de cDNA Concentración <ol><li> Medir las concentraciones de ADNc en un espectrofotómetro. Para continuar con el etiquetado, comprobar que la concentración de ADNc es de al menos 60 ng / l (diapositivas caseras) o 20 ng / l (toboganes hechos a la empresa). </li></ol> 8. Etiquetado de cDNA con Amine reactiva Dye y Purificación <ol><li> Use colorante reactivo con aminas para etiquetar el ADNc. Mezclar directamente el ADNc con una alícuota (5 l) deamina reactiva tinte. </li><li> Incubar la mezcla a RT, en la oscuridad, durante 60 a 90 min y proceder directamente a la purificación de cDNA marcado con colorante. Purificar cDNA marcado tinte usando PCR columnas de limpieza y siguiendo el protocolo del fabricante. Eluir cDNA en 50 l de tampón de elución. </li></ol> 9. Medición de cDNA Labelled <ol><li> Utilice un espectrofotómetro para medir la incorporación de colorantes reactivos con amina en el ADNc. Compruebe que la concentración de colorantes reactivos con amina es de al menos 0,5 pmol / l en un volumen total de 50 l. </li></ol> 10. Mezcla de muestras de cDNA Labelled <ol><li> Para diapositivas caseras, utilizar todo el cDNA marcado para la hibridación con diferencia no más de 30% en la concentración de ADNc. Para toboganes hechos a la compañía, use cDNA con no más de 2 veces la diferencia en la concentración de cDNA. Nota: normalmente, se necesita alrededor de 300 ng de cDNA para diapositivas hechos a la empresa, lo cual es muy poco en comparación con el reqcantidad de cDNA pedirá otra para diapositivas caseras. </li></ol> 11. La hibridación y lavado <ol><li> Utilice los siguientes reactivos: agua desmineralizada, etanol 99%, Buffer SHY (hecho en casa; con 40 l de levadura ARN). Preparar máximo 1 ml de SHY. </li><li> Aparato de preparación y soluciones <ol><li> Encienda concentradores de vacío y calentador al menos 1 hora antes de su secado. Encienda el horno de hibridación, con el punto de consigna ajustado a la temperatura de hibridación correcto (por S. pneumoniae microarrays de ADN, utilizar 45 ° C). Del mismo modo, precalentar casete de hibridación y horno durante 30-60 min. </li><li> Precaliente búfer SHY a 68 ° C durante al menos 30 minutos. </li></ol></li><li> Preparación de la muestra (ADNc marcado) <ol><li> Combinar cantidades iguales de ADNc marcados (max 30% de diferencia). Secar la muestra usando los concentradores de vacío a alta temperatura (aprox. 40 min) hasta que el volumen es menor que 7 l. </li></ol></li><li> Lifter antideslizante <ol><li> Utilice levantador-se desliza limpias.Nota: ± 30 l se pueden cargar en la diapositiva. </li><li> Limpie el levantador-se desliza con jabón, un montón de agua del grifo y etanol al 100%. Nota: Los resbalones levantador Dirty dan de alta de fondo. </li><li> Deje secar al aire el levantador-se desliza con pistola de aire para soplar las partículas de polvo. Coloque un levantador antideslizante limpio en la diapositiva con el revestimiento de teflón blanco a los lados hacia abajo. </li></ol></li><li> La adición de tampón de hibridación (a ADNc marcado) <ol><li> Disolver las muestras de colorante secas en 7 l H 2 O y se incuba a 94 ° C durante 2 min. </li><li> Inmediatamente, añadir 35 l precalentado búfer SHY (68 ° C), mezclar suavemente y girar a la velocidad máxima durante 1 minuto para deshacerse de precipitados. Precaliente la sonda a 68 ° C durante aproximadamente 5 minutos hasta que la carga. </li></ol></li><li> Deslice levantador de deslizamiento y montaje y de precalentamiento. <ol><li> Coloque el soporte de diapositivas hibridación en un bloque de calor a 50 ° C. Coloque las diapositivas de microarrays de ADN con el levantador de deslizamiento en el soporte de diapositivas hibridación climatizada y precalentar la diapositiva con levantador de deslizamiento por un minuto. Realice los siguientes pasos lo más rápido posible. </li><li> Añadir 40 l de la muestra diana hasta el final de la diapositiva. Permitir que el fluido fluya entre las superficies de vidrio por la fuerza capilar. Realizar todas pipeteo lenta y cuidadosamente. </li><li> Mantenga las diapositivas con elevador horizontal antideslizante en todo momento y se mueven lentamente para asegurarse de que el levantador de deslizamiento no se movió. </li><li> Tome el casete de hibridación precalentado fuera del horno de hibridación y