Name: Generación de linfocítica micropartículas y detección de su efecto proapoptótico sobre las células epiteliales de la vía aérea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprende a generar micropartículas linfocíticas de líneas celulares T y detectar sus efectos proapoptóticos en células epiteliales de vía aérea mediante análisis de fax y cultivo de explantes bronquiales.

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Este trabajo es apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (178,918), Fonds de recherche en santé du Québec - Visión Red de Investigación de la Salud.

NOTA: Hombre C57BL / 6 ratones (5-7 semanas de edad) son de Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canadá.) Y manipulados de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de Sainte-Justine CHU. Alfombrillas de explantes de tejidos bronquiales son una buena fuente de células epiteliales bronquiales primarias para la investigación de los efectos pro-apoptóticos de LMP en las células epiteliales. Este protocolo describe la generación in vitro de LMP, así como un método para detectar células epiteliales apoptóticas en explantes de tejidos bronquiales tratados con LMP. Este protocolo consiste en 3 secciones. 1. LMP producción y caracterización NOTA: Para evitar la contaminación, asegurar que todos los materiales utilizados en este experimento son estériles o en autoclave. Realice todos los pasos a TA en una cabina de seguridad biológica en condiciones estériles, a menos que se indique lo contrario. 1.1) La estimulación y percepción de los diputados9 <ol><li> Descongelar una alícuota de 10 millones de células T CEM en un baño a 37 ° C. Diluir en 10 ml pre-calentado medio libre de suero hematopoyético tales como X-Vivo, en un tubo estéril de 15 ml y centrifugar a 200 gx 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de medio de pre-calentado. </li><li> La transferencia de células en un matraz de cultivo de tejido T75 (para células en suspensión) con 15 ml de medio hematopoyético precalentado como X-VIVO e incubar durante 4 días en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Después de 4 días, transferir todo el medio de cultivo y las células en un matraz de cultivo de tejidos T175 que contiene 100 ml de medio fresco. Continuar la incubación de las células durante aproximadamente 72 horas bajo las mismas condiciones hasta que han crecido hasta una densidad de 2 millones de células / ml. </li><li> Células uniformemente dividido entre cuatro matraces T175 cada 150 ml de medio fresco que contiene y continuar el cultivo de células hasta que las células han crecido (aproximadamente 48 h de incubación) a una densidad de 2 millones / ml. </li><li&gt; Recoger las células de cada matraz por centrifugación a 200 xg durante 5 min y resuspender 300 x 10 6 células en un nuevo frasco T175 que contiene 150 ml de medio fresco, para mantener los 2 millones / ml densidad celular. </li><li> Añadir actinomicina D (disuelto en DMSO a 2 mg / ml) al medio a una concentración final de 0,5 mg / ml y se incuba durante 24 hr. </li><li> Transferir todo el medio de cultivo en tubos de 50 ml cónicos y centrifugar las células a 750 xg durante 5 min. Transferir el sobrenadante a 50 ml tubos cónicos y se centrifuga a 1500 xg durante 15 min para eliminar los fragmentos de células grandes. </li><li> Transferir el sobrenadante en una botella de 250 ml y ultracentrífuga a 12.000 xg durante 50 min. Descartar el sobrenadante y recoger pellets. </li><li> Gránulos Wash LMPs enriquecido con PBS 40 ml estéril en un tubo de 50 ml por centrifugación a 12.000 xg durante 50 min. Repita este paso dos veces. </li><li> Recoger el último sobrenadante de lavado; que se utilizará como control del vehículo. Suspender los pellets LMPS en 1ml de PBS y transferir en un 1,5 ml microtubo estéril. Alícuotas y almacenar LMP aisladas a -80 ° C (para evitar múltiples ciclos de libre deshielo). </li></ol> 1.2) Caracterización de los diputados mediante análisis FACS 4 <ol><li> Preparar 2 muestras de tampón de anexina, 1 con y otro sin CaCl 2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, más o menos 5 mM CaCl 2. </li><li> Filtra búfer anexina y FACS fluido envolvente de flujo usando un filtro de 0,22 micras para eliminar las partículas. </li><li> Diluir 1 l de LMP en 44 l de tampón de anexina con 5 mM CaCl 2 en un tubo de FACS. Preparar otro tubo con 1 l de LMP en 44 l de tampón de anexina sin CaCl 2 (control negativo). </li><li> Añadir 5 l de AnnexinV-Cy5 en cada tubo y mezclar bien. Incubar durante 15 min a TA en la oscuridad. Detener la reacción mediante la dilución de la mezcla con 400 l de FACS de fluido de funda flujo en cada tubo. </li><li> Añadir 