Name: Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprende a realizar grabaciones de patch-clamp perforado en neuronas sensoriales olfativas de ratón en neuroepitelio intacto. Este método permite caracterizar propiedades de membrana y respuestas a odorantes específicos.

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Los autores desean agradecer a Peter Mombaerts por el generoso regalo de ratones OR-GFP; Anne Lefranc y el animalario del CSGA por su excelente cuidado de los animales. La financiación fue proporcionada por el CNRS a través de una beca ATIP y ATIP Plus, por el Conseil Régional de Bourgogne (becas FABER y PARI), por la Université de Bourgogne (programa BQR).

Este protocolo sigue las directrices de cuidado de los animales de la Université de Bourgogne y fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Bourgogne. 1. Los animales <ol><li> Utilice ratones O-IRES-tauGFP ingeniería genética disponibles en el Laboratorio Jackson. Estos ratones fueron desarrollados en el laboratorio del Dr. Peter Mombaerts &#39;con el fin de analizar la orientación axón y el desarrollo del sistema olfativo 19. Por ejemplo, la línea MOR23-IRES-tauGFP, código RS 006643, lleva el nombre de la cepa B6 oficial; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; del mismo modo, la línea SR1-IRES-tauGFP, código RS 6717 lleva el nombre B6 oficial; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ. </li><li> En cuanto a la edad de los animales: para un mejor resultado del protocolo, utilizar animales entre 2 y 4 semanas de edad. En este grupo de edad, la disección es más fácil (huesos más blandos, más firme epitelio olfativo) y las perillas dendríticas son bigger comparar a los animales más viejos. </li></ol> 2. Preparación de electrodos y Soluciones <ol><li> Para las pipetas estimulantes: compra prepulled estimular pipetas. De lo contrario, preparar manualmente. <ol><li> El uso de una llama, doble seis 1 mm pipetas de vidrio en alrededor de 1 cm de la punta. Inserte estos seis pipetas más unas rectas 7 º en 1,5 cm tubo de aislamiento fortalecer por un ojal. </li><li> Termocontraíbles el tubo para mantener los barriles unidos juntos. Adjuntar un tubo de aislamiento adicional a la otra extremidad de los barriles. Tire de esta pipeta estimulante con un extractor de múltiples barril. </li><li> Añadir un poco de pegamento líquido blanco alrededor del ojal para fortalecer las puntas dobladas. Deje secar O / N. </li></ol></li><li> Preparar 1 o 2 litros de solución extracelular normal del timbre (en mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH 2 PO 4 1,25, glucosa 15; pH 7.6 y 305 mOsm). Mantenga a 4 ° Chasta su uso. </li><li> Preparar solución madre intracelular (en mM): KCl 70, KOH 53, ácido metanosulfónico 30, EGTA 5, HEPES 10, sacarosa 70; pH 7,2 (KOH) y 310 mOsm. Mantenga a 4 ° C hasta su uso. Bueno para varias semanas. </li><li> Prepare la solución intracelular de grabación con nistatina extemporáneamente (a última hora) antes de experimento. <ol><li> Pesar 3 mg de nistatina, añadir 50 l de DMSO; vórtice 20 seg después sonicar 2-3 min hasta diluido por completo. </li><li> Añadir 20 l de solución de DMSO-nistatina en 5 ml de solución madre intracelular. Vortex 20 seg, después sonicar 3 min. Mantener esta solución a 4 ° C y proteger de la luz directa, nistatina es sensible a la luz. Esta solución se puede usar durante unas pocas horas. Vuelva a colocar todos los días. </li><li> Una vez que la preparación epitelio olfativo está bajo el microscopio, tomar parte de esta solución en una jeringa de 1 ml con una punta amarilla llama alargada para rellenar los electrodos; protegerlo de la luz directa. Una vez a temperatura ambiente, la solución de nistatinano es estable; sustituir la solución en la jeringa de 1 ml cada hora o mantenerlo en hielo. </li></ol></li><li> Tire de electrodos de grabación con un extractor para obtener cuello largo y pequeña propina (~ 2 m) con una resistencia de 15 a 20 mO con la solución de nistatina interna. </li><li> Prepare la solución odorante en 0,5 M en DMSO bajo campana de humos; alícuota y mantenerse a -20 ° C hasta su uso. Diluir odorante en solución de Ringer hasta la concentración deseada. Llenar la pipeta estimulante. </li></ol> 3. Preparación de epitelio olfativo Nota: los ratones O-IRES-tauGFP expresan la tauGFP bajo el control de la O promotor. En estos ratones, todas las neuronas que expresan el OR de interés están etiquetados con las buenas prácticas agrarias. Este protocolo está adaptado para RUP expresadas en todas las zonas. Sin embargo, disecciones y grabaciones son más fáciles para las