Generación de linfocítica micropartículas y detección de su efecto proapoptótico sobre las células epiteliales de la vía aérea

El objetivo general de este procedimiento es ilustrar la producción in vitro de micropartículas linfocíticas o LMP a partir de una línea celular de linfocitos T, y demostrar su efecto proapoptótico sobre las células epiteliales de las vías respiratorias. Esto se logra produciendo primero los LMP. A continuación, los LMP aislados se caracterizan por análisis por fax.

A continuación, se cultivan los explantes de tejido bronquial. Por último, se lleva a cabo el tratamiento LMP en explantes bronquiales. En última instancia, se utilizan exámenes histopatológicos como hemat, toin y eosina y la detección de muerte de dos células NC para mostrar el daño de la capa epitelial bronquial inducido por LMP y la apoptosis de las células epiteliales.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el aislamiento de micropartículas de sangre periférica humana, es que somos capaces de realizar la generación a gran escala de micropartículas derivadas de una línea celular en acción in vitro. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los pasos críticos del cultivo de bronquios explan, no son fáciles de preparar. Para empezar la cultura.

Las células CEMT en cuatro matraces T 1 75 contienen cada uno 150 mililitros de fresco, medio e incuban a 37 grados Celsius con una densidad de 2 millones de células por mililitro. Recoger las células de cada matraz por centrifugación a 200 veces G durante cinco minutos, y doblar 300 veces 10 a las seis células en un nuevo matraz T 1 75 que contenga 150 mililitros de medio fresco. Para mantener la densidad de 2 millones de células por mililitro, agregue 37,5 microlitros de actina micina D al medio a una concentración final de 0,5 microgramos por mililitro e incube a 37 grados centígrados durante 24 horas.

Transfiera todo el medio de cultivo a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifuga las células a 750 veces G durante cinco minutos. A continuación, transfiera el sobrenadante a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 1500 veces G durante 15 minutos para eliminar los fragmentos de células grandes. A continuación, transfiera el sobrenadante a una botella de 250 mililitros y ultracentrífugo a 12.000 veces G durante 50 minutos.

Luego deseche el sobrenadante y recoja los gránulos. Utilice 40 mililitros de PBS estéril para lavar los gránulos enriquecidos con LMP en un tubo de 50 mililitros y centrifugar a 12.000 veces G durante 50 minutos. Repita este paso dos veces.

Recoger el sobrenadante del último lavado para utilizarlo como control del vehículo con un mililitro de PBS. Suspenda los gránulos y transfiéralos a una alícuota de microtubo estéril de 1,5 mililitros y almacene los LMP aislados a menos 80 grados centígrados. Para caracterizar las micropartículas por análisis por fax, comience preparando dos muestras de un tampón de nexina, una con cloruro de calcio y otra sin calcio.

En un tubo de fax, diluya un microlitro de LMP en 44 microlitros de un tampón de nexina con cloruro de calcio. Prepare otro tubo con un tampón de nexina sin cloruro de calcio. A continuación, agregue cinco microlitros de un X y V sci cinco a cada tubo y mezcle bien incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Después de la incubación, utilice 400 microlitros de líquido de la vaina de la gripe. Para detener las reacciones, agregue 10 microlitros de suspensión de perlas de conteo de siete micras como estándar interno en cada tubo. Para obtener un conteo absoluto, se establecieron puertas de tamaño relativo, FSCH y granularidad relativa SSCH y diagrama de puntos en el citómetro de flujo.

Usando perlas fluorescentes calibradas por tamaño de un micrómetro para la puerta uno y contando perlas a siete micrómetros. Para la puerta dos, analice la muestra de LMP en un gráfico F-S-C-H-S-S-C-H utilizando las puertas establecidas y el canal FL cuatro para el gráfico de puntos de anexina adquiriendo una señal hasta que se alcancen 10.000 cuentas de conteo en la marcha dos, determine los eventos positivos en ex NV de LMP en tampón de nexina que contiene cloruro de calcio y reste los eventos de LMP en tampón de nexina sin cloruro de calcio. Calcule el número absoluto de LMP en función de la siguiente ecuación.

Utiliza pinzas súper finas de bisturí Dumont y tijeras quirúrgicas para diseccionar asépticamente el tejido pulmonar. Retire con cuidado el parénquima y los vasos sanguíneos. Diseccione aún más el bronquio sumergido en el medio de lavado de tejido y separe el bronquio con un diámetro de uno a 2,5 milímetros de los tejidos pulmonares periféricos.

Utilice un bisturí para cortar los tejidos bronquiales en filas bronquiales de unos cinco milímetros de grosor utilizando un movimiento de cuchara con las pinzas de microdisección curvas estériles. Recoja los fragmentos bronquiales y colóquelos en las áreas rayadas de los platos previamente preparados. De acuerdo con el protocolo de texto, retire el medio de lavado de tejidos e incube los fragmentos a temperatura ambiente durante unos cinco minutos para permitir que se adhieran a los platos.

Agregue 10 mililitros de medio curativo completo a cada placa y colóquelas en una cámara de incubadora modular de atmósfera controlada con una mezcla de gas con alto contenido de oxígeno, enjuague la cámara, luego colóquela en una incubadora orbital de sobremesa y agítela a 37 grados Celsius durante 24 horas a 10 ciclos por minuto para permitir que el medio fluya intermitentemente sobre los fragmentos. Después de la incubación, observe el tejido explanado bajo un contraste de fase y un microscopio de luz invertida. Seleccione el modelo bronquial con movimiento completo del cabello fino y epitelio bronquial vivo para el tratamiento posterior de LMP.

Para tratar las LMP, cuente el explan bronquial recién seleccionado y marque cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos. Por cada explicación, transfiera 0,5 mililitros de medio de crecimiento completo a un tubo de einor estéril. A continuación, añada 25 microlitros de caldo l y p por plan de tratamiento o añada 25 microlitros de vehículo de control.

Para el control de los explantes, mezcle bien golpeando suavemente el tubo. Transfiera el medio mezclado a cada pocillo de una placa de cultivo de tejido marcada de 12 pocillos con pinzas de microdisección curvas. Transfiera cada x explan bronquial seleccionado a cada pocillo de la placa de cultivo de tejidos.

Continúe la incubación en una cámara de incubación modular de atmósfera controlada a 37 grados centígrados con una suave agitación después de 24 horas. Utilice PBS para lavar el EXPLAN tres veces y proceda a la tinción de fijación h y e y al ensayo de túnel. De acuerdo con el protocolo de texto que se muestra aquí, los LMP se caracterizaron con una tinción de nexina V mediante análisis por fax y se comprimieron con perlas de un micrómetro donde el 97% de los mps estaban en nexin V sci-fi positivo.

Por lo general, se obtuvieron alrededor de 2,5 miligramos de LMP siguiendo este protocolo. Tejido bronquial explan de C 57 negro seis ratones fueron sometidos a tratamiento con vehículo y LMP. En esta figura, el análisis histopatológico de los cortes bronquiales revela el efecto de las LMP sobre la integridad estructural del epitelio bronquial.

Con el control. Por ejemplo, el epitelio bronquial no sufrió daños en gran medida. Sin embargo, en los explantes tratados con LMP, la capa de células epiteliales superficiales se dañó o se perdió, y hubo disminuciones significativas en la altura y densidad de las células epiteliales, como se observa aquí.

La tinción de túnel positivo, un marcador de apoptosis, fue más pronunciada en el epitelio bronquial tratado con LMP en comparación con el tejido control. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se debe trabajar en condiciones estériles cuando se producen micropartículas y se realiza el cultivo de tejido explan.