Name: Aplicando estereotáctica Técnica de Inyección para el Estudio de los efectos genéticos sobre Comportamientos animales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprende a realizar inyecciones estereotácticas de lentivirus en cerebro de roedores para estudiar efectos genéticos sobre comportamientos de ansiedad y depresión mediante pruebas estandarizadas.

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Este trabajo está financiado en parte por la Subvención de Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón y el Premio al Investigador Joven de NARSAD a Yingwei Mao.

NOTA: Todos los protocolos con animales fueron seguidos de acuerdo con las directrices de cuidado de animales de la Universidad Estatal de Pennsylvania, IACUC # 44057 1. Lentivirus Producción NOTA: El día antes de la transfección, las células LentiX-293 debe ser de al 80% de confluencia. <ol><li> Enjuagar las células con DMEM justo antes de la transfección y se incuban en 10 ml de DMEM / FBS al 10% con penicilina (100 UI / ml) y estreptomicina (100 g / ml) durante 5 min a RT. </li><li> Diluir ADN y polietilenimina (PEI) (1 mg / ml) en relación 1: 3 (1 g de ADN: 3 l de PEI) en 1 ml de DMEM y agitar durante 1 min. El volumen de ADN añadido es dependiente de la concentración del ADN. Incubar a TA durante 10 min. <ol><li> Por ejemplo, utilizar 20 g de ADN plásmido, compuesto por 10 g de plásmido vector, 5 g de psPax2 14 plásmido, 5 g de virus de la estomatitis vesicular (VSV) con 60 l de PEI por plato. </li></ol></li><li&gt; mezclar el ADN y la solución de PEI de nuevo por agitación durante 1 minuto. Incubar a TA durante 10 min. </li><li> Añadir 1 / 10a volumen de medio de cultivo total de DMEM (es decir, 1 ml de medio de cultivo 10 ml en una placa de 100 mm). Añadir 1 ml de DNA-PEI gota a gota la mezcla en el plato y girar el plato alrededor hasta al medio de cultivo es bien mezclado con el ADN. </li><li> Incubar durante 6 hr a RT y eliminar el sobrenadante. Añadir 5 ml de medio de cultivo. </li><li> 48 h después de la transfección, recoger el líquido sobrenadante viral y centrifugado a 627 xg durante 5 min a 4 ° C en un tubo de 50 ml. Filtra 30 ml de sobrenadante viral a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras en un tubo de ultracentrífuga. </li><li> Añadir agua estéril para equilibrar los tubos, y cubrir los tubos con pequeño trozo de parafina. Tubos giran a 11.249 xg durante 120 min a 4 ° C. Retire el líquido usando una punta de vacío. </li><li> Añadir 100 l de PBS frío del tubo. Agite suavemente el tubo a 4 ° CO / N. </li><li> Para volver a suspender el virus, la pipeta tse añadió PBS en el paso 1.8 en los pellets de 10 veces, con cuidado de no tocar el pellet con la punta. El pellet no se volvió a suspenderse hasta que haya terminado. </li><li> Alícuota el virus a 10-20 l por tubo, flash-congelación en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. </li></ol> 2. La inyección estereotáctica 2.1) Preparación de Instrumentos <ol><li> Coloque un par de tijeras, fórceps-extremos romos, un soporte de aguja, bisturí, hisopos de algodón, y un paño en un paquete sellado con un indicador de esterilización, y autoclave antes de la cirugía. Además, obtener 10% de yodo povidona, 70% de alcohol etílico, suturas absorbibles, una almohadilla eléctrica, lágrimas artificiales, un cordón esterilizador de vidrio, taladro, una broca, 2 jeringas desechables, una jeringa de inyección, máquina de afeitar eléctrica, analgésico (ketoprofeno), anestesia (Avertin), guantes, y un aparato estereotáctico con la bomba de inyección. </li><li> Hacer solución 1.25% avertin fresco ese día, el filtro en una campana estéril usando un 0,2 y# 181; m filtro de jeringa estéril, y colóquelo en un vial de suero estéril. Mezclar 2,5 g de alcohol 2,2,2-tribromoetilo en 5 ml de alcohol terc-amilo, luego se disuelven en 200 ml de agua. Mantener el pH por debajo de 5. 15 </li></ol> 2.2) Preparación del ratón <ol><li> Administrar avertin basado en el peso del ratón (375 mg / kg). 15 Inyectar el ratón con el avertin a través de una inyección intraperitoneal (IP) y, a continuación, coloque de nuevo en su jaula hasta que esté totalmente anestesiado. </li><li> Dale un analgésico a través de inyección IP (ketaprofen, 5 mg / kg), y el lugar de lágrimas artificiales en los ojos del ratón para evitar que se seque. </li><li> Asegúrese de que el ratón es completamente dormido pellizcando su pie. Si el ratón responde a la pizca pie, a continuación, dar más anestésico (en dosis de 50 l). Afeitarse la cabeza del ratón usando una máquina de afeitar eléctrica. Afeitarse el área a ser operado (típicamente desde justo detrás de las orejas, en la parte superior del hocico), y sus alrededores. </li><li> Coloque el puntero del ratón into del aparato estereotáxica. Cierre los dientes frontales en la abrazadera anterior, y baje la abrazadera y apriete para que la mandíbula es totalmente seguro. </li><li> Inserte las barras de oído en el canal auditivo para estabilizar por completo la cabeza. Tenga cuidado de no insertar las barras de oído en demasiado, lo que podría dañar el oído interno. Una vez terminado, el cuerpo del ratón debe ser capaz de ser movido ligeramente sin alterar la posición de la cabeza. </li><li> Coloque una almohadilla de calefacción bajo el ratón para regular la temperatura corporal del ratón durante todo el procedimiento. </li><li> Limpie el área quirúrgica a fondo. El uso de un hisopo de algodón, frotar 10% de povidona yodada en un movimiento circular, comenzando desde el centro de la zona quirúrgica y moviéndose hacia el exterior. A continuación, utilice un hisopo de algodón para frotar 70% de alcohol etílico en el sitio quirúrgico de la misma manera. Repetir dos veces. </li></ol> 2.3) La primera incisión <ol><li> Una vez que el ratón está preparada, abra la bolsa de material estéril. Cambiar los guantes antes de touching los instrumentos. Saque el paño estéril y colocar los instrumentos en la tela. Si