Automatizado Gel Tamaño Selección para mejorar la calidad de las bibliotecas de secuenciación de próxima generación Preparado a partir de muestras de agua del medio ambiente

Este video demuestra el uso de un instrumento automatizado de selección por tamaño en gel para obtener lecturas mejoradas en plataformas de secuenciación de nueva generación. Primero, se recolectan muestras de agua ambiental y se pasan a través de una serie de filtros para separar sistemáticamente partículas de tamaño eucariota, bacteriano y viral. Las bacterias retenidas se concentran adicionalmente mediante centrifugación.

Luego se extrae el ADN bacteriano. El ADN extraído se utiliza para preparar bibliotecas en las cuales se incorporan adaptadores e índices al ADN fragmentado. El ADN se amplifica entonces mediante PCR, y las muestras se cargan en la estación de electroforesis.

Los fragmentos de ADN dentro de un rango específico se seleccionan automáticamente. El análisis de los trazos procedentes de la electroforesis capilar basada en chip y los análisis bioinformáticos adicionales demuestran que este método produce cantidades adecuadas de fragmentos de ADN para análisis posteriores, con una agrupación mínima de fragmentos no deseados menores de 200 pares de bases. La principal ventaja de la estación cuadrada de electroforesis automatizada o de las perlas paramagnéticas y otros sistemas comerciales es que permiten un rango de selección más ajustado y estrecho, en el que se pueden procesar hasta 96 muestras en un solo ensayo.

Aunque este método puede proporcionar información sobre comunidades microbianas en muestras de agua dulce, puede aplicarse a otros sistemas como agua de mar, tratamiento de aguas residuales, muestras vegetales, suelo sedimentario o tapetes microbianos, esencialmente cualquier muestra de ADN para la cual deseemos una selección estrecha de tamaños. Tuvimos la idea original de este método cuando observamos fragmentos cortos en las secuencias de la plataforma MySEQ. Probamos varias estrategias de selección de tamaño, incluyendo diferentes tipos de perlas para y relaciones, así como el enfoque manual de selección por gel.

Luego comenzamos a colaborar con Coastal Genomics, una empresa privada de Columbia Británica que ofrece la tecnología Ranger para demostrar el procedimiento. Hoy estarán Michael Chan, técnico de investigación de mi laboratorio, Miguel Yi, investigador posdoctoral de mi laboratorio, y Jared Sloan, ingeniero de Coastal Genomics. En este video, describiremos únicamente la purificación y el análisis del material recuperado en los filtros de 0,2 micrones, principalmente bacterias de vida libre, pero tenga en cuenta que se pueden utilizar enfoques similares para las otras partículas recuperadas de los filtros.

Comience este procedimiento recolectando 40 litros de muestras de agua dulce de varios sitios ambientales en bidones sanitizados de 20 litros. Prefiltre las muestras in situ utilizando un filtro de malla de polipropileno de 105 micrómetros del espectro. Aquí, las muestras se recolectan de cuencas hidrográficas influenciadas por zonas urbanas y agrícolas.

Tras la recolección, coloque las muestras en neveras portátiles y trasládelas de regreso al laboratorio. Almacene las muestras a cuatro grados Celsius. Al día siguiente.

Configure un sistema de filtración que consista en el matraz de recolección de muestras conectado mediante una bomba peristáltica a una cápsula de muestreo enviro check de un micrón. Conecte la cápsula de muestreo a un filtro de disco de 0,2 micrones y este a su vez a un filtro tangencial de flujo de 30 kilodalton mediante una segunda bomba peristáltica. Encienda las bombas peristálticas para hacer pasar las muestras a través de una serie de filtros; las células eucariotas se aislarán al pasar a través de la cápsula de muestreo.

La fracción bacteriana se aislará en el filtro de disco de membrana, y las partículas virales se aislarán en el filtro de flujo tangencial. Retire el filtro de membrana de 0,2 micrómetros o los filtros del sistema de filtración de agua. Luego, doble el filtro por la mitad y colóquelo en un tubo de 50 mililitros.

Con el lado abierto hacia arriba. Añada cinco mililitros de PBS con tween al tubo. Si se utilizó más de un filtro durante la filtración, use un tubo diferente para cada filtro.

Los filtros pueden entonces almacenarse a cuatro grados Celsius o procesarse inmediatamente como sigue. A continuación, utilizando pinzas estériles, retire el filtro de membrana del tubo de 50 mililitros y colóquelo en una placa de Petri con pinzas estériles y tijeras estériles. Corte el filtro en trozos de un centímetro por un centímetro entre muestras.

Desinfecte los instrumentos sumergiéndolos en isopropanol al 70%, limpiándolos con un descontaminante de superficie para ADN y luego enjuagándolos con agua ultrapura tipo uno. Coloque los fragmentos del filtro de vuelta en el mismo tubo de 50 mililitros. Añada 10 mililitros de PBS con tween para llevar el volumen total del tampón a 15 mililitros utilizando pinzas estériles.

Agregue seis bolitas limpias de tungsteno, de tres milímetros de diámetro, a cada tubo de 50 mililitros. Cubra el tubo con paraformo y vortexee vigorosamente durante 20 minutos.

Después de vórtex, reunir todas las suspensiones en un único tubo limpio de 50 mililitros para cada muestra. Centrifugar los tubos a 3.300 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado.

En cinco mililitros de solución de PBS, distribuya las células bacterianas en alícuotas de un mililitro en tubos microcentrífugos de 1,7 mililitros y centrifugue en una microcentrífuga a 10.000 ×g durante 10 minutos. Tras la centrifugación, use una pipeta para eliminar todo el sobrenadante excepto 200 microlitros. Almacene las muestras a menos 80 grados Celsius o continúe con la extracción de ADN bacteriano utilizando un kit comercial de aislamiento de ADN.

