Name: Análisis Electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprende a realizar análisis electroretinográfico en larvas de Danio rerio para evaluar la función visual in vivo. Este método permite investigar la función de los conos en la retina vertebrada de manera reproducible.

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Agradecemos a los miembros de las instalaciones de acuicultura de pez cebra de UNC por el mantenimiento del pez cebra. También nos gustaría agradecer a Diagnosys, LLC por su ayuda con la configuración del aparato ERG. Agradecimientos adicionales a la Dra. Portia McCoy y al laboratorio del Dr. Ben Philpot por su ayuda con los métodos electrofisiológicos. También queremos agradecer a Lizzy Griffiths por su ilustración de una larva de pez cebra. Este trabajo fue apoyado por los premios F32 EY022279 (a J.D.C) y R21 EY019758 (a E.R.W.) de los Institutos Nacionales de Salud.

El mantenimiento de los animales y los protocolos experimentales fueron aprobados por los comités de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, y cumplen con todos los requisitos de la Oficina de NIH de Laboratorio Bienestar Animal y la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International. Se emplearon Para obtener larvas para el análisis ERG, publicado protocolos para la cría de peces cebra estándar y mantenimiento 18: NOTA. Las larvas se obtiene a través de la reproducción natural y alojado bajo un 14 h luz / 10 h oscuridad ciclo. Este protocolo ha sido optimizado para las larvas a los 5-7 días después de la fertilización (DPF), pero lo ideal podría ser realizado en peces de más edad con pequeñas modificaciones en el procedimiento. En este caso, utilice la cepa TL de larvas de pez cebra de tipo salvaje a 5 dpf. 1. Micropipetas Producción <ol><li> Tire varias micropipetas utilizando 1,5 x 0,86 mm (diámetro exterior de diámetro interior) capilares de vidrio de borosilicato pulidas al fuego confilamento (temperatura de fusión, 821 ° C) y un P-97 Flaming / Castaño Micropipeta Puller equipado con filamento de calor caja. Utilice el programa para la configuración de micropipetas descritos en la Tabla 1. </li><li> Compruebe cada micropipeta con un microscopio con un gobernante retícula apropiada para asegurar que los consejos están a 10-15 m de diámetro y tiene una abertura de la punta suave (es decir, sin bordes dentados). </li><li> Guarde cuidadosamente micropipetas para prevenir el daño de la punta y la exposición al polvo. Las opciones de almacenamiento incluyen placas de Petri con cinta laboratorio, cajas de espuma forrada, o contenedores de almacenamiento micropipeta disponibles en el mercado. Nota: Otros extractores de micropipeta de vidrio y los capilares se pueden utilizar siempre y cuando el diámetro correcto de la micropipeta y se consigue una punta de alta calidad. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Presión </td><td> Calor </td><td> Halar </td><td> Velocidad </td&gt; <td> Tiempo </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Programa para la producción de micropipetas utilizando un / marrón micropipeta Puller P-97 Flaming equipado con un filamento de calor cuadro Micropipetas se hacen usando 1,5 x 1,0 mm 2 (diámetro externo por el diámetro interior) capilares de vidrio de borosilicato pulidas al fuego con filamento. (temperatura de fusión, 821 ° C). 2. Preparación Buffer <ol><li> Use filtrada, tampón de Ringer oxigenada goldfish 19 en el capilar microelectrodo y para saturar la esponja de alcohol de polivinilo (PVA) sobre el que las larvas se colocan para los experimentos. Como alternativa, utilice el E3<html> medios embrión o solución salina equilibrada de Hank. </li><li> Prepare la solución 10x goldfish de Ringer como se describe en la Tabla 2. Ajustar a pH 7,8, y esterilizar usando un filtro de 0,22 micras y almacenar la 10x a 4 ° C. </li><li> Crear una solución de trabajo en el día del experimento diluyendo solución del 10x de Ringer a 1x con agua destilada desionizada. Filtra el uso de un sistema de filtro de 0,22 micras. De compuestos oxigenados por burbujeo con 95% de O2 / 5% de CO 2 de gas durante 10 minutos. Cap herméticamente después para asegurar que la solución permanece oxigenada. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1,25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> glucosa </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; Cuadro 2: Preparación de la solución 10x goldfish de Ringer. 3. Plataforma Electrorretinograma <ol><li> Realizar experimentos ERG en una mesa de anti-vibración dentro de una jaula de Faraday para mejorar la relación señal a ruido. Adjunte una plataforma de acero de encargo a la mesa antivibraciones usando tuercas hexagonales. Coloque una plataforma de plástico movible con un polímero de uretano inferior amortiguador viscoelástico sobre la mesa bajo la fuente de luz. </li><li> Coloque la cámara con un soporte imantado, dirigido hacia abajo en la plataforma móvil de plástico. Coloque el micromanipulador (que celebrará el microelectrodo grabación) con un segundo soporte imantado a la derecha de la plataforma de plástico movible. Asegúrese de que la cámara y el micromanipulador no se verá afectado por el movimiento de otros equipos y que no bloqueen la iluminación de la fuente de luz. </li><li> Conecte la cámara a un monitor de vídeo y posicionarlo para ver el ojo de lalarva para colocar el electrodo en la posición correcta. </li><li> Asegúrese de que la configuración correcta conexión a tierra con cable de cobre. Para comprobar el ruido, colocar el electrodo de referencia y la punta de la microelectrodo grabación en una placa de Petri de 35 mm llena con solución de Ringer. Compruebe los niveles de ruido eléctrico de la instalación con un osciloscopio o una característica incorporada del aparato ERG. Los niveles de ruido deben ser no más de ± 10 mV del valor inicial. </li></ol> 4. Preparación de la esponja <ol><li> Corte un pequeño rectángulo de esponja PVA seco que se ajuste perfectamente en un plato de Petri de 35 mm. El espesor de la esponja no debe ser mayor que la profundidad del plato. Use un cuchillo con una hoja de afeitar limpia para cortar. </li><li> Hacer un recorte adicional en la esponja para acomodar el electrodo de referencia (ya sea un corte superficial a lo largo en la parte inferior de la esponja o una mariposa cortado verticalmente a través de uno de los extremos más pequeños). </li><li> Use un marcador resistente químicamentepara marcar un pequeño punto en la esponja (donde se colocará la larva) que puede ser utilizado para el posicionamiento de la cámara. </li><li> Sumerja la esponja PVA en solución de Ringer hasta saturación. Retire y seque rápidamente sobre una toalla de papel 2-3 veces. Coloque la esponja en un recipiente limpio 35 mm placa de Petri. </li><li> Coloque la placa de Petri que contiene la esponja en la plataforma de plástico tal que la marca puede ser visualizada por la cámara. </li></ol> 