10 l (200.000 cuentas) de 7 micras conteo beasuspensión ds como estándar interno en cada tubo para obtener un recuento absoluto. </li><li> Establecer puertas de tamaño relativo (FSC-H, PMT E00, escala logarítmica) y granularidad relativa (SSC-H, PMT 325, escala logarítmica) gráfico de puntos en el citómetro de flujo usando perlas fluorescentes de tamaño calibrado de 1 m (puerta 1) y que cuenta granos puerta a las 7 micras (puerta 2). </li><li> Analizar la muestra LMP en FSC-H / SSC-H parcela usando las puertas establecidas y FL-4 canales para anexina (PMT 765, escala logarítmica) gráfico de puntos, mediante la adquisición de una señal de hasta 20.000 contar bolas se alcanzan en la puerta 2. </li><li> Determinar los eventos AnnexinV positivos de LMP en tampón anexina contiene CaCl2, y luego restar los acontecimientos de LMP en tampón anexina sin CaCl2 (control negativo). </li><li> Calcular el número absoluto de MPs en base a la siguiente ecuación: <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52651/52651eq1.jpg" /></li></ol> 1.3) Determinación de MP Protein Concentración (Bradford ensayo) <ol><li> Preparar 5 diluciones en serie de un estándar de proteína de 1,25 a 20 mg / ml. Pipetear 800 l de cada solución patrón y la muestra en un tubo de ensayo limpio por duplicado. Añadir 200 l de reactivo de colorante de Bradford a cada tubo. Mezclar bien, a continuación, se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Medir la absorbancia a 595 nm. Determinar la concentración de proteína de LMP usando la regresión lineal de la curva estándar. </li></ol> 2. Los explantes de tejido bronquial y LMP Tratamiento NOTA: Preste especial atención al entorno de trabajo estéril y aséptica preparar las soluciones y medio utilizados en los siguientes experimentos. Para preparar la completa curación Medium, añadir 1 ml de tejido cicatricial Mediano suplementos con suero (descongelado en el hielo) a 100 ml de Tejidos Healing mediano y mezclar bien. 2.1) Preparación de explantes de tejidos bronquiales <ol><li> Antes de cultivo, rayar 6 áreas de 1 cm 2cada uno en el borde de la superficie de cada 100 mm placa de cultivo de tejidos con una hoja de bisturí. Cubra cada rascó 100 mm placa de cultivo de tejidos con 2 ml de la solución de revestimiento placa de cultivo, y se incuba el plato en un incubador de CO2 humidificado O / N a 37 ° C. Vacío aspirar la solución excedente y llenar el recipiente con 15 ml de lavado de tejidos Medio. </li><li> La eutanasia a C57BL / 6 ratones (5 a 7 semanas de edad) por inhalación de CO2 de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité de ética del cuidado animal. </li><li> Asépticamente diseccionar el tejido pulmonar con bisturí, pinzas Dumont super fino, y tijeras quirúrgicas. Retire con cuidado parénquima y los vasos sanguíneos. Coloque el tejido pulmonar en helada Tissue Lavado Medio para el transporte al laboratorio, en su caso. </li><li> Además diseccionar bronquio sumergido en el medio de lavado de tejidos y separar el bronquio con un diámetro de 1 a 2,5 mm de tejidos pulmonares periféricos. Slice tejidos bronquiales en ~ 5 mm anillos bronquiales gruesas con un bisturí. </li&gt; <li> Use un movimiento de pala con las pinzas microdissecting curvas estériles para recoger los fragmentos bronquiales y colocarlos en las áreas rayadas de los platos. </li><li> Retire el medio de lavado de tejido, e incubar los fragmentos a temperatura ambiente durante ~ 5 min para permitir que se adhieran a los platos. </li><li> Añadir 10 ml de la cicatrización completa de medio a cada plato y colocarlos en una cámara incubadora modular atmósfera controlada. Enjuague con la cámara de alta mezcla de gas O 2 (70% O 2, 25% de N 2 y 5% de CO 2,). Coloque la cámara en una incubadora orbital de sobremesa y agitar a 37 ° C. Agitar la cámara durante 24 horas a 10 ciclos por minuto para permitir que el medio fluya intermitentemente a través de los fragmentos. </li><li> Después de 24 horas de incubación, observar los explantes de tejido bajo un microscopio óptico de contraste de fase invertida. Seleccione explantes bronquiales con movimiento completo, pelo fino y animado epitelio bronquial para el tratamiento LMP posterior. </li></ol>2.2) Tratamiento LMP <ol><li> Preparar medio de crecimiento completo de la siguiente manera: crecimiento deshielo suplementos medianas con inhibidor de suero y fibroblastos en hielo. Añadir 1 ml de los suplementos de medio de crecimiento con suero y 200 inhibidor de fibroblastos l a 100 ml de medio de crecimiento; mezclar bien. Calentar el medio de crecimiento completo a 37 ° C durante 10 min antes de usar. </li><li> Diluir LMPs aislados en un nuevo tubo eppendorf