RUP expresadas en la zona dorsal. <ol><li> Anestesiar al animal mediante la inyección de una mezcla de ketamina y xilazina (150 mg / kg y 10 mg / kg de DBOpeso y, respectivamente). Decapitación puede realizarse con unas tijeras afiladas para ratones jóvenes o con una guillotina roedor adecuadamente mantenido para los ratones de más edad. <ol><li> Usando anillo tijeras de disección hacen una incisión medial longitudinal a través de la piel dorsal. Quitar la piel tirando de él aparte. Usando las tijeras, corte la mandíbula inferior en la articulación de la mandíbula. Retire los dientes frontales superiores por un corte coronal paralela a los dientes. </li><li> Haga un corte coronal de la cabeza detrás de los ojos y mantener sólo la parte anterior de la cabeza. Sumergir en solución de Ringer helada para la disección en el ámbito. </li></ol></li><li> Diseccionar bajo el ámbito de aplicación: en la parte ventral, hacer un corte longitudinal a lo largo de la mandíbula superior / los dientes. Cortar los huesos dorsales longitudinalmente, siguiendo el lado dorso-lateral de la cavidad nasal. Retire la mayoría de los huesos y el paladar; transferir el tabique y el epitelio que se le atribuye en Ringer oxigenada a TA. </li><li> Para la disección definitiva: Justo antes de comenzar la grabaciónsesión, pelar lejos el epitelio del tabique subyacente con fórceps. Separe el epitelio con pinzas y con dos 4-5 mm cortes de tijera (uso microvannas tijeras) en la parte anterior del tabique, donde la adherencia es más fuerte. <ol><li> Retirar con cuidado el órgano vomeronasal por el corte a lo largo de su conexión dorsal al epitelio septal. Transferir el epitelio a una cámara de grabación con la capa de moco hacia arriba; mantenga plana en la cámara con un arpa. </li></ol></li><li> Instalar cámara bajo un microscopio vertical equipado con óptica de fluorescencia y una cámara sensible. Visualice la preparación en la pantalla del ordenador a gran aumento a través de un 40X objetivo de inmersión en agua (apertura numérica 0,8) y una ampliación 2X o 4X adicional alcanzado por una lente de aumento. Perfundir continuamente con Ringer oxigenada a TA (1-2 ml / min). </li></ol> 4. Grabación Sesión <ol><li> Búsqueda de células fluorescentes: excitar a la preparación a 480nm para EGFP, que emite luz en el rango de 530 a 550 nm; orientar una perilla dendríticas que es visible de forma fiable en la fluorescencia y bajo campo brillante. </li><li> Llenar electrodo con solución intracelular con nistatina; eliminar las burbujas golpeando suavemente sobre el electrodo. </li><li> Inserte electrodo sobre soporte del electrodo, aplique presión positiva en la pipeta; La resistencia debe ser 15-20 mO. </li><li> Traiga electrodo cerca de la célula; una vez que la resistencia alcanza ~ 40 mO, liberar la presión positiva y aplicar una ligera presión negativa para llegar a un gigaseal. </li><li> Una vez que se alcanza el sello, configure el potencial de membrana en alrededor de -75 mV; </li><li> Una vez que se abre la celda, proceder con protocolos de estimulación, tratamientos farmacológicos. Para medir la respuesta a una sola estimulación odorante, ficha 200-500 mseg de la actividad espontánea, para estimular 500 mseg y medir la respuesta de la célula para un máximo de 10 seg 13. Para los tratamientos farmacológicos, perfundir los agentes farmacológicos enla concentración deseada 20. </li></ol> Análisis 5. Datos <ol><li> Analizar las corrientes provocados por la estimulación odorante como sigue: la amplitud máxima, el tiempo de subida (tiempo necesario para alcanzar el 90% de la amplitud máxima, en mseg), la corriente total (área bajo la curva en PAS), el tiempo en el 50% (tiempo entre el inicio y el desplazamiento de la respuesta al 50% de la amplitud máxima, en mseg). <ol><li> El uso de las corrientes de pico de transducción (amplitud máxima alcanzada) a diferentes concentraciones, dibujar y ajustar una curva dosis-respuesta utilizando la ecuación de Hill: I = Imax / (1 ​​+ (K medio / C) n), donde I representa la corriente máxima IMAX la respuesta máxima a concentraciones de saturación, K1 / 2 la concentración a la que se llegó a la mitad de la respuesta máxima, C la concentración de odorante y n el coeficiente de Hill. </li></ol></li><li> Analizar las grabaciones de potencial de membrana en pinza de corriente para la despolarización máxima, la total potencial suscitó (área bajo la curva en mVsec); registro de actividad clavar espontánea durante 30 seg a 1 min grabaciones; registro de la excitabilidad través picos provocados por la inyección de corrientes (10.5 Pa). </li></ol>