5. Preparación del electrodo NOTA: La configuración de pez cebra se compone de un electrodo de referencia en contacto con una solución saturada de esponja de PVA de Ringer y un electrodo de registro en contacto con la córnea. El electrodo de referencia se compone de un pellet de Ag / AgCl. El electrodo de registro es una micropipeta de vidrio tirado lleno de solución de Ringer y sostenido por un soporte de microelectrodos que contiene un alambre de Ag. <ol><li> Cloruro de los electrodos sumergiéndolos en 9.6% de hipoclorito de sodio (lejía) durante 5 minutos (el micr grabaciónalambre oelectrode) o 15 min (el electrodo de referencia). Deje secar al aire en un Kimwipe durante 5 min. <ol><li> Dependiendo del estilo de corte hecho en el paso 4.2, colocar la pastilla de Ag / AgCl del electrodo de referencia en (para el corte de mariposa vertical) o bajo (para el corte superficial longitudinal en la parte inferior) de la esponja. Conecte el cable del electrodo de referencia al sistema de grabación. </li><li> Alternativamente, si la configuración de ERG tiene limitaciones de espacio o no son particularmente fuertes artefactos fotovoltaicas desde el electrodo de Ag / AgCl, conectar el electrodo de referencia a la esponja a través de un puente salino de agar para mover el electrodo fuera de la trayectoria de la luz. </li></ol></li><li> Adjuntar ~ 40 cm de tubo de tamaño apropiado a un 5 ml no Luer de la jeringa de bloqueo. Llene la jeringa con solución de Ringer. Titulares de microelectrodos que poseen puertos de presión envían típicamente con adaptadores para acomodar tubos con diámetros interiores de 1/16 &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;o 5/32&quot;. </li><li> Llene un 1 ml Luer no jeringa con bloqueoSolución de Ringer y, con un Micro-fil, llenar cuidadosamente el titular de microelectrodos. Evitar la formación de burbujas. </li><li> Coloque la jeringa de 5 ml al puerto de presión del titular de microelectrodos con tubo y lo utilizan para garantizar que el titular de microelectrodos está lleno de solución de Ringer. Uso de la Micro-fil y 1 ml jeringa llena con solución de Ringer, llenar el vaso micropipeta de la punta y asegúrese de que no hay burbujas. </li><li> Coloque la micropipeta de vidrio al titular de microelectrodos, teniendo cuidado de mantener la recta de alambre electrodo. Una vez asegurado, utilice la jeringa de 5 ml para forzar cuidadosamente la solución de Ringer a través del microelectrodo hasta que una pequeña cantidad de solución es visible en la punta. Aplicación ocasional de la presión a la jeringa (cuando no se aplica a la córnea) evitará la formación de burbujas de aire, así como oclusiones debidas a la acumulación de polvo o sal, en la punta de la micropipeta. <ol><li> Si la solución sale como una corriente, sustituya el gmicropipeta muchacha, como la abertura de la punta es demasiado grande o está dañado. </li></ol></li><li> Con cuidado, coloque el microelectrodo de grabación en el micromanipulador y conecte el cable al sistema de grabación. </li></ol> 6. Análisis Electrorretinograma NOTA: Debido al predominio de cono de la retina de larvas, resultados ERG de alta calidad se pueden obtener cuando los preparativos para la grabación se realizan bajo los bajos niveles de luz blanca indirecta (&lt;1 lux) o con períodos cortos (&lt;1 min) de mayor intensidad ( ≤250 lux) Luz de trabajo. Un breve período de adaptación a la oscuridad todavía se requiere antes de la grabación (consulte el paso 6.7). Sin embargo, los experimentos pueden llevarse a cabo bajo la luz roja o infrarroja tenue con una cámara sensible al infrarrojo. Todos los experimentos se realizaron en esterilizada por filtración (0,22 micras) del agua del sistema de la Línea de UNC pez cebra acuicultura pero los medios de embrión de alternativas pueden ser utilizados. <ol><li> Cuadrados de toallas de papel cortadas que miden aproximadamente 12 cm. </li><li> Si la medición aislada potencial receptor masa cono, incubar 3-5 larvas en el agua del sistema con 500 mM (±) -2-4-fosfonobutírico Amino ácido (APB) durante 5 min. NOTA: Mientras APB es una mezcla racémica de la activa (L) y (R) formas inactivas de AP4, es tan eficaz como la L-AP4 y es menos costoso. </li><li> Anestesie 3-5 larvas en agua del sistema con 0,02% (w / v) tricaína hasta que no responde, aproximadamente 1-2 min. </li><li> Utilice una pipeta y una pipeta Pasteur bomba para transferir cuidadosamente larvas individuales en las casillas de toallas de papel en un estereoscopio de disección utilizando iluminación mínima (≤250 lux para &lt;1 min). Compruebe la posición de cada larva y elegir un candidato que es dorsal hacia arriba con un ojo no ocluida. <ol><li> Para grabaciones prolongadas (&gt; 30 min), mantener la larva húmeda acristalamiento cuerpo hasta, pero sin incluir la cabeza con 3% de metilcelulosa usando un cepillo de pelo de camello bien. </li></ol></li><li> Con unas pinzas, transfiera el squar toalla de papele con la larva de la esponja PVA húmedo. <ol><li> Para grabaciones prolongados (&gt; 30 min), aplicar una corriente continua de agua saturada de 100% de O 2 de gas sobre la larva por burbujeo del gas a través de una piedra de aire en un matraz de brazo lateral que contiene agua destilada. Coloque el tubo que sale de la boca lateral frasco que transporta el oxígeno humidificado cerca de la cabeza de la larva. NOTA: El paso 6.4.1 y 6.5.1 paso para prolongar la vida de los peces 16. </li></ol></li><li> Bajo iluminación mínima, utilice el micromanipulador y cámara para posicionar la punta de microelectrodos en el punto medio entre la nasal y extremos caudales de los ojos y presione suavemente sobre el límite dorsal de la córnea. NOTA: El mal posicionamiento de la punta del electrodo a las áreas distales de la medida de la córnea puede dar lugar a formas de onda ERG de polaridad invertida. </li><li> Permita larva a oscuro-adaptarse durante 5-10 minutos. </li><li> Respuestas de flash protocolo de ensayo a la luz proporcionada por una fuente de luz LED o estimulador óptica utilizando el avaiequipos de estimulación y registro lable. Ajustar parámetros de protocolo, como la intensidad del flash, flash de longitud, color flash, intensidad de fondo y ajustes de color y filtros para adaptarse a la experiencia. </li><li> Cuando haya terminado con el experimento, la eutanasia larvas según las directrices de la AVMA / IACUC. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este protocolo se detalla un procedimiento sencillo para grabaciones ERG de larvas de pez cebra. Este procedimiento permite un ensayo rápido y completo de function.There visual son varios pasos críticos de todo el procedimiento que se debe tener en cuenta. Las larvas de pez cebra debe estar sano antes del experimento para prevenir la muerte durante los tratamientos farmacológicos potenciales y asegurar medios de vida prolongada durante las grabaciones ERG. Además, es importante que las larvas utilizado en los experim...