estéril con PBS para preparar una acción LMPs a una concentración de 800 mg / ml. </li><li> Añadir 0,5 ml de medio completo de crecimiento a cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos. </li><li> La transferencia de los explantes bronquiales seleccionados con las pinzas microdissecting curvas del protocolo anterior (sección 2.1) a cada pocillo de la placa de cultivo de tejidos. </li><li> Etiqueta de la placa de cultivo apropiado para identificar pozos de tratamiento LMPS y pozos de control. Añadir 25 l de stock LMP en cada tratamiento LMPs bien (para una concentración final de 40 mg / ml) y 25 l vehículo de control (véase LMP<html> producción s) a los pocillos de control. </li><li> Continuar la incubación en una cámara incubadora modular atmósfera controlada a 37 ° C con agitación suave. </li><li> Después de 24 horas, lavar explantes 3 veces con PBS y se procederá a la (fijación paraformaldehído al 4% [PFA]) siguiente paso. </li></ol> 3. El examen histopatológico 3.1) Preparar las siguientes soluciones antes de proceder a los próximos pasos <ol><li> Preparar tampón PBS 1x mezclando NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,76 mM KH 2 PO 4, pH 7,4. </li><li> Para preparar 4% PFA, se disuelven 20 g de PFA en 400 ml de agua, se calentó a 60 ° C con agitación; añadir unas gotas de NaOH 10 M para borrar la solución. A continuación añadimos tampón PBS 1x y ajustar el volumen a 500 ml y el pH a 7,4. Filtro y alícuota; almacenar a -20 ° C. </li><li> Prepare los siguientes reactivos de deshidratación o de rehidratación; 100%, 90%, 70%, 50% de etanol y xileno. </li></ol>e_step &quot;&gt; 3.2) Explante Fijación y Tejidos Sección desparafinización <ol><li> Coloque cada explante en un tubo de microcentrífuga marcado con 1,5 ml de PFA al 4% y se incuba O / N a 4 ° C. Enjuague los explantes dos veces con PBS 1x. </li><li> Deshidratar explantes a través de una serie de alcohol (etanol 70%: 3 veces 30 minutos cada uno; etanol al 90%: 2 veces 30 minutos cada uno; etanol al 100%: 3 veces 30 min cada uno, y luego xileno: 3 veces 20 min cada uno). Realice todos los pasos a TA en una campana de humos. </li><li> Imbed explantes de tejidos en parafina a 58 ° C en un horno. Preparar 5 micras secciones de tejido de espesor usando un micrótomo rotatorio. </li><li> Flotador las secciones en un 56 ° C baño de agua, y luego montar las secciones en portaobjetos histológicos etiquetados. Colocar los portaobjetos en bastidores de tinción manuales y seco a 65 ° C durante 1 hora. Permita que las diapositivas se enfríen a temperatura ambiente. </li><li> Sumerja los bastidores en 4 platos mancha consecutivas que contienen xileno durante 10 minutos cada uno para eliminar la parafina. Sumergir los bastidores en una serie de etanol para eliminar el xileno: 100%, luego 95%, THes 80%, entonces el 70%, luego etanol al 50% (5 minutos por cada paso). Enjuague los bastidores con agua del grifo durante 5 min para eliminar el etanol. </li></ol> 3.3) hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción <ol><li> Continuar trabajando con las secciones de tejido fijadas; coloque el estante en una placa de tinción de llenado con hematoxilina de Mayer durante 15 min. Enjuague la rejilla con agua del grifo para eliminar hematoxilina durante 20 min. </li><li> Colocar en agua destilada durante 30 sec.Place en etanol al 95% durante 30 seg. Colocar en Eosina Y placa de tinción de solución durante 1 min. Deshidratar a través de 2 cambios de etanol 95%, etanol al 100%, y xileno para 2 min cada uno. </li><li> Realice una comprobación rápida con un microscopio para asegurarse de que se elimina el exceso eosina. Coloque 2 a 3 gotas de medio de montaje (Fisher SP15-100) en cada diapositiva, luego cubra con una tapa de vidrio. </li></ol> 3.4) En Detección Muerte Situ Cell: Ensayo de TUNEL <ol><li> Antes de empezar, preparar la solución de trabajo de proteinasa K: 20 g / ml enTris 10 mM / HCl, pH 7,4. </li><li> Repita los pasos 1 a 5 de la sección 3.2 (fijación del explante y la sección de deparaffinization tejido). Enjuagar los portaobjetos con desionizada H 2 O. </li><li> Sumergir los portaobjetos con PBS 1x durante 10 min. Escurrir el exceso de PBS. Incubar las secciones de tejido durante 30 min a RT con solución de trabajo de proteinasa K. Enjuague desliza dos veces con PBS 1x. </li><li> Lleve a cabo el ensayo de TUNEL como se describe en el manual de instrucciones de kit de detección de muerte celular. Montar utilizando medio de montaje y cubreobjetos manualmente con cubreobjetos de vidrio. </li><li> Analizar las muestras en un microscopio de luz. Utilice Image Pro 4.5 para analizar las células apoptóticas en el color marrón. </li></ol>