<ol><li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+amplification+by+calcium-dependent+chloride+channels+in+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells.</a> Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).</li>
<li>Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-induced+responses+recorded+from+olfactory+receptor+neurons+using+the+suction+pipette+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique.</a> J Vis Exp. (62), e3862(2012).</li>
<li>Moss, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+biochemical+responses+of+mouse+vomeronasal+receptor+cells+to+urine-derived+compounds%3A+possible+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action.</a> Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).</li>
<li>Kaur, A., Dey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+calcium+imaging+of+dissociated+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons.</a> Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).</li>
<li>Ma, M., Chen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+rat+and+mouse+olfactory+receptor+neurons+from+an+intact+epithelial+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation.</a> J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).</li>
<li>Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li>
<li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li>
<li>Bozza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+class+I+and+class+II+odorant+receptors+to+glomerular+domains+by+two+distinct+types+of+olfactory+sensory+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse.</a> Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).</li>
<li>Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minigenes+impart+odorant+receptor-specific+axon+guidance+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb.</a> Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).</li>
<li>Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+of+mouse+olfactory+sensory+neurons+by+odorant+receptors+and+the+beta2+adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor.</a> Cell. 117 (6), 833-846 (2004).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Grosmaitre, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SR1%2C+a+mouse+odorant+receptor+with+an+unusually+broad+response+profile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile.</a> J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).</li>
<li>Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+responses+of+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptor+MOR23%3A+a+patch+clamp+analysis+in+gene-targeted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).</li>
<li>Lam, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+responsiveness+of+embryonic+mouse+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptors+S1+or+MOR23%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+stimulus+specificity+and+glomerular+position+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system.</a> Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).</li>
<li>Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+detection+of+amines+by+a+trace+amine-associated+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor.</a> J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).</li>
<li>Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+odorant+receptors+and+response+properties+of+olfactory+sensory+neurons+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice.</a> Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).</li>
<li>Cadiou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+odorant+exposure+induces+peripheral+olfactory+plasticity+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level.</a> J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+wiring+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal wiring in the mouse olfactory system.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).</li>
<li>Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+functions+of+mammalian+olfactory+sensory+neurons+as+odor+detectors+and+mechanical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors.</a> Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).</li>
<li>Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+response+properties+of+rat+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Odor response properties of rat olfactory receptor neurons.</a> Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).</li>
<li>Heydel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-binding+proteins+and+xenobiotic+metabolizing+enzymes%3A+implications+in+olfactory+perireceptor+events%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events.</a> Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).</li>
<li>Pelosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perireceptor+events+in+olfaction%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Perireceptor events in olfaction).</a> J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).</li>
<li>Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-phosphoinositides+modulate+cyclic+nucleotide+signaling+in+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons.</a> Neuron. 33, 731-739 (2002).</li>
<li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+%27IP%283%29-odors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors.</a> J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).</li>
<li>Savigner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+spontaneous+and+odorant-evoked+activity+of+rat+olfactory+sensory+neurons+by+two+anorectic+peptides%2C+insulin+and+leptin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin.</a> J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).</li>
<li>Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase-dependent+antagonism+in+mammalian+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons.</a> J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero contrapuesto.

La capacidad de este protocolo para controlar correctamente las propiedades de OSN saludables depende en gran medida de la calidad de la preparación. Por lo tanto, los pasos de disección son críticos. En primer lugar, es crítico que prestar atención a la calidad (pH, osmolaridad), la oxigenación y la temperatura del medio de disección (pero no congelado enfriado con hielo). En segundo lugar, la manipulación del epitelio con herramientas de disección debe ser tan limitado como sea posible para evitar daños. Por último, e...

