Utilizando el Electrorretinograma para evaluar la función en el Roedor Retina y los efectos protectores de distancia Limb Preacondicionamiento Isquémico

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la función visual en ratas con lesión por luz normal, lesión por luz con precondicionamiento isquémico remoto y ratas normales mediante el uso del ERG, demostrando así los efectos protectores de la isquemia en la extremidad remota sobre la retina. Esto se logra primero adaptando a oscuridad a las ratas durante 12 horas. El segundo paso consiste en registrar el ERG basal adaptado a oscuridad utilizando estímulos de luz LED y un amplificador digital.

A continuación, someta a las ratas a un estrés retiniano exponiéndolas a una luz intensa y continua. El paso final consiste en comparar los registros de ERG de las ratas con daño lumínico y las previamente sometidas a isquemia distal de las extremidades, y medir las respuestas de los fotorreceptores observadas en la onda A y las respuestas de la retina interna observadas en la onda B. En última instancia, el ERG en oscuridad adaptada se utiliza para evaluar la función visual escotópica.

Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la neuroprotección basada en isquemia remota. También puede aplicarse a otras formas de lesión retiniana y pruebas farmacológicas de enfermedades, así como al cribado de animales con defectos visuales. Para comenzar este procedimiento, adapte la rata a la oscuridad durante 12 horas, luego anestésiela mediante la inyección de una mezcla de ketamina y xilacina.

Una vez que el animal esté inconsciente, verifique la profundidad de la anestesia pellizcando ligeramente su pata para asegurarse de que la respuesta refleja esté ausente. A continuación, aplique una gota de atropina y una gota de propano metano en su córnea. Corte un hilo negro de 10 centímetros de largo.

Luego, haga un lazo con el hilo y deslice el lazo sobre el ecuador del ojo, ajustándolo ligeramente para extraer ligeramente el globo ocular y mantener la córnea libre del párpado. Posteriormente, aplique gotas oftálmicas de carmer a las córneas. Coloque la rata sobre el lecho absorbente encima de la plataforma calentada, con la cabeza colocada en la abertura del ganzfeld.

Luego, inserte la sonda de temperatura interna en el recto para asegurar que la temperatura corporal se mantenga a 37 grados Celsius, y sujete la sonda de temperatura en su lugar mediante cinta adhesiva que fije su cable a la cola de la rata. A continuación, inserte el electrodo de referencia subcutáneamente en la extremidad trasera. Coloque el electrodo negativo firmemente en la boca para evitar que el electrodo se salga de la boca.

Sujete el cable de conexión a una superficie estable. Luego, coloque el electrodo positivo sobre el centro de la córnea y asegúrese de que el electrodo toque suavemente la córnea utilizando un micromanipulador. Una vez que los electrodos estén en su lugar, cubra el conjunto del orificio, incluyendo el ganzfeld y al animal, con un material opaco para mantener la adaptación oscura.

En el software de adquisición, establezca dos kilohercios como frecuencia de muestreo, con cinco milisegundos para el muestreo previo a la recolección y un tiempo de recolección de 100 a 1000 milisegundos. Luego, configure los filtros de paso de banda en uno a 1000 hercios y asegúrese de que el muestreo se active durante un período de 100 milisegundos tras un destello.

Ahora, verifique la línea base de la grabación. Debe estar libre de ruido extraño, pero mostrar el ruido del amplificador y la oscilación respiratoria. Luego, realice un destello de prueba.

Esta es una forma de onda típica de ERG en respuesta al destello de prueba. Cuando finalice, permita que el animal se readapte a la oscuridad durante 10 minutos. Luego, verifique nuevamente la línea base para obtener una señal estable.

Posteriormente, comience la grabación. Al final de la sesión de grabación, verifique la estabilidad de la temperatura corporal del animal. Retire los electrodos y luego reaplique el polímero carmer sobre las córneas. Después, permita que el animal se recupere sobre una almohadilla calefactora hasta que esté completamente móvil y activo antes de devolverlo al alojamiento de animales.

Esta figura muestra la medición de la onda a y la onda B a partir de un ERG adaptado a la oscuridad. El trazo mostrado aquí se registró desde la córnea de un ojo adaptado a la oscuridad, en respuesta a un destello brillante de luz dado en el momento indicado como T cero. La amplitud de la onda a se mide desde la línea de base hasta el primer valle.

La amplitud de la onda B se mide desde el valle de la onda A hasta el pico positivo siguiente. La latencia se mide desde el artefacto del estímulo hasta el punto de interés en el trazado, como el valle de la onda A. La señal de ERG bruta dominante aumenta con el incremento del estímulo luminoso.

Una onda se vuelve evidente a aproximadamente 0,4 logaritmos de candelas escotópicas por segundo por metro cuadrado, y el paradigma del destello doble se ha utilizado para separar la señal mixta del ERG en respuestas de conos y bastones. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de 30 minutos.