<ol><li>Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+microparticles+in+the+pathogenesis+of+cardiovascular+disease%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).</li>
<li>Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles%3A+targets+and+tools+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microparticles: targets and tools in cardiovascular disease.</a> Trends Pharmacol Sci. 32 (11), 659-665 (2011).</li>
<li>Benameur, T., Andriantsitohaina, R., Martinez, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+plasma+membrane-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rep%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of plasma membrane-derived microparticles.</a> Pharmacol Rep. 61 (1), 49-57 (2009).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytic+microparticles+inhibit+angiogenesis+by+stimulating+oxidative+stress+and+negatively+regulating+VEGF-induced+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 294 (2), 467-476 (2008).</li>
<li>Yang, C., Gagnon, C., Hou, X., Hardy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+lipoprotein+receptor+mediates+anti-VEGF+effect+of+lymphocyte+T-derived+microparticles+in+Lewis+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Low density lipoprotein receptor mediates anti-VEGF effect of lymphocyte T-derived microparticles in Lewis lung carcinoma cells.</a> Cancer Biol Ther. 10 (5), 448-456 (2010).</li>
<li>Angelillo-Scherrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-derived+microparticles+in+vascular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis.</a> Circ Res. 110 (2), 356-369 (2012).</li>
<li>Maeno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+Cells+are+required+for+inflammation+and+destruction+in+cigarette+smoke-induced+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice.</a> J Immunol. 178 (12), 8090-8096 (2007).</li>
<li>Qiu, Q., Xiong, W., Yang, C., Gagnon, C., Hardy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte-derived+microparticles+induce+bronchial+epithelial+cells%27+pro-inflammatory+cytokine+production+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte-derived microparticles induce bronchial epithelial cells' pro-inflammatory cytokine production and apoptosis.</a> Mol Immunol. 55 (3-4), 220-230 (2013).</li>
<li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shed+membrane+particles+from+T+lymphocytes+impair+endothelial+function+and+regulate+endothelial+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression.</a> Circulation. 109 (13), 1653-1659 (2004).</li>
<li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li>
<li>Mause, S. F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles%3A+protagonists+of+a+novel+communication+network+for+intercellular+information+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange.</a> Circ Res. 107 (9), 1047-1057 (2010).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-proliferative+and+anti-tumour+effects+of+lymphocyte-derived+microparticles+are+neither+species-+nor+tumour-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Soleti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles+harboring+Sonic+Hedgehog+promote+angiogenesis+through+the+upregulation+of+adhesion+proteins+and+proangiogenic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors.</a> Carcinogenesis. 30 (4), 580-588 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los diputados son mediadores activos de diafonía intercelular y su estudio es la promesa en muchas áreas de la ciencia. 11 Este estudio presenta un protocolo detallado para la generación a gran escala in vitro de LMP derivado de una línea de células T apoptóticas. Estas MPs expresan un gran repertorio de moléculas de linfocitos y están biológicamente implicados en la regulación de la homeostasis celular y tisular. Sin embargo, LMPs procedente de diferentes fuentes puede ser biológicamente diferente. ...