Las neuronas sensoriales olfativas (OSN) representan el primer paso de la percepción olfativa. Situado en el epitelio olfativo que recubre la cavidad nasal en roedores, transforman la información química de los odorantes en los potenciales de acción se ha enviado a través de su axón al cerebro. Para entender mejor los mecanismos de codificación olfativas, es necesario para caracterizar las propiedades de transducción y de membrana de OSN. Hasta hace poco, la mayoría de las técnicas utilizadas para caracterizar las propiedades de OSN mamíferos se llevaron a cabo en disociado OSN 1-4. El proceso de disociación utiliza varios (es decir, enzimas) procesos mecánicos y químicos para liberar a los OSNs de su entorno. Estos procesos provocan un bajo número de células disponibles para las grabaciones. Este número bajo puede ser aún más crítico en el caso de células GFP marcado. La disociación también elimina los locales interacciones célula a célula entre OSN y otras células del epitelio olfativo que pueden mejorar survivcol y la modulación de las propiedades OSN. Con el fin de eludir el procedimiento de disociación, una preparación intacta fue desarrollado 5. Cada OSN expresa un receptor olfativo (OR) seleccionado de una gran familia multigénica 6. Hay ~ 1000 RUP expresadas en el epitelio olfativo principal en el ratón. Debido a la gran cantidad de O en los animales de tipo salvaje, las posibilidades para grabar OSN que expresan el mismo o son muy bajas. Para superar estas limitaciones, los ratones de genes dirigidos están disponibles en el que todos OSN expresan un identificadas o están etiquetados con una proteína fluorescente 7-9. Estos OSN marcadas se usan para hacer el análisis funcional en preparaciones disociadas 7,10,11 con los inconvenientes mencionados anteriormente. Una preparación epitelio intacto 5 de ratones genéticamente etiquetados por lo tanto, evita estos problemas. Permite el seguimiento de la actividad de OSN expresando RUP definidas con precisión en un entorno tan cerca en vivo posible. Además, patch-clamp grabaciones de OSN también permiten un análisis preciso de las propiedades de membrana, vía de transducción de la farmacología, ligando / O interacciones. Todos estos temas casi no se pueden analizar usando grabaciones extracelulares. Se utilizó esta técnica para controlar las respuestas de OSN que expresan los receptores de olor SR1 y MOR23 12,13. La viabilidad de la técnica fue confirmado por otros grupos en MOR23 expresan OSN 14, así como en otras regiones ultraperiféricas que expresan neuronas 15,16. El seguimiento de una población definida de OSN puede conducir al análisis de sus propiedades en muchos contextos diferentes, tales como el desarrollo 14, el envejecimiento 17, plasticidad inducida odorante 18, y el papel de las variaciones en la secuencia del receptor de odorizantes de olor en la codificación de 15. Así, este protocolo proporciona una poderosa herramienta para controlar las propiedades funcionales de OSN definidos a nivel de la membrana.

