Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

El objetivo general de este procedimiento es medir los cambios en las propiedades de la membrana de las neuronas sensoriales olfativas en respuesta a los estimulantes del olor. Esto se logra diseccionando primero el epitelio olfativo y transfiriéndolo a una cámara perfundida. El segundo paso es localizar y elegir un OSN de interés bajo el microscopio.

A continuación, se pinza el parche y se analiza el pomo dendrítico del OSN elegido mientras se estimula con odorantes. En última instancia, la sujeción de parches perforados de protuberancias dendríticas de OSN caracteriza las propiedades funcionales de OSN a nivel de membrana. Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en los campos del olfato, como el registro de las neuronas olfativas y sensoriales, la expresión de receptores de arte de olores definidos, y también las grabaciones de pinzas de parche.

Proporcionar información sobre las propiedades de membrana de estas neuronas. Prepare las pipetas estimulantes con un vaso de un milímetro o cómprelas pretiradas con una llama. Doble seis pipetas aproximadamente un centímetro desde la punta hasta un ángulo de 45 grados.

A continuación, coloque las seis pipetas de punta doblada alrededor de una séptima pipeta recta, utilizando un ojal como guía, y envuélvalas en un tubo termorretráctil. Caliente la envoltura retráctil en el otro extremo de las pipetas. Aplique más envoltura retráctil.

Esto hace que una pipeta estimulante prepo de siete barriles. Ahora, utilizando un tirón polar de varios barriles, tire de la pipeta estimulante de siete barriles. Una vez tirado, refuerce el conjunto con un poco de cola blanca alrededor del ojal.

Luego deje que el pegamento se seque durante la noche de las soluciones requeridas. La solución de nistatina debe hacerse fresca justo antes de ser utilizada. Cuando sea necesario, pese tres miligramos de nistatina y agréguelo a 50 microlitros de DMSO.

Luego mezcle el vórtice durante 20 segundos. A continuación, sonique la mezcla durante dos o tres minutos para asegurar una dilución completa. Ahora agregue 20 microlitros de la mezcla a cinco mililitros de solución madre intracelular.

La mezcla de Vortex durante 20 segundos, seguidos de dos o tres minutos de sonicación. A continuación, enfríe la solución de trabajo con hielo y manténgala preparada protegida de la luz. De esta manera, la solución de trabajo es buena durante unas horas.

Cargue una jeringa equipada con microfilm con solución de trabajo. Será bueno para una hora de uso hasta que se use. Sin embargo, conserve la jeringa cargada manteniéndola en hielo.

Ahora tire de unos electrodos de registro con cuellos largos y aberturas de dos micras. El objetivo es obtener una resistencia de 15 a 20 mega ohmios una vez cargado con la solución de nistatina. Por último, cargue la pipeta estimulante con odorante diluido en timbre. Solución.

Para este protocolo, tenga ratones disponibles entre las dos y las cuatro semanas de edad. En esta presentación, se utilizan ratones que expresan o IRES tau GFP mediante el uso de ratones IS tau GFP. Todas las neuronas que expresen el o de interés se marcarán con GFP.

Este método se puede utilizar o expresar en todas las zonas. Sin embargo, las disecciones y registros serán más fáciles para los quirófanos expresados en la zona dorsal. Comienza por anestesiar y luego decapitar a un ratón.

El resultado de este protocolo depende de la calidad de la disección. Estos pasos de disección deben ser lo más cortos posible y precisos. Para comenzar la cirugía, use tijeras de disección para hacer un corte longitudinal a lo largo del dorso.

Separa la piel para quitarla. A continuación, corte a lo largo de la mandíbula inferior y haga un corte coronal paralelo a los dientes. Por lo tanto, retire los dientes incisivos superiores.

Ahora haga un corte coronal alrededor de la cabeza, detrás de los ojos, deseche la cabeza posterior y transfiera la porción anterior a los timbres helados. Ahora, bajo un microscopio de disección, aísle el tabique dentro de cinco a 10 minutos. Comience con un corte longitudinal a lo largo del lado ventral.

A continuación, corte los huesos dorsales longitudinalmente a lo largo de la cara lateral dorsal de la cavidad nasal. A continuación, retire la mayoría de los huesos y el paladar. Transfiera el tabique aislado y conecte el epitelio a un recipiente de timbres oxigenados a temperatura ambiente.

Dentro de cinco minutos, haga los preparativos finales antes de grabar. La solución no debe estar demasiado tibia, o la preparación se verá dañada. Acceder al epitelio neuronal para su grabación.

Primero, pegue el epitelio del tabique subyacente con pinzas. Luego, con unas tijeras micro Vanna, corte el extremo anterior del tabique para liberar el epitelio. Ahora retire con cuidado el órgano nasal del vómer.

Córtalo donde está unido dorsalmente. El epitelio aislado ahora se puede mover a la cámara de registro con el moco hacia arriba. Una vez en su lugar, use un arpa para aplanar el tejido.

A continuación, transfiera la cámara a un microscopio vertical. Visualice el epitelio neuro bajo un objetivo de inmersión en agua de 40 veces mientras lo perfunde continuamente con timbres nuevos a temperatura ambiente. Para comenzar la búsqueda de las células de interés, que en este caso expresan EGFP, se utiliza luz de 480 nanómetros para buscar células que emiten luz en el rango de 530 a 550 nanómetros.

Las protuberancias dendríticas y el osn específicos, cuando se revisan a 80 a 160 x en campo claro, deben distinguirse claramente de las células de soporte. Ahora cargue el electrodo con una solución de estatinas S. Golpee las burbujas que se formen y fije el electrodo al soporte.

Ahora aplica un poco de presión positiva. La resistencia esperada está entre 15 y 20 mega ohmios. A continuación, lleve el electrodo a la célula manteniendo la presión positiva.

Cuando la resistencia aumente a unos 40 mega ohmios, libere la presión y aplique una ligera presión negativa. Si se hace un sello giga, el potencial de membrana debe fijarse a unos 75 milivoltios negativos. Ahora que la celda está abierta, continúe con el experimento.

Aplique la estimulación, los protocolos y perfunde con los tratamientos farmacológicos según sea necesario para probar con un solo odorante. Registre de 200 a 500 milisegundos de actividad espontánea. Aplique el odorante durante 500 milisegundos y luego mida las respuestas durante un máximo de 10 segundos utilizando el protocolo descrito.

MOR 23, que expresaba neuronas marcadas con EGFP, fueron parcheadas y estimuladas con diferentes concentraciones de al. En el modo de pinza amperimétrica, lyal es un ligando para MOR 23. Alternativamente, las celdas se simularon bajo el modo de pinza de voltaje.

En los registros en modo de pinza de voltaje, se monitorearon diferentes características. Para cuantificar la respuesta tal y como se realiza clásicamente en electrofisiología utilizando la respuesta de máxima amplitud, la respuesta a la dosis se graficó utilizando la ecuación de Hill. Estos resultados proporcionan información sobre las propiedades de codificación de cada OSN, que incluye su umbral de detección, temporal, dinámico, rango dinámico y nivel de saturación.

Una vez dominada, la parte de disección de esta técnica se puede realizar en 10 a 15 minutos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo explorar las propiedades funcionales de las neuronas sensoriales olfativas que expresan receptores odorantes definidos en ratones.