cerrar la máquina. Coloque papel de filtro empapado con 3 ml 2x SSC (citrato salino estándar) en el casete de hibridación. </li><li> Coloque suavemente el soporte de diapositivas hibridación con las diapositivas en el casete de hibridación. Cierre el casete de hibridación y poner en el horno de hibridación de nuevo (por alrededor de 16 a 18 h). </li></ol></li><li> Lavado de diapositivas <ol><li> Preparar frescas de lavado-buffers I, II y III (750 ml por paso de lavado). Por 500 ml lavar-buffer I, utilizar 2 x SSC / SDS al 0,5%. Por 500 ml lavado buffer II, utilice 1 x SSC / SDS al 0,25%. Por 500 ml lavar-buffer III, use 1 x SSC / 0,1% SDS (opcional) </li><li> Coloque los lavaderos tampones a 30 ° C (para asegurarse de SDS se disuelve). </li><li> Sumergir los portaobjetos tan rápidamente como sea posible, pero muy suavemente, en un tubo Falcon de 50 ml lleno con el tampón de lavado I hasta que el vidrio se apoya en la parte inferior cónica del tubo. </li><li> Después de unos segundos, cuando se hunde el levantador antideslizantes a la parte inferior del tubo, saque la diapositiva con pinzas sin rayar la matriz y poner en el estante de la estación de lavado. Continúe con el lavado con ningún espacio de tiempo. </li><li> Lavar los portaobjetos durante 5 min en 500 ml de tampón de lavado I (en una estación de lavado). Darle un segundo lavado durante 20-30 minutos en 500 ml lavar-buffer II (en una estación de lavado). Del mismo modo, lavar los portaobjetos durante 5 min en 500 ml de tampón de lavado III (opcional) (en una estación de lavado). </li><li> Secar los portaobjetos durante 2 minutos a 2000 rpm. </li></ol></li></ol> Análisis de microarrays 12. <ol><li> Explorar imágenescon las respectivas longitudes de onda en el escáner y guardar en una carpeta &quot;Jove Proyecto&quot;. </li><li> Utilice software para analizar los archivos escaneados inicialmente como se describió anteriormente 22. Después de ejecutar este software, seleccione la pestaña &quot;Abrir imagen&quot; para cargar el archivo de imagen de color rojo (-.550) como &quot;Rojo&quot; y el archivo de imagen verde (-.635) como &quot;Verde&quot;. Sube el archivo gal (.gal) con S. pneumoniae lista de arreglo de archivo de imagen al seleccionar &quot;Cargar Lista de matrices&quot; ficha 22. Nota: esta lista de arreglo consistió en 48 cuadrículas, en cada cuadrícula había 16 filas y 15 columnas. Cada punto en la cuadrícula representa un solo gen y de información de puntos incluyendo el nombre de genes se añade a través de un archivo de descripción de lugar. Los números de punto se dan de izquierda a derecha y de arriba abajo. </li><li> Después de detectar cuidadosamente las rejillas, seleccione la pestaña &quot;Buscar Array, Encuentra Bloques, Alinear Características&quot; para alinear los puntos. Después de alinear todas las características, analizar la imagen seleccionando la opción &quot;Analizar&quot; tuna b. Crear un nuevo archivo con los resultados, histograma y diagrama de dispersión. Guarde este archivo de pestaña &quot;Guardar los resultados como&quot; como un archivo .gpr para su posterior análisis. </li><li> Realice mayor normalización y tratamiento de datos con desarrollo propio paquete de software Microprep como se describe 9. </li><li> Utilice biológicos repeticiones independientes para datos de microarrays de ADN que son de tinte intercambiado. Realizar implementación CyberT de una variante del t-test1 y calcular tasas de falso descubrimiento (FDR) como se describe 9. </li><li> Para los genes expresados ​​diferencialmente, tome p &lt;0,001 y FDR &lt;0,05 como estándar. </li><li> Sube DNA microarrays de datos en la página de presentación NCBI para conseguir un número de acceso GEO (Expresión Génica Omnibus). </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Se describe un protocolo fácil de usar que puede ser aplicado para realizar el análisis del transcriptoma enteras de bacterias. El punto clave de esta técnica en particular es que las condiciones en que se cosechan las células variará. Después de cosechar las células y el aislamiento de ARN, esta técnica se hace igual para todos los tipos de muestras bacterianas y sigue los pasos exactamente idénticos y por lo tanto, se puede aplicar a cualquier tipo de cultivo bacteriano. El protocolo es muy simple y conveniente y comi...