cualquier instrumento toca una superficie no-estériles, utilice el cordón esterilizador de vidrio durante 15 segundos para esterilizarlo. </li><li> Tome el bisturí en la mano y de gama contundente fórceps dominantes en la mano no dominante. Utilice las pinzas de gama contundente a suavemente agarre la piel del ratón, y hacer una incisión con el bisturí. Comience la incisión alrededor de 1,5 cm encima de las orejas (hacia la nariz) y se extienden a aproximadamente 0,5 cm por debajo de las orejas. Extienda la incisión vertical en la parte media de la cabeza del ratón para exponer bregma (Figura 1). </li><li> Una vez que se visualiza bregma, tome una punta de algodón estéril para eliminar suavemente sangre que cubre la superficie del cráneo. Use dos puntas de algodón para empujar la piel hacia el lado de la cabeza. </li></ol> 2.4) Configuración del equipo <ol><li> Después de cualquier sangre se retira de la superficie del cráneo, y bregma se visualiza claramente, preparar la jeringa (CONcentración de 10 8 TU / ml, volumen de 1 l). En la campana de humos, llenar la jeringa con el virus a inyectar. Asegúrese de que no hay burbujas en el interior. Coloque la jeringa en el aparato estereotáxica, asegurándose de que está completamente asegurada. </li><li> Lentamente baje la jeringa hasta que está justo encima de la superficie del cráneo, de modo que la punta de la aguja de la jeringa estéril se establece en la intersección de la bregma y la línea interaural. Establezca este punto como cero, y determinar las coordenadas de este punto. </li><li> En función del área cerebral de interés, variar las coordenadas estereotáxica. Determinar estas coordenadas mediante la utilización de un atlas cerebral 4. Una vez determinadas las coordenadas, mover la aguja de la jeringa para que coincida con esas coordenadas. Apunte el giro dentado utilizando las coordenadas: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm. Bajar la aguja a derecha por encima del cráneo para visualizar donde el agujero debe ser perforado. </li><li> Levante ligeramente la jeringa, tome el taladro y coloque la bi taladrot justo encima de la sitio de perforación de destino a aproximadamente un ángulo de 45 ° con el cráneo. Comienza la perforación, y mantener la perforación hasta que el cráneo da paso. Cuando el cráneo da paso, una caída en la resistencia puede ser detectado. Tenga cuidado de no perforar en el cerebro, a fin de evitar daños cortical. </li><li> Tome una punta de algodón estéril, y limpie toda la sangre del agujero. </li><li> Baje la jeringa para que la punta se encuentra justo en la superficie del cerebro (no el cráneo). Ajuste el D / V de coordenadas (profundidad) a 0. Bajo la jeringa a la profundidad deseada, sobre la base de las coordenadas atlas del cerebro. Para alcanzar el giro dentado, ajuste D / V a -1,79 mm. </li><li> Iniciar la inyección a una velocidad de 0,2 l / min. Ver para asegurar que la jeringa no se deslice más baja que la profundidad deseada. Si esto ocurre, elevar suavemente la jeringa hasta la profundidad deseada de nuevo. </li><li> Una vez finalizada la inyección, espere unos 2 minutos para asegurar que cualquier virus residual se haya absorbido. Levante lentamente la jeringa y utilizar una punta de algodón para eliminar cualquier liquid del sitio de inyección. </li><li> Repita para el otro hemisferio. </li></ol> 2.5) La sutura <ol><li> Retire la sutura y aguja estériles de su embalaje y agarre la aguja utilizando los porta-agujas. Cara el borde puntiagudo de la aguja alejada de soporte de la aguja. Mantenga las pinzas de gama contundente en la mano no dominante, y lo utilizan para sujetar la piel en el ratón. Comience con la mano dominante. </li><li> Empuje suavemente la sutura a través de la piel y usar los fórceps-extremos romos para agarrar la piel en el otro lado de la incisión. Tire del material de sutura a través hasta aproximadamente 0,75 pulgadas permanece. </li><li> Suelte la aguja, y utilizar las pinzas de gama contundente para envolver la sutura alrededor del soporte de la aguja una vez, entonces, tomar la sutura restante 0,75 pulgadas con el soporte de la aguja, y tirar de la sutura a través de, por lo que el soporte de la aguja y la aguja terminar en el lado de la cabeza opuesta a la que estaban en un principio. Esto debería formar un nudo. </li><li> Repita este pasotres veces más, alternando el lado de la cabeza el soporte de la aguja termina en cada momento. </li><li> Cortar la sutura y repita los pasos 2.5.1-2.5.3 hasta que se cierra la incisión. </li></ol> 2.6) Cuidados después de la operación <ol><li> Retire con cuidado las barras de oreja de ratón, y retire la mandíbula de la pinza anterior. </li><li> Mantenga el puntero del ratón sobre el cojín eléctrico hasta que se despierta y se mueve alrededor de su propio. Monitorear el ratón a diario, y mantener los ojos a los síntomas de dolor, como no arreglarse, comer o beber. Dé analgésico adicional cuando se considere necesario. </li></ol> 3. Prueba de campo abierto 3.1) Configurar <ol><li> Obtener una plaza vacía, arena de plástico con dimensiones de 50 cm x 50 cm, con 50 cm altos muros (pero puede ser un poco más grande). Limpiar la arena con 70% de alcohol etílico antes del comienzo del experimento. Asegúrese de que el alcohol etílico se haya secado completamente antes de colocar un ratón en la arena. </li><li> Coloque la arena en lapiso, y tratar de garantizar la iluminación se ajusta para minimizar las sombras y reflejos. </li><li> Si utiliza software de seguimiento, coloque la cámara directamente sobre la cabeza del campo abierto, aproximadamente 1,5 pies por encima del campo abierto (lo suficientemente lejos para plena abarcan toda la arena, pero lo suficientemente cerca para tener una visión clara del ratón). </li><li> Establecer una zona en el centro de la caja (aproximadamente una superficie de 30 cm x 30 cm). 