El electrorretinograma (ERG) es un método electrofisiológico no invasiva que se ha utilizado ampliamente en la clínica para determinar la función de la retina en los seres humanos. La actividad eléctrica en respuesta a un estímulo de luz se mide mediante la colocación de electrodos de registro en la superficie externa de la córnea. Las características del paradigma estímulo y la respuesta de la forma de onda definen las neuronas de la retina que contribuyen a la respuesta. Este método ha sido adaptado para su uso con un número de modelos animales, incluyendo ratones y pez cebra. La respuesta típica de vertebrados ERG tiene cuatro componentes principales: la onda a, que es un potencial córnea negativa derivada de la actividad de las células fotorreceptoras; la onda b, un potencial córnea positivo derivado de la EN células bipolares; la onda d, un potencial de córnea positiva interpretarse como la actividad de las células bipolares OFF; y la onda c, que se produce varios segundos después de la onda b y refleja la actividad en las células de Müller y la retinal epitelio pigmentario de 1-4. Referencias adicionales para la comprensión de la historia y los principios de análisis de ERG en humanos y modelos animales son el libro de texto en línea, Webvision, de la Universidad de Utah y textos tales como los Principios y Práctica de Electrofisiología Clínica de la Visión 4, 5. Danio rerio (pez cebra) ha sido favorecido como un modelo para el desarrollo de vertebrados, debido a su rápida maduración y la transparencia, que permite el análisis morfológico no invasiva de órganos y sistemas, ensayos de comportamiento y de ambos adelante y atrás pantallas genéticos (para una revisión, ver Fadool y Dowling 6). Larvas de pez cebra son altamente susceptibles de manipulación genética y farmacológica, que, cuando junto con su alta fecundidad, los hacen un excelente modelo animal para los análisis biológicos de alto rendimiento. La mayor proporción de conos para varillas en larvas de pez cebra - aproximadamente 1: 1 en comparación con ratones (~ 3% de conos) - hacen particularmente útiles para el estudio de la función de cono 7-9. En la retina de los vertebrados, los conos se desarrollan antes de varillas 10. Curiosamente, los conos de pez cebra son operativos ya en 4 dpf, permitiendo selectiva análisis electrofisiológico de conos en esa etapa 6, 11,12. En contraste, las respuestas de ERG en barras aparecen entre 11 y 21 dpf 13. Por lo tanto, las larvas de pez cebra a 4-7 servir dpf funcionalmente como una retina todo-cono. Sin embargo, la respuesta fotópica nativo ERG de 4-7 larvas dpf está dominada por la onda b. La aplicación de agentes farmacológicos, tales como L - (+) - 2-amino-4-fosfono-butírico (L-AP4), un agonista para el glutamato metabotrópicos (mGluR6) receptor expresado por la sobre las células bipolares, bloquea eficazmente la generación de la onda b y revela el potencial de masa aislado cono receptor, (la &quot;onda a&quot;) 14-17. Aquí se describe un simple y reliablmétodo para el análisis e ERG usando equipo ERG comercial, diseñado para su uso con ratones que han sido adaptados para su uso con las larvas de pez cebra. Este sistema puede ser utilizado en larvas de pez cebra de diferentes antecedentes genéticos, así como los tratados con agentes farmacológicos, para ayudar a los investigadores en la identificación de las vías de señalización que contribuyen a la sensibilidad visual y adaptación a la luz 16. Los procedimientos experimentales descritos en este protocolo guiarán los investigadores en el uso del análisis de ERG para responder a una variedad de cuestiones biológicas relativas a la visión, y demostrar la construcción de una configuración flexible de ERG.