Las micropartículas (MP) son vesículas de membrana submicrónicas biológicamente activas que se liberan tras la activación celular o la apoptosis. Los MP se derivan tanto de células sanas como dañadas y están implicados en muchos procesos fisiológicos y patológicos. 1 Se han detectado MP no solo en plasma humano, sino también en tejido inflamatorio y apoptótico. La utilidad biológica de los MP derivados de la membrana celular se ha demostrado en diversos entornos, incluidos los modelos de señalización celular y como herramientas farmacológicas. 2,3 Previamente demostramos que las LMPs derivadas de los linfocitos T tras la estimulación de la actinomicina D (para inducir la apoptosis) suprimen la angiogénesis e inhiben la supervivencia y proliferación de las células endoteliales. 4,5 Los efectos antiangiogénicos de las LMPs pueden variar significativamente en función de los estímulos utilizados para activar los linfocitos T in vitro. 6
El epitelio de las vías respiratorias funciona como una barrera física y funcional protectora. El aumento del número de linfocitos T en las vías respiratorias puede contribuir al daño celular y a la inflamación de las vías respiratorias. 7 Hemos demostrado que las LMP inducen la apoptosis de las células epiteliales bronquiales humanas,8 lo que indica que las LMP pueden cambiar la función de barrera del epitelio bronquial in vivo. Las células apoptóticas se pueden identificar utilizando el método TUNEL, que detecta in situ la fragmentación del ADN. 
El objetivo general de este protocolo es ilustrar la producción in vitro de LMPs a partir de una línea de células de linfocitos T y demostrar su efecto proapoptótico en las células epiteliales de las vías respiratorias. La detección de muerte celular in situ demostró que las LMP inducen fuertemente la muerte de las células epiteliales bronquiales de las vías respiratorias, lo que sugiere que la lesión mediada por LMP en el epitelio de las vías respiratorias puede afectar la función de barrera del epitelio dañado.