16 Para establecer una zona, haga clic en la pestaña de la zona 1 en el panel lateral. <ol><li> Seleccione un esquema forma en el panel superior, y delinear el perímetro de la zona centro. Seleccione añadir zona y haga clic en el interior de la zona centro. Usando las instrucciones del programa, el nombre de la zona (esto se conoce como &quot;centro&quot; para este procedimiento). Si la prueba de comportamiento se anotó a mano, asegúrese de que la parte inferior del campo se divide en 10 cm x 10 cm cuadrados, marcado con cinta. </li></ol></li><li> Configure el software para que los ajustes son correctos, y el ratón es fácilmente visible en la pantalla. Lograr esto mediante el ajuste de la configuración de detección de la máquina para ser compatible con la arena de pruebas (iluminación) y color ratón. NOTA: Cuando los ajustes son correctos, el sistema debe realizar un seguimiento sólo el ratón, y no cualquier sombra o la orina / materia fecal. La configuración de software específicos dependen de la iluminación de la arena, y el color del ratón. </li></ol> 3.2) aclimatación y de ensayo <ol><li> Mueva los ratones experimentales en el comportamiento sala 1 hora antes de la prueba con el fin de aclimatarse a su entorno. Deja los ratones en su jaula para la aclimatación. </li><li> Encienda la cámara para grabar la tarea conductual y colocar el puntero del ratón hacia la parte frontal medio de la arena para que el ratón se enfrenta a la pared. </li><li> Ajuste el temporizador de 5 minutos, y alejarse de la arena. Si es posible, salir de la habitación para no influir accidentalmente el ratón. </li><li> Una vez 5 minutos son, retire el ratón y colocarlos en su jaula. </li><li> Utilice 70% de alcohol etílico para limpiar a fondo de todo el campo antes de proceder a la siguiente ratón. Asegúrese de que el alcohol etílico se haya secado completamente. </li></ol> 3.3) Puntaje <ol><li> Considere el ratón como estar en el centro del campo, cuando las cuatro patas están dentro del medio 30 cm x 30 cm. </li><li> Cuantificar la cantidad de tiempo que el ratón pasa en el centro. Por otra parte, determinar esta vez utilizando software de seguimiento (como Noldus ethovison). <ol><li> Para ello, vaya a la ficha de análisis, y haga clic en &quot;movimiento&quot; en los perfiles de análisis. Eliminar las categorías establecidas en la actualidad y, a continuación, seleccione &quot;en la zona&quot; en la ficha ubicación. Seleccione la zona centro. A continuación, seleccione &quot;Salida de análisis&quot; (bajo la etiqueta de resultados) para ver los resultados. Una tabla con el tiempo pasó inmóvil durante debería aparecer cada ensayo. </li></ol></li><li> De lo contrario, la puntuación de la OFT a mano. El campo abierto debe tener 25 plazas 10 cm x 10 cm esbozados en la parte inferior de la opecampo n (como se indica en el paso 3.1.3). Cuantificar la cantidad de tiempo que el ratón pasa en el centro, además de el número de entradas en el centro de la arena. 16 NOTA: El centro de 30 cm x 30 cm área es considerada el centro del campo abierto. Un ratón se considera que habita la región centro si las cuatro patas se encuentran dentro del área de 30 x 30 cm. </li></ol> 4. Forzada prueba de natación NOTA: Permita un mínimo de cinco días entre las tareas de comportamiento. 4.1) Configurar <ol><li> Obtener un 2 L claro cubo, y se llenan de 22 ° C el agua. Coloque el cubo sobre una mesa, y tratar de garantizar la iluminación se ajusta para minimizar las sombras y reflejos. </li><li> Si utiliza software de seguimiento, coloque la cámara directamente sobre la cabeza de la cuchara. </li><li> Configure el software de manera que el ratón es fácilmente visible en la pantalla. </li></ol> 4.2) aclimatación y de ensayo <ol><li> Mueva ratones experimentales en el ro conductualom 1 hora antes de la prueba se adapte al entorno. Deja los ratones en su jaula para la aclimatación. </li><li> Encienda la cámara para grabar la tarea conductual. Con cuidado, coloque el ratón en el centro del cubo de agua. Asegúrese de no dejar caer el ratón. Baje lentamente el ratón, por lo que sus patas delanteras toquen el agua primero. Tenga cuidado para evitar que la cabeza de sumergir. </li><li> Ajuste el temporizador durante 6 minutos, y alejarse de la zona de comportamiento. </li><li> Una vez 6 min están arriba, quitar el ratón desde el cubo, y limpie el exceso de agua antes de colocar el ratón de nuevo en su jaula. </li></ol> 4.3) Puntaje <ol><li> Si utiliza software de seguimiento, establecer ciento inmovilidad al 11%, según lo sugerido por Noldus (este debe ser el ajuste predeterminado), para cuantificar el tiempo flotando frente a la natación. </li><li> Para cuantificar utilizando el sistema de seguimiento, vaya a la ficha de análisis, y haga clic en movimiento bajo perfiles de análisis. Eliminar las categorías establecidas en la actualidad, a continuación, seleccione el estado de movilidad, enel panel lateral izquierdo (en el comportamiento individual). Establecer la inmovilidad a 11%. </li><li> Seleccione la visualización de pista, en la pestaña Resultados. Seleccione la salida de análisis (en la ficha resultados) para ver los resultados. Una tabla con el tiempo pasó inmóvil durante debería aparecer cada ensayo. </li><li> Si la puntuación parte, medir el tiempo que el ratón pasa la natación o la escalada, y la cantidad de tiempo que el ratón pasa inmóvil. Además, medir la latencia a la primera inmóvil tiempo. Consulte la Figura 2 en la sección Resultados. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Inyecciones estereotáxicas exitosas se basan en tres factores: mantener el ratón vivo, estableciendo el punto cero correcto para las coordenadas (punta de la aguja en la intersección de bregma y la línea interaural) y ajuste de la profundidad adecuada para el punto cero (punta de la aguja apenas tocando el exterior del tejido cerebral). La viabilidad de los ratones es importante. Supervivencia cirugía puede ser ayudado por asegurarse de que el ratón es anestesiado correctamente y recibe analgésica adecuada. El dolor es ...

