Simplificado Humanos neutrófilos extracelular Trampas (TNE) Aislamiento y manipulación

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar un protocolo simple para aislar neutrófilos, trampas extracelulares o redes de la sangre entera humana utilizando reactivos fácilmente disponibles. Esto se logra aislando primero los neutrófilos de la sangre entera humana, utilizando una técnica de centrifugación diferencial como segundo paso. Los neutrófilos aislados se estimulan con PMA para inducir la formación de redes, también llamada NETosis.

A continuación, se prepara una placa con un aislado de red libre de células y se añaden células cancerosas para demostrar cómo las redes afectan a la adhesión de las células. Los resultados muestran que la adición de una monocapa de red mejora la adhesión de 5 49 células cancerosas y que esta adhesión se reduce cuando se degradan las redes. El uso de DNAS one Demostración visual de este método es fundamental.

Dada la novedad de esta técnica, el manejo de las trampas celulares de neutrófilos xor son redes extremadamente difíciles debido a la fragilidad de estas estructuras. Para comenzar, obtenga 80 mililitros de sangre entera humana fresca en 14 tubos superiores verdes heparinizados como se describe en el protocolo de texto. Abra cada tubo y agregue cinco mililitros de PBS sin calcio y magnesio a cada tubo.

A continuación, agregue 15 mililitros de medio de separación de linfocitos o LSM en cada uno de los cuatro tubos cónicos de 50 mililitros a temperatura ambiente. Luego use una aguja de calibre 18 montada en una jeringa de 60 mililitros para colocar cuidadosamente la sangre diluida en capas sobre el LSM, creando una centrífuga afilada de la interfaz de sangre LSM, centrifugar los tubos a 800 veces G durante 30 minutos a 21 grados Celsius sin romperse para detener la centrífuga, aspire y deseche cuidadosamente las dos capas líquidas superiores y la interfaz entre ellas, dejando solo la capa roja inferior. Este pellet contiene eritrocitos y neutrófilos.

Agregue 20 mililitros de PBS y 20 mililitros de solución de dextrano al 6% a cada tubo. Invierta suavemente cada tubo y déjelos reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los glóbulos rojos se sedimentarán hasta el fondo del tubo.

A continuación, transfiera los sobrenadantes a tubos nuevos y deseche las paletas. Centrifugar los sobrenadantes a 450 veces G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos, y luego desechar el sobrenadante, dejando la bolita rica en neutrófilos. Preparar una solución de lisis con 0,5 mililitros de tampón de lisis en 4,5 mililitros de agua estéril.

Agregue un total de cinco mililitros de la solución de lisado a cada tubo y agrupe todos los gránulos en un matraz. Coloque el matraz en la oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente para cortar los glóbulos rojos restantes. Centrifugar los neutrófilos a 450 veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y lave el pellet con cinco mililitros de PBS sin calcio y magnesio. A continuación, vuelva a centrifugar la muestra a 450 veces G a cuatro grados centígrados y retire el sobrenadante que contiene la solución de lisis restante. Vuelva a suspender el pellet de neutrófilos en 30 mililitros de medio RPMI frío suplementado con suero bovino fetal al 3%, y coloque el tubo en hielo para estimular la formación de trampas o redes extracelulares de neutrófilos.

Agregue 500 nano molares de PMA a 30 litros de suspensión de neutrófilos en una placa de cultivo de tejido plano de 150 milímetros por 25 milímetros. Con una rejilla de 20 milímetros, incube las células durante cuatro horas a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación, aspire suavemente y deseche el medio, teniendo cuidado de no romper la capa de redes y los neutrófilos se adhieren al fondo de la placa.

Luego use una pipeta para lavar el fondo de cada plato con 15 mililitros de PBS frío sin calcio y magnesio, todo el material adherente debe eliminarse del fondo. Recoja la suspensión de lavado en un tubo cónico de 15 mililitros y luego centrifugue a 450 veces G durante 10 minutos. A cuatro grados centígrados, los neutrófilos y las células restantes se desprenderán en el fondo.