<table><tbody><tr><td>Jaula de Faraday</td><td>80/20 Inc</td> personalizado <td></td><td>"Juego de erectores industriales" de aluminio diseñado a medida para la estructura de la jaula</td></tr><tr><td>Esponja PVA</td><td>Amazon</td><td></td><td>B000ZOWG1C Proporciona una plataforma suave y húmeda para la colocación de larvas de pez cebra</td></tr><tr><td>Sistemas de filtro estéril de 150 ml</td><td>Corning</td><td>431154</td><td>Soluciones de filtrado para evitar que los pequeños articulos bloqueen las micropipetas</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contacto</td><td>Sistema modular de electrofisiología capaz de generar estímulos visuales para cualquier estimulador y registro digital y análisis de respuestas mediante software propietario, más información en http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contacto</td><td>Estimulador de luz con fuentes de luz LED RGB y xenón para Ganzfeld ERG, más información en</td></tr><tr><td>http://www.diagnosysllc.com Micromanipulador</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Sujetar y posicionar el microelectrodo de grabación</td></tr><tr><td>Soporte de anillo magnético</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Sujetar y posicionar la cámara y el electrodo de referencia</td></tr><tr><td>Extensiones de cable</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>Cables de paso de repuesto hembra a macho de 1,5 mm para conectar electrodos</td></tr><tr><td>Pin macho a hembra Adaptador SAFELEAD</td><td>Grass Technologies</td><td>DF-215/10 Conexión de</td><td>clavijas de 2 mm a clavijas de cabecera de 1,5</td></tr><tr><td>Marco de pantalla de ventana (metal) y ranura</td><td>Lowes o Home Depot</td><td>varios</td><td>Para fijar una malla de cobre a la estructura de la jaula de Faraday</td></tr><tr><td>Filtros Steriflip 50 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Soluciones de filtrado para evitar que los pequeños articulos bloqueen las micropipetas</td></tr><tr><td>Adaptador BNC</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Conexión de la cámara al cable BNC</td></tr><tr><td>Cable BNC</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Conexión de la cámara al adaptador de vídeo</td></tr><tr>Lente de la<td>cámara</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Visualización de la posición del microelectrodo de grabación en la córnea de la larva</td></tr><tr><td>Acoplador de cámara</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Visualización de la posición del microelectrodo de grabación en la córnea de la larva</td></tr><tr><td>Luna BNC a VGA + HDMI Converter</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>Adaptador BNC a VGA que permite proyectar la imagen de la cámara en el monitor de la computadora</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6 agonista, bloquea la onda b que permite el análisis del potencial del receptor de masa del cono aislado</td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Vidrio de borosilicato pulido al fuego (temperatura de medición = 821 y grados; C) con filamento y dimensiones de 1,5 mm x 0,86 mm (diámetro exterior por diámetro interior)&nbsp;</td></tr><tr><td>P97 Tirador Flaming/Brown</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>Para tirar de micropipetas de vidrio</td></tr><tr><td>Lámina de sorbothane</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Polímero de uretano viscoelástico sintético, colocado debajo de los soportes de aislamiento pasivo y la plataforma ERG para absorber los golpes y evitar deslizamientos, se puede cortar a medida</td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>Plataforma de aislamiento de vibraciones para estimulador ERG y espécimen</td></tr> <tr><td>de pez cebraSoportes de aislamiento pasivo</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Proporciona aislamiento de vibraciones a la placa de pruebas</td></tr><tr><td>Malla de cobre</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>Para alinear la jaula de Faraday</td></tr><tr><td>Bomba de pipeta</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Se utiliza con pipetas Pasteur para transferir cuidadosamente las larvas de pez cebra</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>Se utiliza con la bomba de pipeta para transferir cuidadosamente las larvas de pez cebra</td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>Visualización de la posición del microelectrodo de registro en la córnea larvaria</td></tr><tr><td>Tricaína (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>Anestésico de grado farmacéutico,Micro-fil</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>WPI MF28G-5</td><td>Llenado Soporte de microelectrodo y vidrio de microelectrodo</td></tr><tr><td>Soporte de microelectrodo</td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Sostiene un microelectrodo de vidrio, se conecta al equipo ERG</td></tr><tr><td>Electrodo de referencia</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Rompa con cuidado el último centímetro de la carcasa para drenar el electrolito y exponer el electrodo de pellets de Ag/AgCl sinterizado</td></tr><tr><td>Electrodo de referencia (alternativa)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>Alternativa a DRIREF-5SH. Electrodo de Ag/AgCl que debe estar cableado/soldado al cable</td></tr><tr><td>de conexión Cable silencioso para soporte de microelectrodos</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Conexión del soporte de microelectrodo de grabación al adaptador/cabecera</td></tr></tbody></table>