<table><tbody><tr><td>Producción y caracterización de</td><td></td><td></td><td></td>LMPs</tr><tr><td>Células T CEM&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 medio&nbsp;</td><td>Cambrex, Walkersville</td><td>04-744Q</td><td></td></tr><tr><td>Matraz T75</td><td>Sarstedt</td><td>83.1813.502</td><td></td></tr><tr><td>Matraz T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.502</td><td></td></tr><tr><td>Actinomicina&nbsp; D&nbsp;</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>A9415-2mg</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lifetechnologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.22 y micro; m filtro</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-VCy5</td><td>BD Pharmagen&nbsp;</td><td></td><td></td>559933</tr><tr><td>Solución de flujo FACS</td><td>BD Bio-sciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Microperlas fluorescentes (1 y micro; m)</td> <td>Sondas moleculares&nbsp;</td><td>T8880</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas contadoras de poliestileno (7 &micro; m)</td><td>Laboratorios Bangs</td><td>PS06N/6994</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno FACS Falcon</td><td></td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 1 ml</td><td>Fisher</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 5 ml</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 25 ml</td><td>Ultident</td><td>DL-357551</td><td></td></tr><tr><td>microtubo cónico de polipropileno de 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de polipropileno de 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de polipropileno de 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de copolímero de polipropileno de alta velocidad de 50 ml</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de polipropileno de alta velocidad de 250 ml</td><td>Beckman</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de proteínas (ensayo de Bradford)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Norma de ensayo de proteínas II</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0007</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensayo 16 x 100</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensayo 12 x 75</td><td>Ultident</td><td>170-14100005B</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de células&nbsp;</td><td>Mandel</td><td>Heracell 150</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de baja velocidad</td><td>IEC</td><td>Centra8R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidad</td><td>Beckman</td><td>Avanti J8</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de alta velocidad para botella de 250ml</td><td>Beckman</td><td>JLA16.250</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de alta velocidad para tubo de 50ml</td><td>Beckman</td><td>JA30.50</td><td></td></tr><tr><td>Citometría de Fow&nbsp;</td><td>BD Bio-sciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Beckman</td><td>Serie 600</td><td></td></tr><tr><td>Explantes y secciones de tejido bronquial&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratones C57BL/6 (5-7 semanas de edad)&nbsp; &nbsp;</td><td>Laboratorios Charles River, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vía Aérea del Ratón PrimaCell&trade; Sistema:</td><td>CHI Scientific, Inc.</td><td>2-82001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Hojas de bisturí de acero al carbono con respaldo acanalado</td><td>Becton Dickinson AcuteCare</td><td>371310</td> <td># 10</td></tr><tr><td>Mango de bisturí</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>10003-12</td><td>#7</td></tr><tr><td>microscopio invertido de contraste de fase</td><td>Olympus Optical CO., LTD.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td>Mezcla de gases <td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>con alto O2&nbsp;</td><td>VitalAire Canadá Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cámara incubadora modular</td><td>Billups-Rothenberg Inc.</td>Agitador orbital incubado <td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000</td><td>Barnstead Lab-Line,&nbsp;</td><td>SHKA4000-7</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de plástico (100 mm)</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>14060-09</td> Pinza Graefe <td>recta, afilada, de 9 cm</td></tr><tr><td>de largo semicurvada</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de CO2 humidificado</td><td>Mandel Scientific Company Inc.&nbsp;</td><td>SVH-51023421</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Examen histopatológico&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>formaldehído de formalina</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>parafina</td><td>Fisher scientific&nbsp; Internacional, Inc.</td>Alcohol etílico <td>T555</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merck KGaA, Darmstadt</td><td>EX0278-1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; glutaraldehído&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>31533</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio</td><td>VWR Scientific Inc.&nbsp;</td><td>48300-025</td><td>25x75 mm</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher scientific&nbsp; Internacional, Inc.</td><td>X5-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina de Mayer</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td>Embudo <td>MHS16</td><td>con papel de filtro&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Fisher scientific&nbsp; Internacional, Inc.&nbsp; &nbsp;</td><td>A144s-500</td><td></td></tr><tr><td>eosin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>HT110116</td><td>Embudo con papel de filtro&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Permount&trade; Medio de montaje</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio</td><td>surgipath medical industries, Inc.</td><td>84503</td><td>24 veces; 24&nbsp;#1&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de detección</td><td>TUNEL Detección de muerte celular in situ, POD</td><td>11 684 817 910</td><td></td></tr><tr><td>horno</td><td>Despatch Industries Inc.</td><td>LEB-1-20</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo rotativo</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>RM2145</td><td></td></tr><tr><td>papel de filtro</td><td>Whatman International Ltd.</td><td>Microscopio 1003150</td><td>#3</td></tr><tr><td></td><td>Nikon Imaging Japan Inc.</td>Plato de tinción <td>E800</td><td></td></tr><tr><td>completo</td><td>Wheaton Industries, Inc.</td><td>900200</td><td>incluyendo plato, rejilla, tapa</td></tr><tr><td>tubo eppendorf de 1,5 ml</td><td>Sarstedt Inc.&nbsp;</td><td>72.69</td><td>39x10 mm</td></tr><tr><td>Baño de agua orbital y alternativo</td><td>ExpotechUSA</td><td>ORS200</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato&nbsp; &nbsp;</td>Campana extractora <td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nicram RD Service</td><td>3707E</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de linfocítica micropartículas y detección de su efecto proapoptótico sobre las células epiteliales de la vía aérea