<table><tbody><tr><td>mesa vibratoria con jaula de Faraday</td><td>TMC</td><td>63-500 SERIES</td><td>requerida : aísla el sistema de grabación de las vibraciones inducidas por el entorno (movimientos del experimentador, vibraciones de equipos como ventiladores para enfriar computadoras, etc.); también se puede comprar con una jaula de Faraday, o equipar con una jaula de Faraday hecha a medida; esta jaula se recomienda para evitar el ruido eléctrico de la</td></tr><tr><td>óptica</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>del entornomicroscopio</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>microscopio vertical equipado con epifluorescencia; platina fija o móvil según la preferencia del usuario</td></tr><tr><td></td><td>objetivos Olympus</td><td>LUMPLFL40XW</td><td>al menos 2 objetivos requeridos: un 4X o 10X para el aproximación aproximada a la célula; y un ejemplo de inmersión de larga distancia 40X Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM</td></tr><tr><td>lupa</td><td>Olympus</td><td>U-TVCAC</td><td>ABSOLUTAMENTE NECESARIO: colocado en la trayectoria de luz entre el objetivo y la cámara; permite ampliar la imagen en la pantalla para llegar con precisión a la perilla con la cámara de electrodos de grabación</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>DP72</td>, <td>se requiere una buena cámara para ver las neuronas en fluorescencia así como en campo claro; el software de control es simple y permite tomar fotografías y hacer imágenes de cámara en vivo para monitorear el acercamiento del electrodo a la celda. No es necesaria una cámara ultrasensible</td></tr><tr><td>que filtre</td><td>Olympus/Chroma</td><td></td><td>en función de la proteína fluorescente utilizada en los ratones; ejemplo para GFP: excitación: BP460-490: emisión: HQ530/50m</td></tr><tr><td>amplificador</td><td>HEKA</td><td>EPC10 USB</td><td>monitorea las corrientes que fluyen a través del electrodo de registro y también controla el soplado enviando una señal TTL al spritzer; la configuración del EPC10 está controlada por</td></tr> un <tr><td>software</td> <td>informáticoHEKA</td><td>Patchmaster</td><td>controla el amplificador durante el experimento</td></tr><tr><td>micromanipulador</td><td>Sutter</td><td>MP225</td><td>micromanipulador de precisión, permite movimientos precisos de hasta 1/10 de micrómetro; este modelo es muy estable; evite los manipuladores hidráulicos que pueden derivar</td></tr> el <tr><td>extractor de electrodos</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>con un filamento de canal ancho FT345-B; &nbsp; para preparar pipetas de grabación de aproximadamente 2&micro; m de diámetro con una punta larga para llegar a las células; la resistencia debe ser de 15 a 20Mohm con solución de abrazadera de parche perforada</td></tr> de <tr><td>vidrio</td><td>Sutter</td><td>BF120-69-10</td><td>en nuestras condiciones de grabación, este vidrio es ideal para registrar pipetas</td></tr> cámara <tr>de<td>grabación</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td>se necesita una cámara para establecer la preparación bajo el microscopio. Para mantener la preparación en el centro de la cámara, se debe usar una red/ancla.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>vidrio de estimulación</tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>unido en grupos de 7, estas pipetas se utilizan para preparar pipetas estimulantes pretiradas</td></tr><tr><td>extractor multibarril</td><td>MDI</td><td>PMP-107-Z</td><td>por asociación de tracción y torsión, este extractor nos permite preparar electrodos de soplado con inyector de presión de precisión de 7 barriles</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Compañía Toohey</td><td>P / N T25-1-900 Un solo canal&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>este inyector de presión de precisión controla la presión expulsada en el extractor de barriles múltiples; es controlado manualmente o por el amplificador por un 5V&nbsp; </td></tr><tr><td>Micromanipulador</td> TTLs <td>Narishige</td><td>YOU-1</td><td>Un manipulador grueso es suficiente para acercar el electrodo de soplado al lugar de registro</td></tr><tr><td>Tubos N</td><td>/A</td><td></td><td>tygon para llevar la presión del puffer a la pipeta de soplado</td></tr><tr><td>Soluciones/perfusión/Productos químicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bomba de vacío</td><td>gardner denver</td><td>300 series</td><td>Una bomba de membrana vibratoria es más silenciosa y eficiente que otros tipos de bombas</td></tr><tr><td>sistema de perfusión</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>sistema de perfusión por gravedad con tubo de polietileno para introducir y sacar la solución externa de la cámara de registro</td></tr><tr><td>nistatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td><td>obligatorio para perpar solución interna para parche perforado abrazadera de parche</td></tr><tr><td>DIMETILSULFÓXIDO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>utilizado para disolver la nistatina para la solución interna del parche perforado&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>solución extracelular</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>solución intracelular/extracelular</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>solución extracelular</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico monohidratado (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>solución extracelular</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td>solución extracelular</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>solución extracelular</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bicarbonato de sodio Sigma-Aldrich S6297EGTA (Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N&prime;,N&prime;-ácido tetraacético)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Solución interna</td><td>E3889</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>solución interna Sulfóxido de metilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387509</td><td>solución intracelular</td></tr><tr><td>Hepes-Na</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>solución intracelular</td></tr></tbody></table>

perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio intacto: análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor identificado