análisis electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

El electrorretinograma (ERG) es un método electrofisiológico no invasivo para determinar la función de la retina. A través de la colocación de un electrodo en la superficie de la córnea, la actividad eléctrica generada en respuesta a la luz puede ser medido y utilizado para evaluar la actividad de las células de la retina in vivo. Este manuscrito describe el uso de la ERG para medir la función visual en el pez cebra. El pez cebra se han utilizado mucho como modelo para el desarrollo de vertebrados debido a la facilidad de la supresión de genes por los oligonucleótidos de morfolino y la manipulación farmacológica. En 5-10 dpf, sólo los conos son funcionales en la retina larval. Por lo tanto, el pez cebra, a diferencia de otros animales, es un poderoso sistema modelo para el estudio de la función visual cono in vivo. Este protocolo utiliza anestesia estándar, micromanipulación y protocolos estereomicroscopía que son comunes en los laboratorios que realizan investigación de pez cebra. Los métodos descritos hacen uso de la ecuación de electrofisiología estándarCONEXIONES y una cámara de poca luz para guiar la colocación de la grabación de microelectrodos sobre la córnea larval. Por último, demostrar cómo un comercialmente disponible ERG estimulador / grabador diseñado originalmente para su uso con ratones se puede adaptar fácilmente para su uso con el pez cebra. ERG de larvas de pez cebra ofrece un excelente método de ensayo de la función visual de cono en los animales que han sido modificados por la inyección de oligonucleótido morfolino, así como las técnicas de ingeniería del genoma más recientes, como los dedos de zinc nucleasas (ZFNs), Transcripción Activador-Como Efector Nucleasas (Talens), y agrupados Regularmente Interspaced cortos Palindromic Repeticiones (CRISPR) / Cas9, todos los cuales han aumentado en gran medida la eficiencia y la eficacia de la orientación de genes en el pez cebra. Además, aprovechamos la capacidad de los agentes farmacológicos para penetrar en larvas de pez cebra para evaluar los componentes moleculares que contribuyen a la fotorrespuesta. Este protocolo describe una configuración que puede ser modificado y utilizado por los investigadorescon varios objetivos experimentales.