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

El interés en las funciones biológicas de las vesículas de membrana derivadas de células en la comunicación celular se ha incrementado en los últimos años. Las micropartículas (MP) son un tal tipo de vesículas, que varían en diámetro desde 0,1 m a 1 m, y normalmente se desprenden de la membrana plasmática de las células eucariotas se someten a la activación o la apoptosis. Aquí se describe la generación de linfocitos T derivados de micropartículas (LMP) a partir de células CEM T apoptóticas estimulados con actinomicina D. LMP están aisladas a través de un proceso de centrifugación diferencial de varios pasos y que se caracteriza por citometría de flujo. Este protocolo también presenta un método de detección in situ la muerte celular para demostrar el efecto proapoptótico de LMP en las células epiteliales bronquiales derivados de ratón explantes de tejidos bronquiales respiratorias primarias. Los métodos descritos en este documento proporcionan un procedimiento reproducible para el aislamiento de cantidades abundantes de LMP a partir de linfocitos apoptóticos in vitro. LMP derivade esta manera se puede utilizar para evaluar las características de varios modelos de enfermedad, y para la farmacología y pruebas de toxicología. Dado que el epitelio de la vía aérea ofrece una barrera física y funcional de protección entre el ambiente externo y el tejido subyacente, el uso de explantes de tejidos bronquiales en lugar de líneas de células epiteliales inmortalizadas ofrece un modelo eficaz para investigaciones que requieran tejido del tracto de las vías respiratorias.

LMP se caracterizaron con la tinción de anexina V 10 por fluorescencia de células activadas por la clasificación análisis (FACS) y cerrada usando 1 micras cuentas en las que el 97% de los diputados (≤1 m) fueron anexina-V-Cy5 positivo (Figura 1A y 1B). Por lo general, se obtuvieron alrededor de 2,5 mg de LMP siguiendo este protocolo. Explantes de tejidos bronquiales de C57BL / 6 ratones fueron sometidos a vehículo y el tratamiento LMP. El análisis histopatológico de las secciones bronquiales ...

Micropartículas membrana arrojar celulares (MPs) son vesículas biológicas activas que pueden ser aislados y sus efectos fisiopatológicos investigados en varios modelos. Aquí se describe un método para generar MPs derivadas de los linfocitos T (LMP) y para demostrar su efecto proapoptótico en células epiteliales de las vías respiratorias.

Generación de linfocítica micropartículas y detección de su efecto proapoptótico sobre las células epiteliales de la vía aérea

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

El objetivo general de este procedimiento es ilustrar la producción in vitro de micropartículas linfocíticas o LMP a partir de una línea celular de linfocitos T, y demostrar su efecto proapoptótico sobre células epiteliales de las vías respiratorias. Esto se logra primero produciendo las LMP. A continuación, las LMP aisladas se caracterizan mediante análisis de fax.Luego, se cultivan los explantes de tejido bronquial. Finalmente, se realiza el tratamiento con LMP en los explantes bronquiales. En última instancia, se utilizan exámenes histopatológicos como hematoxilina, eosina y detección de muerte celular NC dos para demostrar el daño inducido por LMP en la capa epitelial bronquial y la apoptosis de las células epiteliales.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el aislamiento de micropartículas de sangre periférica humana, es que podemos realizar la generación a gran escala de micropartículas derivadas de una línea celular mediante acción in vitro. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los pasos críticos del cultivo de explantes bronquiales no son fáciles de preparar. Para iniciar el cultivo.Células CEMT en cu

generation-lymphocytic-microparticles-detection-their-proapoptotic

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describen los protocolos para la recogida de los macrófagos alveolares murinos, que residan las células inmunes en el pulmón, y el examen de su activación en respuesta a la co-cultivo con nanopartículas polianhídrido.

Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido

Este video muestra la generación y el aislamiento de micropartículas derivadas de linfocitos T, LMP, a partir de linfocitos T después del tratamiento con actinomicina-D.

Aislamiento de micropartículas derivadas de linfocitos T apoptóticos in vitro

Este video muestra un método para inducir la apoptosis en las células Jurkat, una línea celular de leucemia de linfocitos T humanos. Las células están expuestas a la radiación ultravioleta C (UVC), que causa un daño extenso en el ADN y conduce a la muerte de las células apoptóticas.

Una técnica in vitro para la generación de células T apoptóticas mediada por irradiación UV

Se describe un método para generar la precisión de corte de pulmón rebanadas (PCLS) y la inmunotinción ellos para visualizar la localización de diversos tipos de células inmunes en el pulmón. Nuestro protocolo se puede extender a visualizar la ubicación y la función de muchos tipos celulares diferentes bajo una variedad de condiciones.

Precisión de corte pulmón de ratón Rebanadas para visualizar las células en vivo pulmonar dendríticas

Aquí se describen nuevos protocolos para aislar y caracterizar micropartículas derivadas de humano y ratón neutrófilos. Estos protocolos utilizan técnicas immunoblotting para analizar contenido de micropartículas, ultracentrifugación y citometría de flujo, y pueden ser utilizados para estudiar el papel de micropartículas derivadas de diversos tipos celulares en función de las células.

Aislamiento y caracterización de micropartículas de neutrófilos derivado de estudios funcionales

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

Este manuscrito describe un protocolo para determinar si la exposición al ozono, un criterio contaminante del aire, afecta a la eferocítosis in vivo de los macrófagos alveolares. Este protocolo utiliza reactivos y técnicas de uso común y se puede adaptar a múltiples modelos de lesión pulmonar para determinar los efectos sobre la eferocittosis de macrófagos alveolares.

En la evaluación Vivo de la efiytosis de macrófagos alveolares tras la exposición al ozono

Los ratones expuestos al ozono combinado y a las endotoxinas bacterianas muestran una muerte celular muy extendida, incluida la de los neutrófilos. Observamos adaptaciones celulares tales como interrupción del lamellipodia citoesquelético, expresión celular creciente de la subunidad compleja del synthase del ATP de V β y angiostatin en lavado bronco-alveolar, supresión de la inmunorespuesta del pulmón y reclutamiento retrasado del neutrófilo.

Visualización De Las Adaptaciones Celulares Pulmonares Durante La Lesión Pulmonar Aguda Murina Inducida Por Ozono Combinado Y LPS

Aquí se presenta un método reproducible, asequible y robusto para el aislamiento y la expansión de células epiteliales bronquiales primarias para biobancos a largo plazo y la generación de células epiteliales diferenciadas por cultivo en la interfaz aire-líquido.

Aislar células epiteliales bronquiales del tejido pulmonar resecado para biobancos y establecer cultivos de interfaz aire-líquido bien diferenciados

En este trabajo describimos un modelo in vitro para aislar y diferenciar células epiteliales murinas de las vías respiratorias, centrándonos en su aclimatación al extracto crónico de humo de cigarrillo (CSE). El modelo podría utilizarse para caracterizar de forma exhaustiva el impacto multiómico de la CSE, lo que posiblemente proporcione información sobre las respuestas celulares bajo una exposición crónica al humo.

Modelo in vitro para el estudio de la diferenciación y los cambios de las células epiteliales de las vías respiratorias murinas estimuladas con extracto de humo de cigarrillo

Aprende a generar micropartículas linfocíticas de líneas celulares T y detectar sus efectos proapoptóticos en células epiteliales de vía aérea mediante análisis de fax y cultivo de explantes bronquiales.

Generación de linfocítica micropartículas y detección de su efecto proapoptótico sobre las células epiteliales de la vía aérea

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