Durante la extracción de ADN bacteriano, utilice PBS o agua como control negativo de extracción y e coli como control positivo de extracción. Tras el procedimiento de extracción de ADN, reúna las alícuotas del mismo muestra en un tubo de dos mililitros con tampón tris 10 milimolar. Luego, realice una precipitación nocturna añadiendo una solución compuesta por 10% de acetato de sodio tres molar, dos volúmenes de etanol al 100% y cinco microlitros de acrilamida lineal. Almacene las muestras a 80 grados Celsius negativos.

Al día siguiente, centrifugue las muestras a 17.000 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, lave el precipitado con un mililitro de etanol al 70 % frío con hielo y deje secar al aire el precipitado en una cabina de seguridad biológica durante no más de cinco minutos.

Luego, reuspenda el precipitado de ADN en tris 10 milimolar. Finalmente, determine la cantidad y calidad del ADN realizando un ensayo de cuantificación de ácidos nucleicos fluorescente de alta sensibilidad, seguido de espectrometría de microvolumen. Tras determinar la cantidad de ADN en cada muestra, agregue la cantidad adecuada de agua a cada tubo para llevar la concentración a aproximadamente 0,2 nanogramos por microlitro.

Utilizando un kit comercialmente disponible, prepare una biblioteca de ADN de fragmentos indexados a partir de un nanogramo de ADN bacteriano. Aquí, se aplica un método basado en transposición conocido como mentación para fragmentar simultáneamente e incorporar secuencias adaptadoras al ADN. Luego, se realiza una PCR para amplificar e indexar simultáneamente las muestras de ADN, proporcionando así códigos de barras específicos en cada fragmento y las secuencias necesarias para la formación de cúmulos que pueden ser leídas por la plataforma de secuenciación.

Tras completar la PCR, omita el paso estándar de limpieza posterior a la PCR y agregue 3.5 microlitros de tampón de carga a cada muestra para un volumen total de 28.5 microlitros. Luego transfiera las muestras a una placa de 96 pocillos. Coloque la placa de 96 pocillos en una estación de electroforesis con un cassette de agarosa al 1,5% precolado en la interfaz de usuario del software Ranger.

Especifique un tamaño de selección objetivo de 500 a 800 pares de bases. Ajuste el volumen de extracción a 300 microlitros. Inicie la corrida.

La estación de trabajo de electroforesis cargará automáticamente las muestras en los casetes aros. Luego se aplica un voltaje a los casetes, y se utiliza un sistema de imagen montado en una plataforma móvil para identificar la ubicación del ADN de la muestra en los aros. Durante todo el proceso.

El software Ranger captura imágenes y, mediante estándares internos, estima la posición del objetivo de tamaño seleccionado en cada muestra. Después de que se identifican los objetivos, el software Ranger varía. El voltaje aplicado a cada muestra para sincronizar la llegada de los objetivos a los pozos de extracción del casete.

Finalmente, la estación de electroforesis aspira los objetivos en TBE desde los pozos de extracción y los dispensa en una nueva placa de 96 pocillos para concentrar el material de salida crudo, precipitando el volumen bruto del eluido mediante acetato de sodio y etanol con acrilamida lineal durante la noche a 80 grados Celsius negativos. Centrifugue las muestras nuevamente a 17.000 ×g durante 30 minutos. Después de la centrifugación, deseche los sobrenadantes y proceda a lavar el palé de ADN con un mililitro de etanol al 70 % frío con hielo, centrifugando.

Centrifugar las muestras a 17.000 GS durante 30 minutos, desechar el sobrenadante, secarlas y finalmente resuspender el pellet de ADN en tris CL 10 milimolar. Proceder a normalizar las muestras utilizando perlas de normalización de bibliotecas, que se incluyen en el kit de preparación de bibliotecas de transposición. Finalmente, realizar la secuenciación de ADN utilizando una plataforma de secuenciación de nueva generación para obtener lecturas más informativas en plataformas de secuenciación de nueva generación, mejorando así la calidad de las bibliotecas de secuenciación.

Se tomaron muestras de agua en ocho sitios diferentes de la cuenca hidrográfica y se prepararon bibliotecas de ADN índice a partir de la fracción bacteriana aislada, como se muestra en este electroferograma. Las bibliotecas de ADN generadas a partir de muestras de agua dulce tras la PCR, pero antes de la selección automatizada por tamaño, estaban compuestas por fragmentos que variaban en tamaño desde 50 pares de bases hasta 3000 pares de bases. Tras la selección por tamaño mediante la plataforma automatizada de alto rendimiento, las muestras presentaron un rango estrecho de fragmentos de ADN entre 500 y 800 pares de bases. Por lo tanto, la utilización de esta plataforma automatizada de selección por tamaño en gel permitió obtener rendimientos adecuados y minimizó la agrupación de fragmentos no deseados menores de 200 pares de bases.

La secuenciación de ADN de esta biblioteca en el MiSeq de aluminio generó una densidad de cúmulos de 1198 K por milímetro cuadrado. El porcentaje de cúmulos que pasaron los filtros fue del 84,2 % con un rendimiento estimado de 9,2 gigabytes. Además, 7,4 gigabytes, o el 82,8 % de las lecturas, tuvieron una puntuación de calidad mayor o igual a 30.

Esto significa que aproximadamente el 83 % de la base secuenciada con este protocolo modificado y aplicado a muestras de agua ambiental tuvo una precisión en la llamada de bases de al menos el 99,9 %. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar información más útil a partir de bibliotecas de secuenciación. Al realizar este procedimiento, es importante recordar la fracción microbiana a la que se dirige, la elección de la preparación de la biblioteca, la longitud del fragmento objetivo y las plataformas de secuenciación.