Típicamente, los ERG se registran a partir de larvas de pez cebra a 5 dpf, ya que un número de estudios han publicado grabaciones ERG en esta etapa 9, 16,20. Respuestas de larvas se midieron en condiciones adaptadas a la oscuridad sin iluminación de fondo utilizando un 20 mseg estímulo de la luz LED blanco. Hemos utilizado un sistema ERG disponible comercialmente que consiste en un estimulador Ganzfeld luz y equipo de controlador / grabadora. El estimulador utiliza una modulación de ancho de sistema para cont...

Presentamos un método para el análisis electrorretinográfico (ERG) de larvas de pez cebra utilizando técnicas de micromanipulación y electrorretinografía. Este es un método simple y directo para analizar la función visual de las larvas de pez cebra in vivo.

Análisis Electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

El objetivo general de este procedimiento es ilustrar los pasos necesarios para realizar un análisis electrográfico en peces cebra larvales. Esto se logra primero generando micropipetas de vidrio con la forma y tamaño adecuados. El segundo paso consiste en configurar cuidadosamente el equipo esencial para el experimento, como los electrodos de referencia y registro.A continuación, se anestesia el pez cebra larval y se orienta adecuadamente con respecto al equipo de estimulación y registro. El paso final consiste en colocar correctamente el microelectrodo de vidrio sobre la córnea del pez cebra larval. En última instancia, pez cebra larval.El análisis de ERG es útil para investigar la función visual de los conos en la retina de vertebrados con retina totalmente cónica in vivo. Este método es muy útil para responder preguntas clave en el campo de la ciencia de la visión, como la identificación de las vías de señalización que contribuyen a la sensibilidad visual y a la adaptación a la luz en los conos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el posicionamiento correcto del microelectrodo de registro sobre la muestra es difícil de aprender debido al pequeño tamaño del ojo de pez cebra larvario.Para comenzar este procedimiento, prepare varias micropipetas utilizando capilares de vidrio borosilicatado con filamento, fundidos con llama. Revise cada micropipeta bajo un microscopio con una regla graduada apropiada para asegurar que el diámetro de la punta sea de 10 a 15 micrómetros y tenga una apariencia uniforme. Prepare una solución de trabajo el día del experimento diluyendo una solución de Ringer 10x hasta obtener una concentración 1x.Con filtro de agua destilada desionizada, esterilice la solución para asegurar que las partículas no obstruyan la punta de la micropipeta. Luego, oxide con 95 % de oxígeno y 5 % de dióxido de carbono durante 10 minutos. Tape la solución firmemente después para garantizar que permanezca oxigenada.Ahora coloque una plataforma plástica móvil con una base de polímero de uretano viscoelástico absorbente de impactos sobre la mesa antivibratoria debajo de la fuente de luz. A continuación, coloque la cámara con un soporte magnetizado y apúntela hacia la plataforma plástica móvil. Luego, coloque el micromanipulador del microelectrodo de registro sobre un segundo soporte magnetizado.Asegúrese de que la cámara y el micromanipulador no se vean afectados por el movimiento de otros equipos, y no obstruyan la iluminación procedente de la fuente de luz. Posteriormente, conecte la cámara a un monitor de video y colóquela frente a la plataforma. Verifique que el montaje esté correctamente conectado a tierra mediante un cable de cobre.En este paso, corte un pequeño rectángulo de esponja de PVA seca que encaje firmemente en una placa de Petri de 35 milímetros con una cuchilla limpia. Haga un corte adicional en la esponja para acomodar el electrodo de referencia. Luego, utilice un rotulador resistente a productos químicos para marcar un punto pequeño en la esponja en el lugar donde se colocará la larva.A continuación, sumerja la esponja de PVA en solución de Ringer hasta que esté saturada. Sáquela y séquela rápidamente sobre una toalla de papel dos o tres veces antes de colocarla en una placa de Petri limpia de 35 milímetros. Posteriormente, coloque la placa de Petri que contiene la esponja sobre una plataforma de plástico de manera que la marca pueda ser visualizada por la cámara.A continuación, clorure los electrodos sumergiéndolos en una solución de cloruro de sodio al 6-9 %. Luego, séquelos al aire sobre una toallita Kim durante cinco minutos. Coloque el pellet de plata, cloruro de plata del electrodo de referencia dentro o debajo de la esponja, según el tipo de corte realizado, y conecte el cable del electrodo de referencia al sistema de registro.A continuación, conecte aproximadamente 40 centímetros de tubo a una jeringa de cinco mililitros sin bloqueo de bayoneta y llene la jeringa con solución de Ringer. Posteriormente, llene una jeringa de un mililitro sin bloqueo de bayoneta con solución de Ringer. Utilizando un microfill, llene cuidadosamente el