El estudio de todo el conjunto de la abundancia de ARNm (transcriptoma) codificada por el genoma de un organismo unicelular o una célula eucariota en un momento específico o bajo una condición específica, incluyendo la sobreexpresión del gen o knock-out, se llama transcriptómica. Transcriptómica nos permite observar hasta qué punto los genes se expresan bajo una condición particular en un punto X tiempo y nos da información acerca de la fuerza con los genes se expresan con respecto a una referencia. Un microarray es una matriz bidimensional sobre un sustrato sólido (por lo general un portaobjetos de vidrio o silicio de células de película delgada) que se puede utilizar para ensayar grandes cantidades de material biológico mediante cribado de alto rendimiento, y miniaturizado, el procesamiento de multiplexado y en paralelo y detección métodos. Microarrays vienen en varios tipos, incluyendo microarrays de ADN, microarrays de proteínas, péptidos, microarrays microarrays de tejidos, microarrays de anticuerpos, microarrays de celulares y otros. Un microarray de ADN esbásicamente un conjunto de manchas de ADN microscópicos fijado a una superficie sólida, generalmente de vidrio. Microarrays de ADN se utilizan para medir los niveles de expresión de un gen o un conjunto de genes simultáneamente o determinar el genotipo de múltiples regiones de un genoma 2,3. Picomoles (10 -12 moles) de una sonda están presentes dentro de cada punto de ADN que representa una secuencia de ADN específica, también conocido como un reportero. Las moléculas de ARNm etiquetados de las muestras se denominan &quot;objetivos&quot;. Los fluoróforos se utilizan para medir la hibridación sonda-diana y detección de blancos marcados con fluoróforo determina la abundancia relativa de secuencias de ácidos nucleicos en el objetivo. Un experimento de microarrays puede lograr múltiples pruebas genéticas en paralelo debido a una matriz puede contener decenas de miles de sondas. El diseño de un sencillo experimento de microarrays se muestra en la Figura 1. Recientemente, se estableció en nuestro y otros laboratorios que estas matrices son reutilizables, lo que hace que esta técnica bastante costo-effective. Diferentes técnicas de aislamiento y purificación de ARN se han desarrollado a lo largo de los años, incluyendo C-TAB, SDS y métodos GT 4-8. Además, varios kits comerciales están también disponibles. Para la expresión de genes de ARN de alta calidad es muy importante. Por lo tanto, los métodos de aislamiento de ARN se modifican para obtener una cantidad máxima de ARN. Del mismo modo, se reducen al mínimo los pasos para la preparación de cDNA y etiquetado de cDNA. La normalización de los datos después de la exploración también se lleva a cabo de manera eficiente mediante el uso de en-casa construida paquetes y herramientas de software 9. Streptococcus pneumoniae es un patógeno humano Gram-positivas que coloniza la nasofaringe y es la causa de múltiples infecciones, como la neumonía, sepsis, otitis media y meningitis 10. La bacteria puede utilizar una amplia variedad de los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia 11,12. Un número de estudios han llevado a cabo en elel metabolismo del nitrógeno neumocócica y la regulación destacando la importancia de los aminoácidos y su papel en la virulencia 13,14. En este estudio, la respuesta transcriptómica de S. pneumoniae a la evolución de las concentraciones de L-serina, un ácido muy presentes en el plasma sanguíneo humano amino, se reportó el uso de microarrays de ADN. La respuesta transcriptómica de S. pneumoniae crecido en una concentración mínima de L-serina (150 mM) se comparó con la crecido en una concentración máxima (10 mM) de la serina. Se utilizó medio químicamente definido (CDM o medio mínimo) 15 para este estudio para controlar la concentración de serina. El objetivo de este estudio es hacer que esta técnica fácil de usar y proporcionar diferentes herramientas para la normalización y el análisis de datos. Por lo tanto, se han desarrollado una serie de herramientas para el análisis e interpretación de datos. FIVA (Funcional Information Viewer y Analyzer) proporciona una plataforma para procesamiento de la información contenida en grupos de genes que tienenlos patrones de expresión de genes similares y para la construcción de perfiles funcionales 16. FISCAL es otro paquete de software que facilita la identificación de las funciones y las anotaciones de genes putativos 17. Al hacer uso de métodos de agrupamiento, DIVULGAR proporciona un algoritmo de detección de ADN sitio de unión. Motivos Cis-regulador de los genes pueden proyectarse utilizando este algoritmo 18. Genome2D ofrece una plataforma basada en Windows para la visualización y análisis de datos transcriptoma ofreciendo gamas de colores diferentes para caracterizar los cambios en los niveles de expresión de genes en un mapa del genoma 19. El servidor web pimienta ofrece, además del método todo-en-un análisis, una caja de herramientas para la minería para regulons, promotores y de unión al factor de transcripción sitios de 20. Anotación completa de las regiones intergénicas en un genoma bacteriano se puede lograr mediante el uso de este paquete. Los biólogos pueden beneficiarse enormemente de pimienta, ya que les ofrece una plataforma para el diseño de experimentos para que la información hipótesis puede confirmarse in vitro 20. Estos paquetes de software contribuyen significativamente a la análisis de microarrays ya que la mayoría de ellos son libremente disponible y crea la normalización de datos y análisis muy fiable.

