Aplicando estereotáctica Técnica de Inyección para el Estudio de los efectos genéticos sobre Comportamientos animales

El objetivo general de este procedimiento es evaluar cómo la modulación de la expresión de un gen en un área diana afecta al comportamiento animal. Esto se logra creando primero un lentivirus para modular la expresión del gen diana. El segundo paso es usar la inyección estereotáctica para inyectar el lentivirus en un área específica del cerebro del roedor ER.

Los siguientes comportamientos, como la ansiedad y la depresión, se pueden medir cuantitativamente utilizando paradigmas conductuales establecidos. El paso final es realizar una histología para confirmar el sitio de inyección correcto. En última instancia, la inyección estereotáctica junto con la evaluación del comportamiento puede mostrar cómo un gen específico en un área objetivo puede afectar el comportamiento de los ratones.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que los científicos pueden cambiar la expresión de un solo gen en un área específica pequeña y luego evaluar los cambios de comportamiento en ratones. Para comenzar este procedimiento, coloque un ratón anestesiado en el aparato estereotáctico, enganche los dientes frontales a la pinza anterior y asegure la mandíbula. A continuación, inserte las barras auriculares en los canales auditivos para estabilizar completamente la cabeza.

A continuación, coloque una almohadilla térmica debajo del mouse para regular su temperatura corporal. Durante todo el procedimiento, coloque lágrimas artificiales en los ojos del roedor para evitar que se sequen. Después de eso, limpie a fondo el área quirúrgica frotando primero yodo de povidona al 10% con un hisopo de algodón con movimientos circulares.

Posteriormente, frote alcohol etílico al 70% en el sitio quirúrgico de la misma manera. Repita este procedimiento de limpieza dos veces más. Una vez que el mouse esté preparado, abra la bolsa estéril del equipo.

Cámbiese los guantes antes de tocar los instrumentos. A continuación, saque el paño estéril y coloque los instrumentos sobre el paño. Ahora agarre suavemente la piel del ratón con las pinzas del extremo de la sangre y haga una incisión con un bisturí.

Comience la incisión aproximadamente 1,5 centímetros por encima de las orejas y extiéndala hasta aproximadamente 0,5 centímetros por debajo de las orejas para exponer el bgma. Una vez que se visualice la glucosa en sangre, use una punta de algodón estéril para eliminar suavemente la sangre que cubre la superficie del cráneo. Luego use dos puntas de algodón para empujar la piel hacia los lados de la cabeza.

A continuación, en la campana extractora, llene una jeringa con el virus que se va a inyectar. Asegúrese de que no haya burbujas atrapadas en el interior. A continuación, coloque una jeringa en el aparato estereotáctico, asegurándose de que esté completamente asegurada.

Después de eso, baje lentamente la jeringa hasta que esté justo por encima de la superficie del cráneo. A continuación, mueva la punta de la aguja de la jeringa estéril hasta la intersección de B bgma y la línea interrural. Establezca este punto en cero.

A continuación, establezca las coordenadas del área de interés. Mueva la aguja de la jeringa hasta el sitio objetivo que se va a perforar. Luego, coloque la broca justo encima del sitio objetivo en un ángulo de 45 grados con respecto al cráneo y comience a perforar.

Tenga cuidado de no perforar el cerebro para evitar el daño cortical. Después de eso, limpie la sangre del agujero con una punta de algodón estéril. Baje la jeringa de modo que la punta quede justo en la superficie del cerebro.

Establezca la coordenada DV en cero, luego baje la jeringa a la profundidad deseada. Ahora inicie la inyección a una velocidad de 0,2 microlitros por minuto. Una vez finalizada la inyección, espere unos dos minutos para asegurarse de que se haya absorbido cualquier virus residual.

A continuación, levante lentamente una jeringa. Use una punta de algodón para limpiar cualquier líquido del sitio de la inyección. Después, sutura la piel y retira al animal del sistema estereotáctico.

Mantenga el mouse en la almohadilla térmica hasta que se despierte y administre analgésico adicional cuando sea necesario. En este procedimiento, obtenga una arena cuadrada de plástico. Limpie la arena con alcohol etílico al 70% antes del experimento.

A continuación, coloque la arena en el suelo y asegúrese de que la iluminación esté configurada para minimizar las sombras y el deslumbramiento. A continuación, ajuste la configuración de detección para que el mouse sea visible en la pantalla. Después de eso, encienda la cámara para grabar la tarea de comportamiento y coloque el mouse hacia el frente central de la arena para que el mouse esté frente a la pared.

Pon el temporizador en cinco minutos y aléjate de la arena o sal de la habitación. Después de cinco minutos, transfiera el ratón de regreso a la jaula. Use alcohol etílico al 70% para limpiar a fondo el campo antes de pasar al siguiente animal.

Ahora llene un balde transparente de dos litros con agua a 22 grados. Coloque el cubo en el suelo y asegúrese de que la iluminación esté configurada para minimizar las sombras y el deslumbramiento. Si utiliza un software de seguimiento, coloque la cámara directamente encima del cubo.

Ajuste la configuración del software para que el mouse sea fácilmente visible en la pantalla. A continuación, encienda la cámara para grabar la tarea de comportamiento. Coloque suavemente el ratón en el centro del cubo de agua para que sus patas delanteras.

Toque el agua primero y evite que su cabeza se sumerja. Después, pon el temporizador en seis minutos antes de alejarte del área de comportamiento. Después de seis minutos, retire el ratón del balde, limpie el exceso de agua antes de volver a colocarlo en la jaula.

Aquí hay un corte de cerebro representativo, que ilustra la inyección exitosa del virus en el giro dentado. Esta figura muestra la cantidad de tiempo que los ratones de control y experimentales pasaron en el centro de un nuevo campo abierto. Los ratones experimentales pasaron significativamente menos tiempo en el centro de la arena, lo que indica un fenotipo de ansiedad, y esta figura muestra la cantidad de tiempo que los ratones de control y experimentales están inmóviles en la prueba de natación forzada.

Los ratones experimentales no fueron significativamente diferentes de los controles en la cantidad de tiempo que pasaron inmóviles. Después de ver este video, los espectadores deben tener una buena idea de cómo usar las inyecciones estereotácticas para evaluar el comportamiento de los roedores.