El ratón ha sido ampliamente utilizado en la neurobiología, porque es fácil de manipular genéticamente. Técnicas knockout de genes permiten a los investigadores para investigar cómo cada factor genético da forma a los comportamientos del ratón. Por otra parte, el sistema cre-loxP proporciona una valiosa herramienta para tejidos y tipo de células knockout de genes específicos en ratones, lo que permite a los investigadores estudiar la función de genes en diferentes tejidos. 1 Sin embargo, en la práctica, los patrones de expresión de los promotores cre son difíciles de controlar , y hasta ahora muchos conductores cre establecidos no han logrado específica de la región de expresión. 2,3 Alternativamente, inyección estereotáctica es un método que se dirige a regiones específicas del cerebro del ratón adulto. Mediante la inyección de virus manipulados genéticamente que expresan ADNc o shRNA, específica de la región de modulación de la expresión génica se puede lograr. Aunque el tamaño del cerebro de cada ratón varía, la localización de regiones específicas del cerebro se puede determinar usando coor estereotácticanates ajustar desde puntos de referencia en el cráneo del cerebro del ratón. Los puntos de referencia más utilizados son bregma, lambda, y la línea interaural. Usando coordenadas obtenidas de un atlas del cerebro, 4 la ubicación exacta de cada área del cerebro puede ser identificado por la antero-posterior (A / P), medial-lateral (M / L), y ventral-dorsal (D / V) de los ejes bregma / intersección línea interaural. Normalmente los virus se inyecta en el cerebro de ratones etiquetados, ya sea con la proteína fluorescente de color rojo o verde (RFP o GFP), por lo que las inyecciones pueden ser confirmados por microscopía fluorescente. Evaluaciones de comportamiento de los ratones son especialmente necesarias para la investigación básica de los trastornos psiquiátricos. Los síntomas de los trastornos psiquiátricos en pacientes típicamente involucran comportamientos anormales. Algunos de estos comportamientos humanos son evolutivamente conservados y pueden ser imitado directamente observado en el ratón. Por ejemplo, la depresión puede ser modelado en el ratón mediante la medición de la desesperación conductual. Las personas con depresión oftes sentir como si nada lo hacen jamás ayudar, un síntoma que eventualmente puede conducir al suicidio. En los roedores, esto puede ser modelado utilizando la prueba forzada Swim (FST), que mide la cantidad de tiempo que un ratón nadando contra flotando en un charco de agua (vista como renunciar). Este paradigma se valida mediante el rescate del fenotipo con antidepresivos. 7,8,9 Los ratones que han recibido antidepresivos pasará significativamente menos inmóvil tiempo en comparación con los controles no tratados. Otra prueba de comportamiento, la prueba de campo abierto (OFT) está diseñado para evaluar la locomoción en ratones, y, además, puede ser utilizado para analizar el fenotipo de ansiedad en ratones. 5,6 Esta prueba se basa en la premisa de que los ratones se sienten más seguros cuando están cerca a la pared en un campo abierto novela. Ratones de tipo salvaje finalmente explorar la novela medio ambiente, ya que son animales curiosos. Sin embargo, gastar menos tiempo en el centro del campo indica la ansiedad en el ratón, como el ratón no será capaz de superar la initial miedo provocado por un nuevo entorno. La ansiedad del ratón, tal como se cuantifica por la cantidad de tiempo gastado en el centro de un campo abierto, se puede comparar a la ansiedad clínica en humanos, que está presente en muchos trastornos psiquiátricos. La combinación de inyecciones estereotáxicas con paradigmas de comportamiento es una nueva manera de alterar la expresión de un gen específico en un área del cerebro específica. El efecto de la expresión génica modulada en los comportamientos del ratón se puede determinar. En contraste con knockout de todo el cerebro, este método es particularmente útil, ya que sólo se dirige a áreas específicas del cerebro. Además, las inyecciones estereotáxicas se realizan típicamente en el adulto tipo salvaje del ratón, por lo tanto, la expresión del gen endógeno se ha mantenido a lo largo de las etapas de desarrollo. Este método evitará el efecto confundir si se requiere el gen para la supervivencia durante la etapa embrionaria o postnatal de desarrollo. Una limitación importante es que los ratones experimentales necesitan ir through una cirugía invasiva, en la que los cráneos de ratones tienen que abrirse. Por otra parte, el grado de modulación gen se determina por el título y la eficiencia del virus. El virus necesita para ser inyectada en la región correcta usando coordenadas estereotácticas, que requiere instrumentos especiales. Verificación del sitio de inyección correcta sólo se puede completar post mortem. Este método ha sido utilizado previamente para probar la implicación de un gen específico en diversas enfermedades neurológicas. Por ejemplo, viral RNAi mediada por la orientación del gen Th (que permite la dopamina a ser sintetizado) se inyectó en la sustancia negra compacta, y se llevó a cabo el análisis del comportamiento locomotor. 10 Otro estudio utilizó inyección estereotáctica de un DISC1 silenciamiento lentivirus para evaluar el comportamiento del ratón en relación a la esquizofrenia. Derribo de DISC1 llevó a un aumento de la locomoción en respuesta a la novedad (paralelismos síntomas positivos en la esquizofrenia), y una mayor inmovilidad en elFST. 11 De manera similar, un estudio adicional encontró que 5-HT 1B sobreexpresión condujo a un aumento de comportamiento exploratorio en el OFT, consistente con un fenotipo anti-ansiedad usando este método. 12 inyecciones estereotácticos pueden entregar virus para inducir recombinación cre en ratones cre-loxP . Este método se utiliza para eliminar selectivamente el receptor Y2 en la amígdala y el núcleo lecho de la estría terminal. Tras el análisis del comportamiento, estos ratones se encontraron a un fenotipo anti-depresivo cuando el gen fue suprimido en la amígdala central, pero sin fenotipo cuando el gen fue suprimido en la amígdala basolateral o la cama núcleo de la estría terminal. 13 Por lo tanto, esta técnica proporciona una herramienta única para estudiar el efecto genético sobre los comportamientos de los animales.