<table><tbody><tr><td>Fenol ácido</td><td>SigmaAldrich</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de ARN Roche</td><td>Roche Applied Science</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Perlas</td><td></td><td>de vidrio 105015</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Boom</td><td>92013505.1000.</td><td></td></tr><tr><td>IAA</td><td></td><td>106630</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Nanodrop</td><td>ND-100</td><td></td></tr><tr><td>Agilent BioAnalyser</td><td>Agilent G2940CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superscript III</td><td>Tecnologías de vida Invitrogen 18080044</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AA-dUTP</td><td>Tecnologías de vida Invitrogen</td><td>AM8439</td><td></td></tr><tr><td>DDT</td><td>Tecnologías de vida Invitrogen</td><td></td><td></td>18080044</tr><tr><td>primer tampón de hebra</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SigmaAldrich</td><td>S8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-550</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62262</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-650</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62265</td><td></td></tr><tr><td>SHY Buffer</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7033-125ML</td><td></td></tr><tr><td>Enfriador Speedvac</td><td>Eppendorf</td><td>RUGNE3140</td><td>Concentrador Speedvac plus</td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>Grant Boekel</td><td>Iso-20</td> Lifter-slips <td></td></tr><tr><td></td><td>Erie Scientific</td><td>25x60I-M-5439</td><td></td></tr><tr><td>Toallita</td><td>KIMTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>SigmaAldrich</td><td>L3771-100g</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>SigmaAldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Cargador automático Genpix 4200A1</td><td>MSD tecnologías</td><td></td> analíticas <td>Escáner de microarrays</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>SigmaAldrich</td><td>104766</td><td></td></tr></tbody></table>