Dejando un sobrenadante rico en células libres, a continuación, decanta el sobrenadante en múltiples tubos de 1,5 mililitros y centrifuga a ocho 18.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Para pellet el ADN, deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en PBS de tal manera que la concentración corresponda a dos veces 10 a la séptima neutrófilos por 100 microlitros de PBS. Este stock neto sin células se puede utilizar para experimentos posteriores.

Mida la concentración de ADN de la muestra mediante fotometría espectrométrica. Una concentración adecuada debe oscilar entre 140 y 180 nanogramos por microlitro a 100 microlitros de material neto en cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos e incubar la placa durante la noche a cuatro grados centígrados en la oscuridad para recubrir los pocillos de 12 a 20 horas después, usar un microscopio para verificar la formación de una monocapa uniforme de redes libres de células en el fondo de los pocillos. Una vez que se haya verificado la monocapa, aspire suavemente todo el material no adherente fuera de los pocillos.

Asegurándose de no interrumpir la monocapa en la parte inferior. Este es el aspecto más desafiante de este procedimiento. Para mantener una monocapa de red adecuada, debe manipular la placa con mucho cuidado.

Agregue todos los reactivos y células lentamente en el costado de los pocillos, aspire muy suavemente y evite tocar el fondo del pocillo con una punta de succión. Una vez eliminado el material no adherente, añadir suavemente 100 microlitros de una solución bloqueadora de albúmina sérica bovina al 1% en cada pocillo y dejar actuar durante una hora a temperatura ambiente. No agite ni agite la placa, ya que esto puede alterar la monocapa neta.

A continuación, prepare 5 49 células cancerosas recolectándolas cuando tengan un 70 a 80% de confluentes. Usando técnicas estándar, resuspenda las células en medio a una concentración de dos veces 10 a la cuarta celda por cada 100 microlitros. Tiñir las células añadiendo un microlitro de CFS e por mililitro de medio, y dejarlas a temperatura ambiente durante 10 minutos.

A continuación, centrifuga las células a 450 veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el volumen inicial de medio para mantener una concentración de dos veces 10 a la cuarta células cancerosas por cada 100 microlitros de medio. Tome la placa recubierta de red y aspire suavemente la solución de bloqueo.

Luego agregue 100 microlitros de la suspensión de células cancerosas a cada pocillo y permita que las células se adhieran a la placa durante 90 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono aspire completamente el líquido y agregue 1000 unidades de ADN, uno a algunos pozos durante 10 minutos para degradar las redes en otros pozos. Agregue 100 microlitros de agua estéril por pocillo durante 10 minutos como control del vehículo. A continuación, aspire suavemente el líquido de cada pocillo y lave con 100 microlitros de PBS para eliminar cualquier adherente que no se adhiera.

A 5 49 células aspiran y desechan toda la solución en los pocillos, dejando solo las redes y las células cancerosas adheridas en el fondo. Luego agregue 100 microlitros de una solución de formaldehído al 4% por pocillo para fijar las celdas, transfiera inmediatamente la placa a un microscopio de fluorescencia para leer el ensayo y luego trazar y analizar los resultados. Utilizando el software de análisis de datos.

Los mosquiteros libres de células se utilizaron en ensayos de adhesión estática con 5 49 células cancerosas. La microscopía óptica mostró que las células cancerosas se adhieren fuertemente a la monocapa neta. In vitro.

Esta adherencia disminuyó después de que la monocapa neta fue degradada por ADN, una microscopía de fluorescencia de 5 49 células cancerosas marcadas confirmaron estos resultados. La unión de 5 49 células a la monocapa neta se cuantificó contando el número de células por campo de alta potencia. Como se muestra aquí, no hubo cambios en la adhesión de las células cancerosas a las redes en el control del vehículo.

Sin embargo, hubo una disminución significativa en la adhesión de las células cancerosas a las redes en presencia de ADN uno. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo aislar y manipular las redes de sangre humana entera. Estos aislados netos libres de células se pueden utilizar en una variedad de técnicas, como la inmunofluorescencia, la microscopía confocal, la microscopía electrónica y la transferencia occidental.