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analizando las respuestas fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas (OSN) cuando son estimuladas con ligandos específicos es fundamental para entender la base de comportamientos-olfativas impulsada y su modulación. Estas propiedades de codificación dependen en gran medida de la interacción inicial entre las moléculas de olor y el receptor olfatorio (OR) expresados ​​en las OSN. El espectro de la identidad, la especificidad y el ligando de la O expresado son críticos. La probabilidad de encontrar el ligando de la O expresado en una OSN elegido al azar dentro del epitelio es muy baja. Para hacer frente a este reto, este protocolo utiliza genéticamente ratones etiquetados que expresan la proteína fluorescente GFP bajo el control del promotor de RUP definidos. OSNs se encuentran en un epitelio apretado y organizada que recubre la cavidad nasal, con las células vecinas influir en su maduración y función. Aquí se describe un método para aislar un epitelio olfatorio intacto y grabar a través de patch-clamp grabaciones las propiedades de OSN correoXpressing receptores de olor definidas. El protocolo permite que uno para caracterizar propiedades de la membrana OSN mientras se mantiene la influencia del tejido vecino. Análisis de los resultados de patch-clamp produce una cuantificación precisa de ligando / O interacciones, las vías de transducción y la farmacología, las propiedades de codificación OSN y de su modulación a nivel de la membrana.

El resultado de este protocolo depende de la calidad de la disección. Estos pasos de disección deben ser cortos (menos de 10 a 15 min) y preciso (es decir, para evitar daños del epitelio). La Figura 1 ilustra cómo una preparación ideal se parece a diferentes niveles de aumento. Con una ampliación baja en campo claro los diferentes tipos de células (tales como perillas de OSN, el apoyo a las células) son distinguibles (Figura 1). En el nivel de ampliación más alta, normalmente 8...

El análisis de las propiedades fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas aún enfrenta limitaciones técnicas. Aquí los registramos a través de una pinza de parche perforada en una preparación intacta del epitelio olfativo en ratones dirigidos a genes. Esta técnica permite la caracterización de las propiedades de la membrana y las respuestas a ligandos específicos de neuronas que expresan receptores olfativos definidos.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