una tubería rápida y fiable para el estudio de caso análisis bacteriano transcriptome: regulación génica serina-dependiente en<em&gt; streptococcus pneumoniae</em

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

La expresión génica y su regulación son muy importantes para entender el comportamiento de las células en diferentes condiciones. Varias técnicas se utilizan hoy en día para estudiar la expresión génica, pero la mayoría están limitados en términos de proporcionar una visión global de la expresión de todo el transcriptoma. Microarrays de ADN ofrecer una tecnología de investigación rápida y económica, lo que da una visión completa de la expresión génica global y tienen un gran número de aplicaciones, incluyendo la identificación de nuevos genes y factores de transcripción sitios, la caracterización de la actividad transcripcional de las células y también vinculantes ayudar en el análisis de miles de los genes (en un solo experimento). En el presente estudio, las condiciones para el análisis del transcriptoma bacteriana de cosecha de células para el análisis de microarrays de ADN han sido optimizados. Teniendo en cuenta el tiempo, los costos y la precisión de los experimentos, esta plataforma tecnológica resulta ser muy útil y universalmente applicabale para estudiar transcripto bacterianames. Aquí, realizamos el análisis de microarrays de ADN con Streptococcus pneumoniae como un caso-estudio comparando las respuestas transcripcional de S. pneumoniae cultiva en presencia de diferentes concentraciones de L-serina en el medio. El ARN total se aisló utilizando un método de Macaloide utilizando un kit de aislamiento de ARN y la calidad del ARN se comprobó mediante el uso de un kit de comprobación de la calidad del ARN. Se preparó ADNc utilizando transcriptasa inversa y las muestras de ADNc se marcaron utilizando uno de los dos colorantes fluorescentes de amina reactiva. Hechas en casa de ADN de microarrays diapositivas fueron utilizados para la hibridación de las muestras de ADNc marcadas y los datos de microarrays se analizaron mediante el uso de un marco de pre-procesamiento de datos de microarrays de cDNA (Microprep). Finalmente, Cyber-T se utilizó para analizar los datos generados usando Microprep para la identificación de estadísticamente significativas genes expresados ​​diferencialmente. Paquetes de software Además, construido en la casa (pimienta, FIVA, DIVULGAR, FISCAL, Genome2D) se utilizaron para analizardatos.

ARN, aislamientos y análisis de ADNc L-serina es uno de los aminoácidos esenciales y su concentración en el plasma sanguíneo humano varía desde 60 hasta 150 mM en niños y adultos. Su papel en la biosíntesis de purinas y pirimidinas destaca su importancia en el metabolismo y es un precursor de varios aminoácidos (glicina, cisteína y triptófano). Para estudiar el impacto de la L-serina en todo el transcriptoma de S. Se realizó pneumoniae D39 cepa de tipo salv...

Este manuscrito describe el uso de la tecnología de vanguardia proporcionada por los microarrays de ADN. Los microarrays proporcionan una visión general de los cambios transcriptómicos en las bacterias que se producen en una condición específica. Además, destacamos la facilidad con la que se pueden analizar grandes cantidades de datos mediante el uso de convenientes paquetes de software desarrollados internamente.