<table><tbody><tr><td>Aparato estereotáctico art. 51725</td><td>Stoelting co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Bomba estereotáxica por excelencia&nbsp;</td><td>Stoelting co.</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de inyección, 65 RN</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>PEI&nbsp;</td><td>Policiencias, Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Herramientas quirúrgicas finas</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de punta roma</td><td>Herramientas quirúrgicas finas</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas&nbsp;</td><td>Herramientas quirúrgicas finas</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ram Products Inc</td><td>Caja de control de microtorque, pieza de mano Tech2000</td><td>con pedal</td></tr><tr><td>Esterilizador de cuentas de vidrio</td><td>Inotech&nbsp;</td><td>IS-400</td><td></td></tr><tr><td>Suturas reabsorbibles&nbsp;</td><td>Unify</td><td>M-K518r19</td><td>Absorbible, corte inverso</td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Gaymar</td><td>T-pump TP-500 PN11184-000</td><td></td></tr><tr><td>Lágrimas artificiales</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa desechable</td><td>BD Jeringa</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de tela</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>& nbsp;</td><td>Ansell</td><td>Senseitouch #7823</td><td></td></tr><tr><td>Avertin u otro anestésico</td><td>ver cita de la receta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofeno u otro analgésico</td><td>ver veternario&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de seguimiento</td><td>Noldus</td><td>Ethovision XT</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de seguimiento</td><td>Noldus</td><td>Media Recorder</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicando estereotáctica técnica de inyección para el estudio de los efectos genéticos sobre comportamientos animales