El objetivo general de este procedimiento es medir los cambios en las propiedades de la membrana de las neuronas sensoriales olfativas en respuesta a estímulos odorantes. Esto se logra primero mediante la disección del epitelio olfativo y su transferencia a una cámara perfundida. El segundo paso consiste en localizar y seleccionar una OSN de interés bajo el microscopio.A continuación, se realiza un registro mediante parche en el botón dendrítico de la OSN seleccionada y se analiza mientras se estimula con odorantes. En última instancia, el registro mediante parche perforado de los botones dendríticos de las OSN caracteriza las propiedades funcionales de las OSN a nivel de membrana. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la olfacción, como la grabación de neuronas sensoriales olfativas que expresan receptores definidos para odorantes, así como también registros mediante parche.Proporcione información sobre las propiedades de la membrana de estas neuronas. Prepare las pipetas estimuladoras a partir de vidrio de un milímetro o compre pipetas ya haladas utilizando una llama. Doble seis pipetas aproximadamente un centímetro desde la punta formando un ángulo de 45 grados.Luego, coloque las seis pipetas de punta doblada alrededor de una séptima pipeta recta, utilizando un ojal como guía, y envuélvalas con tubo termorretráctil. Aplique calor al envoltorio termorretráctil en el otro extremo de las pipetas. Aplique más envoltorio termorretráctil.Esto permite fabricar una pipeta estimuladora de siete barriles. Ahora, utilizando un tirador polar multiposición, tire de la pipeta estimuladora de siete barriles. Una vez estirada, refuerce el ensamblaje con un poco de pegamento blanco alrededor del ojal.Luego, deje que el pegamento se seque durante la noche con las soluciones requeridas. La solución de nistatina debe prepararse fresca justo antes de usarla. Cuando sea necesario, pese tres miligramos de nistatina y añádalos a 50 microlitros de DMSO.Luego, vortexee la mezcla durante 20 segundos. A continuación, someta la mezcla a sonicación durante dos o tres minutos para asegurar una dilución completa. Ahora, agregue 20 microlitros de la mezcla a cinco mililitros de solución stock intracelular.Vortex la mezcla durante 20 segundos, seguido de dos a tres minutos de sonicación. Luego enfríe la solución de trabajo en hielo y manténgala protegida de la luz. De esta manera, la solución de trabajo es estable durante varias horas.Cargue una jeringa equipada con microfilme con la solución de trabajo. Será útil durante una hora de uso hasta que se utilice. Sin embargo, conserve la jeringa cargada manteniéndola sobre hielo.Ahora prepare algunos electrodos de registro con cuellos largos y aberturas de dos micrómetros. El objetivo es obtener una resistencia de 15 a 20 megaohmios una vez cargados con la solución de nistatina. Por último, cargue la pipeta estimuladora con el odorante diluido en solución de Ringer.Para este protocolo, tenga ratones disponibles entre dos y cuatro semanas de edad. En esta presentación, se utilizan ratones que expresan o IRES tau GFP mediante el uso de ratones o IS tau GFP. Todas las neuronas que expresen el o de interés estarán marcadas con GFP.Este método puede utilizarse para receptores olfativos expresados en todas las zonas. Sin embargo, las disecciones y grabaciones serán más sencillas para receptores olfativos expresados en la zona dorsal. Comience por anestesiar y luego decapitar un ratón.El resultado de este protocolo depende de la calidad de la disección. Estos pasos de disección deben ser lo más breves posible y precisos. Para comenzar la cirugía, utilice tijeras de disección para realizar un corte longitudinal a lo largo del dorso.Separar la piel para retirarla. Luego, cortar a lo largo de la mandíbula inferior y realizar un corte coronal paralelo a los dientes. De esta manera, extraer los dientes incisivos superiores.Ahora realice un corte coronal alrededor de la cabeza, detrás de los ojos, deseche la cabeza posterior y transfiera la porción anterior a ringer frío con hielo. Ahora, bajo un microscopio de disección, aísle el septo en un lapso de cinco a diez minutos. Comience con un corte longitudinal a lo largo del lado ventral.Luego, corte los huesos dorsales longitudinalmente a lo largo del lado dorsolateral de la cavidad nasal. A continuación, retire la mayor parte de los huesos y el paladar. Transfiera el tabique aislado junto con el epitelio a un recipiente con solución de Ringer oxigenada a temperatura ambiente.En menos de cinco minutos, realice los preparativos finales antes de la grabación. La solución no debe estar demasiado caliente, o el preparado se verá dañado. Para acceder al epitelio neuroepitelial y realizar la grabación.Primero, desprenda el epitelio del tabique subyacente con pinzas. Luego, utilizando tijeras micro Vanna, corte el extremo anterior del tabique para liberar el epitelio. Ahora retire cuidadosamente el órgano nasal del vómer.Córtelo en el lugar donde está unido dorsalmente. Ahora se puede trasladar el epitelio aislado a la cámara de registro con el lado del moco hacia arriba. Una vez colocado, utilice un arco para aplanar el tejido.Luego, transfiera la cámara a un microscopio invertido. Visualice el epitelio neural mediante un objetivo de inmersión en agua de 40 x mientras lo perfunde continuamente con solución de Ringer fresca a temperatura ambiente. Para comenzar la búsqueda de las células de interés, que en este caso expresan EGFP, se utiliza luz de 480 nanómetros para escanear las células que emiten luz en el rango de 530 a 550 nanómetros.Las botones dendríticos y los osn dirigidos, cuando se observan a un aumento de 80 a 160 veces con campo claro, deben distinguirse claramente de las células de sostén. Ahora cargue el electrodo con una solución de S estatina. Elimine cualquier burbuja que se forme y fije el electrodo al porta-electrodos.Ahora aplique algo de presión positiva. La resistencia esperada está entre 15 y 20 megaohmios. Luego acerque el electrodo a la célula manteniendo la presión positiva.Cuando la resistencia aumente a aproximadamente 40 megaohmios, libere la presión y aplique una ligera presión negativa. Si se forma un sello giga, el potencial de membrana debe fijarse en aproximadamente -75 milivoltios. Ahora que la célula está abierta, continúe con el experimento.Aplique estímulos, protocolos y perfusión con tratamientos farmacológicos según sea necesario para probar con un solo odorante. Registre de 200 a 500 milisegundos de actividad espontánea. Aplique el odorante durante 500 milisegundos y luego mida las respuestas hasta por 10 segundos utilizando el protocolo descrito.Las neuronas que expresan MOR 23, marcadas con EGFP, fueron parcheadas y estimuladas con diferentes concentraciones de al. En el modo de fijación de corriente, lyal es un ligando para MOR 23. Alternativamente, las células fueron simuladas en el modo de fijación de voltaje.En grabaciones en modo de bloqueo de voltaje, se monitorearon diferentes características. Para cuantificar la respuesta, tal como se realiza clásicamente en electrofisiología utilizando la respuesta de amplitud máxima, se representó la respuesta dosis-dependiente mediante la ecuación de Hill. Estos resultados proporcionan información sobre las propiedades de codificación de cada OSN, que incluye su umbral de detección, temporalidad, rango dinámico y nivel de saturación.Una vez dominada, la parte de disección de esta técnica puede realizarse en 10 a 15 minutos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo explorar las propiedades funcionales de neuronas sensoriales olfativas que expresan receptores de odorantes definidos en ratones.

