Una tubería rápida y fiable para el estudio de caso Análisis Bacteriano Transcriptome: Regulación Génica Serina-dependiente en Streptococcus pneumoniae

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una visión general de los cambios transcriptómicos en las bacterias que se producen en una condición específica. Esto se logra cultivando y cosechando primero células bacterianas bajo una condición específica. A continuación, el ARN total se aísla de las células cosechadas y el ADNCD se fabrica a partir del ARN.

A continuación, los CDNA se etiquetan e hibridan en portaobjetos de microensayo de fabricación propia. Finalmente, se lava la diapositiva, después de lo cual se escanean y analizan. En última instancia, el microarray se utiliza para mostrar los cambios transcriptómicos en las células bacterianas bajo la condición específica.

La principal ventaja de la tecnología de microarrays de ADN sobre otros métodos existentes para estudiar la expresión génica, como la QPCR o el Northern blot, es que proporciona una visión global de todos los cambios transcriptómicos que se producen en una condición específica. Es rápido, fiable y relativamente barato. La demostración del procedimiento estará a cargo de Mohammed Sal y Airon Manzu, estudiantes de PSD de mi laboratorio de genética molecular Después de descongelar, s pmo, gránulos de células ED 39 y Resus suspendiendo en 400 microlitros de te de acuerdo con el protocolo de texto, prepare lo siguiente en tubos de tapón de rosca sin ARN, 0,5 gramos de perlas de vidrio, 50 microlitros de 10%SDS 500 microlitros de cloroformo de fenol previamente preparado y los gránulos de células resuspendidas.

Para romper las células, coloque los tubos en un batidor de cuentas y homogeneice dos veces durante 60 segundos cada uno, colocándolos en hielo durante un minuto entre pulsos, luego centrifugar las muestras a 10, 000 Gs y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Transfiera la fase superior a un tubo nuevo y a 500 microlitros de cloroformo i a, a y centrifugue durante cinco minutos adicionales. Pipetear 500 microlitros desde la fase superior hasta los tubos frescos.

Agregue dos volúmenes de tampón de unión a lisis y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego, usando un kit de aislamiento de ARN, aísle el ARN total siguiendo el protocolo del fabricante para eliminar el ADN contaminante del ARN. Agregue 100 microlitros de D a una mezcla e incube a 15 a 25 grados centígrados durante 20 a 30 minutos.

Utilice el kit de RN a para lavar el ARN limpio y eluir en un volumen de 50 microlitros para llevar a cabo la reacción de arrodillamiento en tubos de PCR de 300 microlitros. Mezcle el ARN total con dos microlitros de monómeros aleatorios y use agua libre de nucleasa si es necesario para aumentar el volumen a 18 microlitros. Incubar la mezcla arrodillada a 70 grados centígrados durante cinco minutos.

A continuación, enfríe las reacciones a temperatura ambiente durante 10 minutos y gírelas rápidamente antes de colocar los tubos en hielo durante al menos un minuto. Para transcribir inversamente el CDNA, prepare la mezcla de transcripción inversa, combine 18 microlitros de la mezcla con 12 microlitros de mezcla maestra e incube la reacción a 42 grados centígrados durante dos a 16 horas. Desdegrada el ARNm de la reacción añadiendo tres microlitros de 2,5 molares y un OH y colócalo a 37 grados centígrados durante aproximadamente 15 minutos.

A continuación, añade 15 microlitros de dos montones molares de ácido libre para neutralizar el NAOH. Luego, después de usar columnas de limpieza de PCR para purificar el CDNA con un espectrofotómetro, mida la concentración de CDNA para etiquetar el CDNA. Agregue cinco microlitros de un colorante reactivo medio a 20 a 60 nanogramos por microlitro de CDNA.

Coloque la mezcla en la oscuridad y la temperatura ambiente incubada durante 60 a 90 minutos antes de usar columnas de limpieza PR para purificar el tinte marcado con CDNA eludiendo en 50 microlitros de tampón de evolución con un espectrofotómetro, asegúrese de que la concentración de CDNA marcado sea de al menos 0.5 picos moles por microlitro en un volumen total de 50 microlitros. Después de preparar el tampón tímido, de acuerdo con el protocolo de texto, precaliente el tampón a 68 grados centígrados durante al menos 30 minutos. Para preparar la muestra, combine cantidades iguales de CDNA marcados, luego use concentradores de vacío a alta temperatura para reducir el volumen a siete microlitros o menos.