Una tubería rápida y fiable para el estudio de caso Análisis Bacteriano Transcriptome: Regulación Génica Serina-dependiente en<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una visión general de los cambios transcriptómicos en bacterias provocados bajo una condición específica. Esto se logra primero cultivando y recolectando células bacterianas bajo una condición específica. A continuación, se aísla el ARN total de las células recolectadas y se sintetiza ADNc a partir del ARN.Luego, los ADNc se etiquetan y hibridan en láminas de microensayo fabricadas internamente. Finalmente, la lámina se lava, tras lo cual se escanea y analiza. En última instancia, el microarreglo se utiliza para mostrar los cambios transcriptómicos en células bacterianas bajo la condición específica.La principal ventaja de la tecnología de microarreglos de ADN frente a otros métodos existentes para estudiar la expresión génica, como la QPCR o el blotting northern, es que proporciona una visión global de todos los cambios transcripcionales ocurridos bajo una condición específica. Es rápido, confiable y relativamente económico. El procedimiento será demostrado por Mohammed Sal y Airon Manzu, estudiantes del PSD de mi laboratorio de genética molecular. Después de descongelar, s pmo, ED 39 pellets celulares y resuspenderlos en 400 microlitros de te según el protocolo del texto, prepare lo siguiente en tubos de rosca libres de ARN: 0,5 gramos de perlas de vidrio, 50 microlitros de SDS al 10 %, 500 microlitros de fenol-cloroformo previamente preparado y los pellets celulares resuspendidos.Para romper las células, coloque los tubos en un homogeneizador de perlas y homogenice dos veces durante 60 segundos cada vez, colocándolos en hielo durante un minuto entre pulsos, luego centrifugue las muestras a 10.000 Gs y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Transfiera la fase superior a un tubo nuevo y agregue 500 microlitros de cloroformo, luego centrifugue durante cinco minutos adicionales. Pipetee 500 microlitros de la fase superior hacia tubos nuevos.Añada dos volúmenes de tampón de lisis y unión, y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego, utilizando un kit de aislamiento de ARN, aísle el ARN total siguiendo el protocolo del fabricante para eliminar el ADN contaminante del ARN. Añada 100 microlitros de la mezcla D a's one y incube a 15-25 grados Celsius durante 20-30 minutos.Utilice el kit de RN para lavar el ARN limpio y eluirlo en un volumen de 50 microlitros para llevar a cabo la reacción de an arrodillarse en tubos PCR de 300 microlitros. Mezcle el ARN total con dos microlitros de monómeros aleatorios y use agua libre de nucleasas si es necesario para llevar el volumen hasta 18 microlitros. Incube la mezcla de an arrodillarse a 70 grados Celsius durante cinco minutos.Luego, enfríe las reacciones a temperatura ambiente durante 10 minutos y hágales una centrifugación rápida antes de colocar los tubos en hielo durante al menos un minuto. Para transcribir a ADNc, prepare la mezcla de transcripción inversa, combine 18 microlitros de la mezcla con 12 microlitros de la mezcla maestra e incube la reacción a 42 grados Celsius durante dos a 16 horas. Degrade el ARNm de la reacción añadiendo tres microlitros de NaOH 2,5 M y colóquelo a 37 grados Celsius durante aproximadamente 15 minutos.Luego, agregue 15 microlitros de ácido fósforico libre de heces dos molar para neutralizar el NAOH. A continuación, después de usar columnas de purificación de PCR para purificar el ADNc, mida la concentración de ADNc mediante un espectrofotómetro para etiquetar el ADNc. Añada cinco microlitros de un colorante reactivo con amina a 20-60 nanogramos por microlitro de ADNc.Coloque la mezcla en la oscuridad y en una habitación a temperatura ambiente durante 60 a 90 minutos antes de usar columnas de purificación PR para purificar el ADNc marcado, eluyendo en 50 microlitros de tampón de elución. Con un espectrofotómetro, asegúrese de que la concentración de ADNc marcado sea de al menos 0,5 picomoles por microlitro en un volumen total de 50 microlitros. Después de preparar el tampón shy, según el protocolo descrito, precaliente el tampón a 68 grados Celsius durante al menos 30 minutos. Para preparar la muestra, combine cantidades iguales de ADNc marcados y luego use concentradores al vacío a alta temperatura para reducir el volumen a siete microlitros o menos.Mientras tanto, para limpiar las plaquitas elevadoras y reducir la señal de fondo, utilice jabón y abundante