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Inyección estereotáctica es una técnica útil para entregar los lentivirus de alto título a áreas del cerebro específicas en ratones. Los lentivirus pueden o bien sobreexpresan o la expresión de genes caída en una región relativamente centrado sin daño significativo al tejido cerebral. Después de la recuperación, el ratón inyectado puede ser probado en diversas tareas de comportamiento tales como la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST). El OFT está diseñado para evaluar la locomoción y el fenotipo de ansiedad en ratones mediante la medición de la cantidad de tiempo que un ratón pasa en el centro de un campo abierto novela. Un ratón más ansiosos pasará un tiempo significativamente menor en el centro del campo novela comparación con los controles. El FST evalúa el fenotipo anti-depresivo mediante la cuantificación de la cantidad de tiempo que los ratones pasan inmóvil cuando se coloca en un cubo de agua. Un ratón con un fenotipo anti-depresivo pasará significativamente menos inmóvil tiempo en comparación con los animales control. El objetivo de este protocolo es usar el sterinyección eotactic de un lentivirus, en relación con las pruebas de comportamiento para evaluar cómo los factores genéticos modular comportamientos animales.

<html> Inyección estereotáctica exacto se basa principalmente en el establecimiento de las coordenadas correctas. La punta de la aguja usada para inyectar el virus debe establecerse directamente en la intersección de la bregma y la línea interaural (Figura 1). Es útil usar un microscopio estereoscópico para determinar si la aguja se coloca correctamente. Al mirar a través del microscopio, la aguja debe colocarse de modo que si se inyecta el virus, sería aterrizar directamente en la intersección de la bre...