Mientras tanto, para limpiar los resbalones del elevador para reducir la señal de fondo, use jabón y abundante agua del grifo, seguido de etanol al 100% después de secar los deslizamientos del levantador, coloque uno en un tobogán con el forro de teflón blanco hacia abajo. A continuación, disuelva las muestras de tinte seco en siete microlitros de H2O e incube a 94 grados centígrados durante dos minutos. Agregue inmediatamente 35 microlitros de tampón tímido precalentado, mezcle suavemente y gire a velocidad máxima durante un minuto.

Para pellets de precipitados, precaliente la sonda a 68 grados centígrados durante aproximadamente cinco minutos antes de cargar. Para ensamblar la corredera y la corredera del elevador, coloque el soporte de la corredera de hibridación en un bloque de calor a 50 grados centígrados. Coloque los portaobjetos de microarrays de ADN con el portaobjetos del elevador en el soporte del portaobjetos de hibridación calentado y precaliente el portaobjetos con el portaobjetos del elevador durante un minuto.

Luego, lo más rápido posible, agregue 40 microlitros del objetivo de muestra al final del portaobjetos. Permita que el fluido fluya entre las superficies de vidrio por fuerza capilar. Ahora retire el casete de hibridación precalentado del horno de hibridación y cierre la máquina.

A continuación, coloque el papel de filtro empapado con tres mililitros de dos XSSC en el casete de hibridación. Coloque suavemente el soporte de portaobjetos de hibridación con portaobjetos en el casete de hibridación. Cierre el casete de hibridación y vuelva a colocarlo en el horno de hibridación e incube durante 16 a 18 horas.

Para lavar los portaobjetos, prepare los tampones de lavado nuevos uno, dos y tres, y colóquelos a 30 grados centígrados. Para asegurarse de que la SDS se disuelva cuando se complete la incubación, sumerja suavemente los portaobjetos lo más rápido posible en un tubo Falcon lleno de 50 mililitros de tampón de lavado, uno hasta que el vaso descanse en el fondo del tubo. Después de que el elevador se deslice, se hunda hasta el fondo del tubo sin rayar la matriz, use pinzas para quitar la corredera y colóquela en la rejilla de la estación de lavado.

Use inmediatamente 500 mililitros de tampón de lavado uno para lavar los portaobjetos durante cinco minutos. A continuación, transfiera los portaobjetos al tampón de lavado dos durante 20 a 30 minutos antes de transferirlos a 500 mililitros de tampón de lavado tres durante cinco minutos. Finalmente, seque los portaobjetos a 2000 RPM durante dos minutos antes de realizar el análisis de microarrays.

De acuerdo con el protocolo de texto para estudiar el impacto de la L serina en todo el transcriptoma de la neumonía por S, se realizó un análisis de microarrays de la cepa D 39 Wildtype cultivada en CDM con 150 micromolares de L Seine, en comparación con la cultivada en 10 milimolares de L Seine en el mismo medio. Esta tabla enumera las concentraciones de ARN total aislado de cada cultivo como se muestra en esta figura. Después de eliminar el ADN, se examinó la calidad del ARN.

Estos dos carriles representan el ARN de 150 micromolares de cerco, y estos dos carriles son de cultivos cultivados con 10 milimolares de cerco. La presencia de dos bandas claras indica ARN de buena calidad. Las concentraciones de CDNA sintetizadas a partir de ARN total se registran en esta columna y las muestras marcadas con colorante reactivo medio de AM se enumeran aquí.

En esta figura se observa un análisis de diagrama de dispersión de la relación de matrices reactivas medias de AM, y los datos se analizaron más a fondo para reducir el ruido. En esta tabla se resumen los resultados de los estudios de microarrays después de aplicar los criterios de diferencia mayor o igual a dos veces y un valor de P menor que 0,001. Como se ve aquí, una serie de genes se expresaron diferencialmente en presencia de un mínimo de L serina en comparación con el máximo después de este procedimiento.

Se pueden utilizar otros métodos como beag, ensayos de electrocitos, QPCR, knockout y/o fuerza de expresión para responder a las próximas preguntas después de su desarrollo. Esta técnica permitió a los investigadores de VFR en el campo de la biología molecular y celular explorar las redes y mecanismos reguladores en RAM positivos.