portaelectrodo micro y evite la formación de burbujas.Luego, conecte la jeringa de cinco mililitros al puerto de presión del soporte del microelectrodo mediante un tubo, utilizando el microfill y una jeringa de un mililitro llena de solución de Ringer. Llene la micropipeta de vidrio desde la punta y asegúrese de que no haya burbujas presentes. A continuación, conecte la micropipeta de vidrio al soporte del microelectrodo y tenga cuidado de mantener el alambre del electrodo recto.Una vez asegurado, utilice la jeringa de cinco mililitros para forzar cuidadosamente la solución de Ringer a través del microelectrodo hasta que se observe una pequeña cantidad de solución en la punta. Ahora coloque con cuidado el microelectrodo de registro en el micromanipulador y conecte el cable al sistema de registro para verificar el ruido del sistema. Coloque el electrodo de referencia y la punta del microelectrodo de registro en una placa de Petri de 35 milímetros llena de solución de Ringer.Verifique los niveles de ruido eléctrico del montaje con un osciloscopio o con una función integrada del aparato de ERG. Los niveles de ruido no deben superar más o menos 10 microvoltios respecto a la línea de base. En este procedimiento, corte varios cuadrados de papel absorbente de un centímetro cuadrado, anestesie de tres a cinco larvas en una placa de Petri de 35 milímetros añadiendo trica hasta una concentración final de 0,02 % y espere de uno a dos minutos.A continuación, transfiera cuidadosamente una larva individual sobre un cuadrado de toalla de papel bajo un estereoscopio de disección con iluminación mínima. Verifique la posición de la larva eligiendo un ejemplar con el lado dorsal hacia arriba y el ojo ocluido para sesiones de grabación que duren más de 30 minutos. Mantenga la larva húmeda aplicando una capa de metilcelulosa al 3 % sobre el cuerpo con un pincel fino de pelo de camello.Luego, transfiera el cuadrado de toalla de papel con la larva a la esponja de PVA húmeda. A continuación, aplique un flujo continuo de agua saturada con oxígeno al 100 % sobre las larvas haciendo burbujear el gas a través de una piedra difusora en un matraz de brazo lateral que contiene agua destilada. Coloque el oxígeno humedecido procedente del brazo lateral del matraz cerca de la cabeza de la larva mediante un tubo, bajo iluminación mínima.Utilice el micromanipulador y la cámara para colocar la punta del microelectrodo en el punto medio entre los extremos nasal y caudal del ojo y presione suavemente sobre el límite dorsal de la córnea. Permita que las larvas se adapten a la oscuridad durante cinco a diez minutos. Luego registre las respuestas al destello de prueba a la luz proporcionada por una fuente de luz LED o un estimulador óptico.Esta figura muestra un registro típico de ERG en un pez cebra larval de cinco días post-fecundación. Los peces adaptados a la oscuridad fueron expuestos a luz blanca LED durante 20 milisegundos, con intensidades que variaron entre uno y 5.000 canula por metro cuadrado, siendo el inicio del estímulo luminoso en cero segundos. La onda a, correspondiente al potencial negativo, es difícil de distinguir, mientras que la onda b, correspondiente al potencial positivo, es el pico dominante de la forma de onda.Este recuadro muestra las amplitudes promedio de la respuesta de la onda B ajustadas mediante la ecuación de NACA. Esta figura muestra un registro típico de ERG en un pez cebra larvario de cinco días post-fecundación (DPF), adaptado a la oscuridad y tratado con PB. Los peces se expusieron a luz blanca LED durante 20 milisegundos con intensidades que variaron entre 1 y 5.000 candelas por metro cuadrado, y el potencial receptor masivo del cono aislado es el elemento dominante de la forma de onda. Este recuadro muestra las amplitudes promedio de respuesta de un pez cebra larvario tratado con PB que fueron ajustadas utilizando la ecuación de NACA.Esta figura muestra un registro típico de ERG en un pez cebra larvario tratado con cinco D-P-F-A-P-B. Utilizando un paradigma de doble destello. Los peces adaptados a la oscuridad se exponen a destellos sucesivos de luz blanca de 20 milisegundos.Los destellos LED tienen una intensidad de 1000 canula por metro cuadrado, y el ISI entre los destellos es de dos segundos. Aquí se indica el inicio de cada estímulo luminoso. Esta figura muestra la relación entre la respuesta máxima del potencial receptor de masa del cono aislado al segundo estímulo y la del estímulo inicial con un ISI creciente, lo que indica la recuperación progresiva de la sensibilidad de los fotorreceptores.Si bien al intentar este procedimiento es importante recordar que la calidad de las grabaciones depende de la integridad de la conexión corneal del electrodo y del estado de salud de las larvas. El desarrollo de esta técnica ha mejorado considerablemente la capacidad de los investigadores en ciencias de la visión para explorar la adaptación y recuperación de los conos en la retina de vertebrados in vivo.