Inyección estereotáctica de lentivirus que expresan los ADNc o shRNAs pueden modular la expresión génica en áreas específicas del cerebro de los ratones. A continuación, presentamos un protocolo para combinar inyecciones estereotáxica con las tareas de comportamiento, como la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST).

Aplicando estereotáctica Técnica de Inyección para el Estudio de los efectos genéticos sobre Comportamientos animales

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar cómo la modulación de la expresión de un gen en una zona diana afecta el comportamiento animal. Esto se logra primero creando un lentivirus para modular la expresión del gen objetivo. El segundo paso consiste en utilizar una inyección estereotáxica para inyectar el lentivirus en un área cerebral específica de un roedor ER.Los comportamientos posteriores, como la ansiedad y la depresión, pueden medirse cuantitativamente mediante paradigmas conductuales establecidos. El paso final consiste en realizar histología para confirmar el sitio correcto de inyección. En última instancia, la inyección estereotáxica combinada con la evaluación conductual puede mostrar cómo un gen específico en una zona diana puede afectar los comportamientos del ratón.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que los científicos pueden modificar la expresión de un solo gen en una pequeña región específica y luego evaluar los cambios conductuales en ratones. Para comenzar este procedimiento, coloque un ratón anestesiado en el aparato estereotáctico, enganche los dientes frontales en la pinza anterior y asegure la mandíbula. A cont

applying-stereotactic-injection-technique-to-study-genetic-effects-on

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Fuente: Porlan, E., et al. Modificación genética estable y eficiente de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de efectos autónomos y no autónomos de células madre neurales. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la modificación genética estable de células madre neurales (NSC) en la zona ventricular-subventricular (V-SVZ) mediante la inyección estereotáxica de un gen terapéutico portador de virus en un modelo de ratón. El virus ingresa a las NSC, se somete a transcripción inversa,...