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Investigación

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Neurociencia

El electroolfactogram (EOG) de grabación es una manera informativa, fácil de realizar, y fiable para evaluar la función olfatoria a nivel del epitelio olfativo. Este protocolo describe un sistema de grabación, preparación de los tejidos del ratón, la recopilación de datos y análisis de datos básicos.

Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Neuronas olfativas del receptor (ORNs) convertir señales de olor primero en un receptor de corriente que a su vez desencadena los potenciales de acción que se transmiten a las neuronas de segundo orden en el bulbo olfatorio. Aquí se describe la técnica de pipeta de succión de grabar simultáneamente el receptor de odorizantes de la corriente inducida y los potenciales de acción de ORNs ratón.

Inducidas Odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta

Este video muestra el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales olfativas (OSN) en ratones utilizando una técnica de patch-clamp perforada. El epitelio olfativo, que contiene OSN con receptores de olor marcados con fluoróforos, se aísla de un ratón y se asegura en una cámara de registro. Una pipeta de registro se sujeta a la perilla dendrítica de un OSN, y la nistatina dentro de la pipeta perfora la membrana para formar una conectividad eléctrica con la célula. Por último, se...

Registro de neuronas sensoriales olfativas en ratones

El video del protocolo describe el establecimiento de una pinza de parche de célula completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales del órgano vomeronasal (VNO) en ratones. Un corte coronal de VNO con neuronas sensoriales marcadas con fluorescencia se coloca en una configuración de grabación. Una neurona marcada se conecta con una pipeta de registro en una configuración de celda completa para el registro electrofisiológico en respuesta a estímulos químicos.

Establecimiento de una pinza de parche de celda completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales vomeronasiales

Demostramos variaciones de la técnica de grabación extracelular de múltiples unidades para caracterizar el mal olor respuestas evocadas en las tres primeras etapas de la vía olfativa invertebrado. Estas técnicas se pueden adaptar fácilmente para examinar la actividad conjunto en otros sistemas neurales también.

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

Un método eficaz para Deshuesado Manual Preparar Intact ratón tejido nasal con la organización anatómica Conservas

Los cilios de las neuronas sensoriales olfativas contienen proteínas de la cascada de transducción de señales, pero un análisis espacial detallado de su distribución es difícil en las criosecciones. Describimos aquí un enfoque optimizado para el marcaje de montaje completo y la visualización en la cara de las proteínas ciliares.

Todo el montaje de etiquetado de los cilios en el sistema olfativo principal de ratones

Aquí, describimos un enfoque fisiológico que permite la identificación y el análisis en profundidad de una población definida de neuronas sensoriales en cortes agudos de tejido coronal del órgano vomeronasal de ratón utilizando registros de patch-clamp de células completas.

Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

Caracterizar la función de receptores odorantes sirve una parte indispensable en el proceso de deorphanization. Se describe un método para medir la activación de receptores odorantes en tiempo real utilizando un ensayo de campo.

Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real

Las neuronas sensoriales olfativas expresan una amplia variedad de moléculas de clasificación de axones para establecer circuitos neurales adecuados. Este protocolo describe un método de tinción inmunohistoquímica para visualizar las expresiones combinatorias de las moléculas de clasificación de axones en los terminales axónicos de las neuronas sensoriales olfatorias.

Imunocoloración Cuádruple del Bulbo Olfativo para la Visualización de Códigos de Identidad Molecular del Axón Sensorial Olfativo

Aprende a realizar grabaciones de patch-clamp perforado en neuronas sensoriales olfativas de ratón en neuroepitelio intacto. Este método permite caracterizar propiedades de membrana y respuestas a odorantes específicos.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado (Video) | JoVE Journal

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

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