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Hemos desarrollado la respuesta de Visual-Motor para cuantificar la potencia del motor de larvas de pez cebra en respuesta a incrementos de la luz y disminuye. También se examinaron el pez cebra mutantes de visión, incluyendo la no respuesta optocinético (NRC) de los mutantes, lo que se pensaba que eran completamente ciegos cuando se probó por otro ensayo de la visión, el reflejo de optocinético.

Un ensayo de conducta para medir la capacidad de respuesta de pez cebra a cambios en la intensidad de luz

Optocinético respuesta ha sido ampliamente utilizada para evaluar las funciones visuales de larvas de pez cebra. Sin embargo, el protocolo estándar para las larvas de peces aún no es fácilmente aplicable en los...

Usando la respuesta de optocinético para estudiar la función visual del pez cebra

El VisioTracker es un sistema automatizado para el análisis cuantitativo de los resultados visuales de peces adultos de larvas y pequeños basados ​​en el registro de los movimientos oculares. Cuenta con un control total sobre propiedades de los estímulos visuales y análisis en tiempo real, permitiendo la investigación de alto rendimiento en áreas como el desarrollo del sistema visual y la función, la farmacología, los estudios neuronales del circuito y la integración sensoriomotora.

VisioTracker, un enfoque innovador para el análisis automatizado oculomotor

Este video describe el ensayo de respuesta fotomotora de larvas de pez cebra y pececillo cabeza gorda utilizando un software de seguimiento automatizado. El protocolo mide la respuesta conductual de las larvas de peces después de un cambio repentino en las condiciones de iluminación.

Ensayo de respuesta fotomotora: un método para medir la respuesta conductual de las larvas de pez cebra a un cambio repentino en las condiciones de iluminación

Este video describe el ensayo de respuesta optocinética en pez cebra. El video mide los movimientos oculares reflejos en función del estímulo visual en movimiento y determina la agudeza visual en el pez cebra.

Ensayo de respuesta optocinética: un método para medir la agudeza visual en el pez cebra

Este video demuestra el método para estudiar la detección visual de presas en larvas de pez cebra transgénicas utilizando imágenes fluorescentes basadas en indicadores de calcio con sus neuronas expresando complejos indicadores de calcio fluorescentes.

Análisis de la actividad neuronal evocada por presas en una larva de pez cebra transgénica

El pez cebra ha sido una herramienta valiosa para muchas áreas de investigación. Aquí se demuestra un método para provocar una respuesta visual y calcular una agudeza visual funcional en el pez cebra adultos.

La respuesta optocinética como una medida cuantitativa de la agudeza visual en el pez cebra

Presentamos un método eficiente para marcar retrógradamente las células ganglionares de la retina (RGCs) en peces cebra adultos.

Etiquetado retrógrada de células ganglionares retinianas en adultos de pez cebra con tintes fluorescentes

Aquí, presentamos un protocolo para el desarrollo y la caracterización de un modelo de epilepsia de pez cebra resultante de la inhibición transitoria del gen DEPDC5.

Análisis conductual y fisiológico en un modelo de epilepsia de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo que simplifica la medición de respuestas de luz electroretinograma evocados de pez cebra larval. Un electrodo de punta de esponja novela en forma de cono puede ayudar a hacer el estudio de desarrollo visual en el pez cebra larvas usando el electrorretinograma ERG más fácil de lograr con resultados confiables y de menor costo.

Grabación de electroretinograma en larvas de pez cebra con electrodo de punta de esponja en forma de un cono de novela

El artículo explica cómo extirpar quirúrgicamente los ojos de las larvas vivas de pez cebra como el primer paso hacia la investigación de cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico. Además, el artículo proporciona información sobre la anestesia larvaria, la fijación y la disección cerebral, seguida de inmunohistoquímica e imágenes confocales.

Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual

Aprende a realizar análisis electroretinográfico en larvas de Danio rerio para evaluar la función visual in vivo. Este método permite investigar la función de los conos en la retina vertebrada de manera reproducible.

Análisis Electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas

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