agua del grifo, seguido de etanol al 100 % después de secar las plaquitas con aire; coloque una sobre un portaobjetos con el revestimiento blanco de teflón hacia abajo. A continuación, disuelva las muestras de colorante secas en siete microlitros de H2O e incube a 94 grados Celsius durante dos minutos. Inmediatamente, añada 35 microlitros de tampón shy precalentado, mezcle suavemente y centrifugue a velocidad máxima durante un minuto.Para pelotizar los precipitados, precaliente la sonda a 68 grados Celsius durante aproximadamente cinco minutos antes de cargarla. Para armar la portaobjetos y la cubierta deslizante, coloque el portaportaobjetos de hibridación sobre un bloque térmico a 50 grados Celsius. Coloque las portaobjetos con microarreglos de ADN junto con la cubierta deslizante sobre el portaportaobjetos de hibridación calentado y precaliente la portaobjetos con la cubierta deslizante durante un minuto.Luego, lo más rápidamente posible, agregue 40 microlitros del blanco de la muestra al extremo del portaobjetos. Deje que el líquido fluya entre las superficies de vidrio por fuerza capilar. Ahora retire el cassette de hibridación precalentado del horno de hibridación y cierre la máquina.Luego, coloque un papel de filtro empapado con tres mililitros de 2X SSC en la cubeta de hibridación. Coloque suavemente el portapocillos de hibridación con las laminillas dentro de la cubeta de hibridación. Cierre la cubeta de hibridación y colóquela nuevamente en el horno de hibridación e incube durante 16 a 18 horas.Para lavar las laminillas, prepare buffers de lavado frescos uno, dos y tres, y colóquelos a 30 grados Celsius. Para asegurar que el SDS se disuelva cuando finalice la incubación, sumerja suavemente las laminillas lo más rápido posible en un tubo Falcon lleno con 50 mililitros de buffer de lavado uno hasta que el vidrio descanse en el fondo del tubo. Después de que el elevador se deslice y se hunda hasta el fondo del tubo sin rayar el arreglo, use pinzas para retirar la laminilla y colóquela en el portaporta del estación de lavado.Utilice inmediatamente 500 mililitros del tampón de lavado uno para lavar los portaobjetos durante cinco minutos. Luego, transfiera los portaobjetos al tampón de lavado dos durante 20 a 30 minutos antes de transferirlos a 500 mililitros del tampón de lavado tres durante cinco minutos. Finalmente, seque los portaobjetos a 2000 RPM durante dos minutos antes de realizar el análisis de microarreglos.De acuerdo con el protocolo descrito, para estudiar el impacto de la L-serina en el transcriptoma completo de S. pneumoniae, se realizó un análisis con microarreglos de la cepa D39 de tipo salvaje cultivada en CDM con 150 micromolares de L-serina, en comparación con la cultivada en 10 milimolares de L-serina en el mismo medio. Esta tabla muestra las concentraciones de ARN total aislado de cada cultivo, como se observa en esta figura. Tras la eliminación del ADN, se examinó la calidad del ARN.Estas dos bandas representan ARN de 150 micromolar de Seine, y estas dos bandas son de cultivos crecidos con 10 milimolar de seine. La presencia de dos bandas nítidas indica ARN de buena calidad. Las concentraciones de ADNc sintetizado a partir de ARN total se registran en esta columna y las de las muestras marcadas con reactivo colorimétrico AM se enumeran aquí.Se observa en esta figura un análisis de dispersión de la relación media de tintes reactivos de AM, y los datos se analizaron más a fondo para reducir el ruido. Esta tabla resume los resultados de los estudios de microarreglos tras aplicar los criterios de una diferencia mayor o igual a dos veces y un valor de P inferior a 0,001. Como se observa aquí, varios genes se expresaron de manera diferencial en presencia de L-serina mínima en comparación con la máxima siguiendo este procedimiento.Otros métodos como beag, ensayos de electrocitos, QPCR, knockout y/o la determinación de la fuerza de expresión pueden utilizarse para responder las preguntas siguientes tras su desarrollo. Esta técnica proporcionó a los investigadores VFR en el campo de la biología molecular y celular la posibilidad de explorar las redes reguladoras y los mecanismos en RAM positivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo establece un procedimiento paso a paso para controlar el comportamiento de células individuales de bacterias diferentes en el tiempo el uso automatizado de fluorescencia time-lapse microscopía. Además, proporcionar directrices a analizar las imágenes de microscopía.

Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

Este video demuestra la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligandos, una técnica para el cribado sistemático de alto rendimiento de proteínas de unión a segundo mensajero de nucleótidos intracelulares. Esta técnica permite la unión directa de los mensajeros a la proteína diana sobreexpresada en el lisado celular, evitando la necesidad de purificación de la proteína.

Acción capilar radial diferencial del ensayo de ligando: una técnica de alto rendimiento para identificar proteínas intracelulares de unión a segundo mensajero de nucleótidos bacterianos

Este video muestra un ensayo in vivo en bacterias para estudiar la interacción de las proteínas de unión al ARN (RBP) con el ARN. Las células bacterianas se transforman con dos construcciones de plásmidos: un plásmido de sitio de unión que codifica un ARNm que contiene un gen indicador fluorescente aguas abajo de un sitio de unión RBP, mientras que un plásmido RBP expresa las proteínas RBP bajo el control de un inductor. Tras el aumento mediado por inductores en la producción de RBP, los RBP se...

Ensayo de represión de genes reporteros para estudiar la regulación traslacional de un gen diana

Aquí, presentamos enfoques fenómicos para la caracterización funcional de genes de fagos putativos. Las técnicas incluyen un ensayo desarrollado capaz de monitorear el metabolismo anabólico del huésped, las placas de ensayo multifenotipo (MAP), además del método establecido de metabolómica, capaz de medir los efectos del metabolismo catabólico.

Fenómica fagos: enfoques fisiológicos para caracterizar Novela Virales Proteínas

Se describe aquí es un método para el análisis de expresión génica bacteriana en los tejidos animales a nivel celular. Este método proporciona un recurso para el estudio de la diversidad fenotípica que ocurre dentro de una población bacteriana en respuesta al ambiente de tejido durante una infección.

Un método basado en la fluorescencia para el estudio de regulación de los genes bacterianos en los tejidos infectados

La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de próxima generación (ChIP-seq) es un método utilizado para establecer interacciones entre los factores de transcripción y las secuencias genómicas que controlan. Este protocolo describe técnicas para realizar ChIP-seq con biopelículas bacterianas, utilizando Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm bacteriano como ejemplo.

Descubrimiento de objetivos reguladores de CsgD en biofilm de Salmonella utilizando inmunoprecipitación de cromatina y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq)

Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

La tecnología MAPS se ha desarrollado para escudriñar el targetome de un ARN regulador específico in vivo. El sRNA de interés está etiquetado con un aptámero MS2 que permite la co-purificación de sus socios de ARN y su identificación por secuenciación de ARN. Este protocolo modificado es particularmente adecuado para bacterias Gram-positivas.

MS2-Afinidad Purificación Junto Con La Secuenciación De ARN En Bacterias Gram-Positivas

Aquí se describen las etapas de la recolección de muestras y la preparación de RIBO-seq en bacterias. La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con estas directrices da como resultado datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es simple, utiliza equipos de laboratorio estándar y tarda siete días desde la lisis hasta la obtención de bibliotecas.

RIBO-seq En Bacterias: Una Colección de Muestras Y Protocolo De Preparación De La Biblioteca Para La Secuenciación NGS

Este protocolo detalla un método mejorado para sintetizar altos rendimientos de proteínas recombinantes a partir de un sistema de transcripción-traducción libre de células (TX-TL) de Streptomyces venezuelae .

Un kit de herramientas de transcripción y traducción de Streptomyces de alto rendimiento para aplicaciones de biología sintética y productos naturales

Aprende análisis de transcriptoma bacteriano mediante microarrays de ADN y software personalizado. Este método permite estudiar cambios globales de expresión génica en Streptococcus pneumoniae bajo condiciones específicas de forma rápida y confiable.

Una tubería rápida y fiable para el estudio de caso Análisis Bacteriano Transcriptome: Regulación Génica Serina-dependiente en Streptococcus pneumoniae (Video) | JoVE Journal

Una tubería rápida y fiable para el estudio de caso Análisis Bacteriano Transcriptome: Regulación Génica Serina-dependiente en

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