Inyección estereotáxica de virus para la modificación genética estable en un modelo de ratón

Fuente: Fricano-Kugler, C. J., et al. Diseño, envasado y entrega de retro y lentivirus CRISPR de alto título mediante inyección estereotáxica. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la inyección viral estereotáxica para una edición precisa de genes neuronales en el cerebro del ratón. El protocolo garantiza la administración precisa del virus a la circunvolución dentada, lo que permite el etiquetado fluorescente y la eliminación de genes mediada por CRISPR para estudiar los circuitos...

Inyección viral estereotáxica para la edición de genes neuronales dirigidos en el cerebro del ratón

En este artículo se describe cómo microinject vectores virales en el cerebro del ratón y luego probar en un paradigma de preferencia un lugar acondicionado que incluye una fase de adquisición, extinción y reintegro.

La microinyección estereotáxica de vectores virales que expresan Cre recombinasa para estudiar el papel de los genes diana de cocaína acondicionado Place Preferencia

Aquí describimos un procedimiento basado en el uso de partículas lentivirales para la modificación genética a largo plazo de células madre neurales y/o sus células ependimarias adyacentes en el nicho neurogénico ventricular-subventricular adulto que permite el análisis por separado de los efectos autónomos y no autónomos, dependientes del nicho, sobre las células madre neurales.

Estable y eficiente modificación genética de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de neural de células madre Autónoma y los efectos no autónomos

En este artículo se describe cómo inyectar vectores virales en la corteza frontal del ratón para probar los ensayos de comportamiento que requieren la formación heteromérica GPCR.

HSV mediada por la expresión transgénica de constructos quiméricos para estudiar la función del comportamiento de los GPCR heterómeros en ratones

Se describe un protocolo de cirugía estereotáctica con un dispositivo casero hecho de cabeza fija de reactivos microinjecting en el cuerpo estriado del cerebro de ratón neonatal. Esta técnica permite la manipulación genética en las células neuronales de regiones específicas del cerebro de ratón neonatal.

Cirugía estereotáctica para manipulación genética en las células estriatales de cerebro de ratón Neonatal

Este protocolo describe un conjunto de métodos para identificar la conectividad funcional específica de tipo celular de entradas de largo alcance de regiones cerebrales distantes utilizando estimulaciones optogenéticas en rebanadas cerebrales ex vivo.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

El papel de los genes recientemente descubiertos asociados a la enfermedad en la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos sigue siendo oscuro. Una técnica bilateral modificada de electroporación de útero permite la transferencia de genes en grandes poblaciones de neuronas y el examen de los efectos causales de los cambios de expresión génica en el comportamiento social.

Un gasoducto que utiliza la electroporación bilateral en Utero para interrogar influencias genéticas en el comportamiento de los roedores

El presente protocolo describe una estrategia práctica para acelerar la etapa de verificación de las coordenadas de inyección estereotáxica antes de realizar el rastreo viral utilizando tintes y secciones congeladas.

Validación preliminar de las coordenadas de inyección estereotáxica mediante criosección

Los microARNs tienen funciones importantes en la estructura y función del cerebro. Aquí se describe un método para hacer cumplir miRNA hipocampo sobreexpresión mediante inyección estereotáxica de un lentivirus que expresan los genes miARN ingeniería. Este enfoque puede servir como una manera relativamente rápida para evaluar...

Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento

Aprende a realizar inyecciones estereotácticas de lentivirus en cerebro de roedores para estudiar efectos genéticos sobre comportamientos de ansiedad y depresión mediante pruebas estandarizadas.

Aplicando estereotáctica Técnica de Inyección para el Estudio de los efectos genéticos sobre Comportamientos animales

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